Laccase-Mediator System, използваща естествен медиатор като избелващ агент за обезцветяване на меланина, част 1

Резюме: В това проучване е разработена лаказа-медиаторна система (LMS), използваща естествен медиатор като избелващ агент за обезцветяване на меланин. Седем естествени медиатора бяха използвани за заместване на синтетичните медиатори и успешно преодоляване на ниския редокс потенциал на лаказа и ограничения достъп на меланин до активното място на лаказа. Обезцветяващата активност на меланин на лакази от Trametes versicolor (lacT) и Myceliophthora thermophila (lacM) е значително подобрена с помощта на естествени медиатори, включително ацетосирингон, сирингалдехид и ацетованиллон, които показват ниска цитотоксичност. Метокси и кетонните групи на естествените медиатори играят важна роля в обезцветяването на меланина. Специфичните константи на lacT и lacM за обезцветяване на меланин бяха повишени съответно с 247 и 334, когато ацетосирингон беше използван като медиатор. LMS, използващ дантела и ацетосирингон, може също да обезцвети меланина, присъстващ в целулозния хидрогелов филм, който имитира състоянието на кожата. Освен това, LMS може да обезцвети не само синтетични аналози на еумеланин, получени чрез окисление на тирозин, но и естествен меланин, произведен от меланомни клетки.

Според съответните проучвания,цистанчее широко разпространена билка, известна като „чудодейната билка, която удължава живота“. Основният му компонент ецистанозид, който има различни ефекти катоантиоксидант, противовъзпалително, инасърчаване на имунната функция. Механизмът между цистанче иизбелване на кожатасе крие в антиоксидантния ефект на цистанчегликозиди. Меланинв човешката кожа се произвежда от окислението на тирозин, катализирано оттирозиназа, а окислителната реакция изисква участието на кислород, така че свободните от кислород радикали в тялото се превръщат във важен фактор, влияещ върху производството на меланин. Cistanche съдържацистанозид, който е антиоксидант и може да намали генерирането на свободни радикали в тялото, като по този начининхибиране на производството на меланин.

Кликнете върху Rou Cong Rong Предимства за избелване

За повече информация:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Въведение

Лаказите (EC 1.10.3.2, бензендиол: диоксиген оксидоредуктази) са мултимедни протеини, които катализират окисляването на различни фенолни и нефенолни съединения чрез радикално катализиран реакционен механизъм чрез редукция на молекулярен кислород [1,2]. Лаказите са използвани като биокатализатори за процеси на биоразграждане, като биоремедиация на багрила [3,4], фармацевтични продукти [5,6], хербициди [7] и делигнификация [8–10]. Лаказите също са използвани за катализиране на полимеризацията на прекурсори на багрила и органични съединения [11]. По-специално, техните привлекателни свойства, като ниска субстратна специфичност, използването на кислород като краен акцептор на електрони, генерирането на вода като страничен продукт и липсата на търсене (или никакво производство) на пероксиди, ги правят интересни в биотехнологичните и екологични полета [1,11,12].

Четири медни йона в активния център участват в каталитичната активност на лаказа. „Синята“ мед (място T1) окислява субстрата, а триядреният меден клъстер (T2/T3) получава електроните от мястото T1, за да намали молекулния кислород [1,12,13]. По-специално, редокс потенциалът на мястото Т1 Cu се счита за основен фактор при определяне на каталитичната способност на лаказите [14]. Лаказите притежават относително нисък редокс потенциал (0.4–0.8 V) в сравнение с лигнинолитичните пероксидази (над 1 V) като манганова пероксидаза и лигнин пероксидаза. Лаказите не могат директно да окисляват нефенолни субстрати с редокс потенциал над 1,3 V [13,14]. Следователно, за да се преодолеят ограниченията на лаказа, лаказа-медиаторни системи (LMS), използващи нискомолекулни съединения, като 2,20 -азинобис(3- етилбензтиазолин-6-сулфонат) (ABTS), { Предложени са {24}}хидроксибензотриазол (HOBt), виолурова киселина (VLA), N-хидрокси фталимид (HPI), N-хидрокси ацетанилид (NHA) и TEMPO, които действат като редокс медиатори [15–17].

Тези медиатори позволяват окисляването на обемисти съединения чрез различни пътища на окисление. Системата laccase-ABTS окислява субстратите чрез генериране на катионен ABTS радикал чрез механизъм за трансфер на електрони (ET). LMS с HOBt, VLA, HPI или NHA произвеждат нитроксилни радикали чрез механизма за трансфер на водороден атом (HAT) [1,12,17]. Освен това, медиатори като TEMPO и неговите аналози реагират чрез йонни пътища, за да генерират оксоамониеви йони [1,12,18]. Използването на тези медиатори може да окисли широк спектър от съединения в различни приложения, като разграждане на багрила [3,4], разграждане на лекарства [5,6] и разграждане на лигнин [8–10]. Независимо от това, приложенията на синтетичните медиатори в промишлените области са ограничени поради тяхната потенциална токсичност, висока цена и ефект на инактивиране на ензими. Напоследък фенолни молекули, получени от лигнин, като естествени медиатори (напр. сирингалдехид, ацетосирингон, ванилин, ацетованилон, метил ванилат, ферулова киселина, синапинова киселина, р-кумарова киселина и др.) са изследвани за заместване на синтетичните медиатори [1,12] . Предимствата на естествените медиатори са ниската цена и ниската токсичност, тъй като се получават от естествени и възобновяеми източници [19].

Меланинът е група естествени пигменти, произведени чрез меланогенеза чрез окислителната полимеризация на тирозин от меланоцитите. Естественият меланин може да бъде класифициран в пет категории еумеланин, феомеланин, всички меланини, феомеланин и невромеланин [20]. Напоследък са изследвани различни медицински и електрохимични приложения, използващи меланин или прекурсори на меланин [20,21]. Цветът на човешката кожа се определя най-вече от наличието на меланин. В козметичната индустрия директната депигментация на меланин с помощта на ензими е предложена за разработването на агенти за избелване на кожата. Няколко пероксидази са изследвани за обезцветяване на меланина. Woo и др. показват, че синтетичният меланин може да бъде директно обезцветен от лигнин пероксидаза от P. chrysosporium [22]. Групите Keneko и Mohorˇciˇc също съобщават за ензимно обезцветяване на меланина чрез манганова пероксидаза, изолирана от гъби (Sporotrichum pruinose и Phlebia radiata) [23,24]. Ким и др. съобщават, че сурови ензимни смеси, съдържащи манганова пероксидаза, лигнин пероксидаза и лаказа, показват меланинова депигментационна активност [25]. Когато пероксидазите обезцветяват меланина, те изискват водороден прекис (H2O2) като кофактор, който може да раздразни кожата. По този начин, за да се намали използването на H2O2, глюкозооксидазата или лаказа бяха въведени в ензимната комбинирана система [26,27]. Laccases може да обезцвети меланина без използването на водороден прекис. Khammuang и Sarnthima съобщават, че лаказа от Lentinus polycarpous Lév показва активност за обезцветяване на меланин, използвайки ABTS, ванилин и ванилова киселина като медиатори [28].

2. Материали и методи

2.1. Материали

2.2. Обезцветяване на меланин чрез LMS

Наситеният разтвор на меланин (1,4 mg/mL) се приготвя чрез разтваряне на 3 mg синтетичен меланин в 1,3 mL 10 mM NaOH. Разтворът се центрофугира при 8500 rpm за 5 минути за отстраняване на неразтворения меланин и супернатантата се разрежда с 0.1 М лимонена киселина фосфатен буфер (рН 3, 4, 5, 5.5, 6 или 7) и се използва като субстратен разтвор за LMS. Концентрацията на меланин в разтвора на субстрата е 63 µg/mL и е потвърдена спектрофотометрично при 475 nm. 0.8 mL разтвор на меланинов субстрат се смесва с 0.1 mL разтвор на медиатор (0–1 mM) в 1,5 mL епруветка Eppendorf. Реакцията на обезцветяване на меланин се инициира чрез добавяне на 0,1 mL разтвор на лаказа (15,8 µg (0,6 U) lacT или 19,2 µg (1,8 U) lacM) към смес от меланин и медиатора при 25 ◦C в разклащаща се водна баня при 120 rpm . След реакцията реакционната смес се центрофугира и абсорбцията на супернатантата се измерва при 475 nm. Добивът на обезцветяване (проценти) се изчислява с помощта на следното уравнение:

Обезцветяване (проценти) {{0}} (A0 − At)/A0 × 100, (1)

2.3. Кинетично изследване на обезцветяването на меланин чрез LMS

2.4. Цитотоксичност на естествените медиатори

Клетъчната линия B16F10 на меланома (Korea Cell Line Bank, Сеул, Корея) беше използвана за определяне на цитотоксичността на естествените медиатори за LMS. Извършен е анализ на неутрално червено (NR) за измерване на цитотоксичността на медиаторите [29]. NR измерва жизнеспособността на живи клетъчни лизозоми. Меланомни клетки с концентрация от 3 × 104 клетки се разпределят във всяка ямка на 96-плака с ямки. След 24 часа култивиране, клетките се третират с естествени медиатори (1, 2, 5, 10, 22 и 46 тМ). След допълнително култивиране в продължение на 2 дни, клетките бяха третирани с 50 ug/mL NR разтвор, разтворен в DMEM и инкубирани в продължение на 3 часа. След отстраняване на супернатанта чрез изсмукване, NR десорбиращ разтвор (1% ледена оцетна киселина, 49% етанол и 50% дестилирана вода) се използва за цветна екстракция. След процеса на екстракция, промяната в абсорбцията се измерва при 540 nm.

2.5. Подготовка и обезцветяване на меланин/целулозен хидрогел филм

За измерване на обезцветяващата активност на LMS за меланин/целулозен филм, подготвеният хидрогелов филм се нарязва на лист 1 × 2 cm. Хидрогелният филм се потапя в 4 mL 0.1 М фосфатен буфер на лимонена киселина (рН 5.5); впоследствие към буфера бяха добавени 0.5 mL от 1 mM ацетосирингон и 0.5 mL lace разтвор (2.5 U). Реакцията на обезцветяване се провежда във водна баня с разклащане при 120 pm и 25 ◦C в продължение на 3 часа. След реакцията филмът се промива с дестилирана вода и се прикрепя към вътрешната страна на кюветата, за да се измери промяната в спектрите в диапазона от 400–800 nm с помощта на UV/Vis спектрофотометър. Контролните реакции без lacM или медиатори също се провеждат при същите условия. Освобождаването на меланин от филма или промяната на цвета на меланин/целулозния филм не се открива при реакционните условия. Освен това, промяната в цветовите параметри (L *, a * и b * стойности) на меланин/целулозен филм след реакцията на обезцветяване от LMS също беше записана с помощта на колориметър (KONICA MI NOLTA, Токио, Япония). Стойностите ∆L (метрична разлика в светлотата), ∆E (обща цветова разлика), YI (индекс на пожълтяване) и WI (индекс на белота) са получени с помощта на следните уравнения [30–32]:

2.6. Приготвяне на естествен меланин

Естественият меланин е получен от меланомни клетки B16F10. Клетките бяха третирани с алфа-меланоцит-стимулиращ хормон за производство на меланин. След 4 дни инкубация, клетките бяха уловени с помощта на трипсин-EDTA и обработени с ултразвук в продължение на 10 минути. Супернатантата се получава чрез центрофугиране при 8000 rpm в продължение на 10 минути и след това се коригира до рН 1.5 с помощта на 6 М НС1. Разтворът се вари при 100 ◦C в продължение на 4 часа, за да се хидролизират остатъчните протеинови фракции. Разтворът, съдържащ естествен меланин, се промива с ацетон, последван от хлороформ и етанол и след това се промива с дейонизирана вода, за да се елиминират остатъци, като клетки, компоненти на средата и протеинови фракции [33,34]. Всички процеси на измиване бяха извършени повече от два пъти. И накрая, естественият меланин беше получен чрез сушене чрез замразяване и използван като субстрат за LMS.

3. Резултати и дискусия

3.1. Ефектът на медиаторите върху обезцветяването на меланин чрез LMS

Ефектът на различни медиатори върху реакцията на обезцветяване на меланин чрез LMS беше изследван с помощта на две лакази от T. versicolor (lacT) и M. thermophila (lacM) (Фигура 1).Когато lacT се използва без медиатор за обезцветяване на меланин, добивът на обезцветяване е само 1 процент след 5 часа реакция. Когато HOBt се използва като медиатор за lacT, добивът на обезцветяване се повишава леко до 2 процента след 5 часа реакция. Използването на различни синтетични медиатори, като HOBt, ABTS, VLA и TEMPO, в катализираното от лаказа окисление на фенолни или нефенолни съединения значително повишава скоростта на реакцията [10,15]. Когато достъпът на целевите съединения в активното място на лаказа е ограничен от тяхната пространствена пречка, медиаторните радикали, образувани от лаказа, могат ефективно да окисляват целевите съединения чрез механизма за трансфер на електрон или трансфер на водороден атом [12]. HOBt е един от най-често използваните синтетични медиатори в LMS поради високия си редокс потенциал (1,1 V) [6]. HOBt обаче не е добра козметична съставка поради потенциалната си клетъчна токсичност и способността да инактивира лаказа. По този начин избрахме седем естествени медиатора, ацетосирингон, сирингалдехид, р-кумарова киселина, ванилин, ванилова киселина, ванилилов алкохол и ацетованилон за реакцията на обезцветяване на меланин чрез LMS. Интересното е, че всички естествени медиатори действат като по-ефективни медиатори от HOBt за обезцветяване на меланин поради липса. Когато се използват ацетосирингон, сирингалдехид и р-кумарова киселина, добивите на обезцветяване са съответно 28 процента, 22 процента и 18 процента след 5 часа реакция. Тези резултати демонстрират полезността на естествените медиатори за реакцията на обезцветяване на меланин от LMS. Медиаторите в LMS се окисляват до медиаторни радикали от лаказа, а медиаторните радикали индуцират окисляването и обезцветяването на меланина. Когато липсата се използва без медиатор за обезцветяване на меланин по време на достатъчно време за реакция, което може да достигне равновесно състояние, добивът на обезцветяване е 7 процента след 24 часа реакция. Естествените медиатори, с изключение на ваниловата киселина, действат като по-ефективни медиатори от HOBt за обезцветяване на меланин от lacT след 24 часа реакция. Добивът на обезцветяване след 24 h реакция с използване на ванилова киселина като медиатор е по-нисък от този след 5 h реакция. Това може да се дължи на ниската стабилност на окислената радикална форма на ваниловата киселина. Когато се използват ацетосирингон, сирингалдехид и ацетованилон, добивите на обезцветяване са съответно 34 процента, 30 процента и 31 процента след 24-часова реакция. p-кумаровата киселина е по-ефективна за повишаване на началната скорост на реакцията от ацетованилона, докато ацетованилонът предизвиква по-висок добив на обезцветяване при равновесно състояние от p-кумаровата киселина.

Ефектът на медиатора върху реакцията на обезцветяване чрез LMS с използване на lacM също беше много подобен на този, получен от LMS с използване на lacT. Когато дантела се използва без медиатор за обезцветяване на меланин, добивът на обезцветяване е само 2 процента след 5 часа реакция. HOBt като медиатор за lacM не повишава добива на обезцветяване по време на 5-часовата реакция. Всички естествени медиатори, с изключение на р-кумариновата киселина и ванилина, действат като ефективни медиатори на обезцветяването на меланин от lacM. Когато се използват ацетозирингон и сирингалдехид, добивите на обезцветяване са съответно 25 процента и 22 процента след 5 часа реакция. p-кумарова киселина и ванилин бяха използвани като ефективни медиатори за всеки, но те не можаха ефективно да повишат скоростта на обезцветяване в LMS, използвайки дантела. Това може да се дължи на по-ниската субстратна специфичност на lacM за р-кумарова киселина и ванилин. Добивите на обезцветяване след 24 часа реакция на lacM с р-кумарова киселина и ванилин са подобни на тези, получени от lacT. Това показва, че окислените форми на р-кумарова киселина и ванилин могат ефективно да обезцветят меланина, въпреки че скоростта им на окисление от lacM е много по-ниска от тази от lacT. Когато lacM без медиатор се използва за обезцветяване на меланин по време на достатъчно време за реакция, добивът на обезцветяване е 5 процента след 24 часа реакция. Естествените медиатори, с изключение на ваниловата киселина, също действат като по-ефективни медиатори от HOBt за обезцветяване на меланин от lacM след 24 часа реакция. Когато ацетосирингон, сирингалдехид и ацетованилон бяха използвани като медиатори за lacM, добивите на обезцветяване бяха съответно 34 процента, 28 процента и 31 процента след 24 часа реакция. Когато ваниловата киселина се използва като медиатор както за lacT, така и за lacM, тя показва най-нисък добив на обезцветяване. Това може да се дължи на ниската стабилност на окислената радикална форма на ваниловата киселина. Khammuang и Sarnthima съобщават, че ванилин и ванилова киселина могат да се използват като медиатори за обезцветяване на меланин с помощта на лаказа от Lentinus polycarpous [28]. Въпреки това, те показват много по-ниска обезцветяваща активност за меланин, отколкото ацетосирингон, когато се използват като медиатори за лакТ и дантела.

Тези резултати показват, че естествените медиатори са по-ефективни за обезцветяване на меланин от LMS, отколкото HOBt. HOBt се счита за ефективен синтетичен медиатор за лаказа поради неговия висок редокс потенциал и каталитичната роля на N OH групата на HOBt [5]. Ефективността на медиаторите за окисляване на целевите субстрати е силно зависима от способността за образуване на стабилни радикали, както и от пространственото препятствие, причинено от обемисти алкилови заместители, а не от редокс потенциала на медиаторите [19,35]. Ниската стабилност на окисления междинен продукт на HOBt е определена чрез циклична волтаметрия [6]. Следователно, ниският добив на обезцветяване от LMS, използващ HOBt, може да бъде причинен от ниската стабилност на HOBt при реакционните условия на лаказа. Въпреки че редокс потенциалът на сирингалдехида е по-нисък от този на HOBt, сирингалдехидът показва относително по-висока стабилност от HOBt [6].

Както е показано на фигура 2, естествените медиатори, използвани в тази работа, имат различни заместители (напр. хидроксил, метокси, карбоксил, кетон или алдехид) на различни позиции в бензеновия пръстен [12,19]. Медиаторите с две метокси групи (ацетосирингон и сирингалдехид) показват по-високи скорости на обезцветяване от тези с една метокси група. Скоростта на обезцветяване, получена от р-кумарова киселина без метокси група, зависи от вида на лаказа. Р-кумаровата киселина с lacT показва по-висока скорост на обезцветяване от тези с една метокси група, докато р-кумаровата киселина с lacM показва най-ниската скорост на обезцветяване в 5-часовата реакция. Филат и др. също показаха подобни резултати за обезцветяване на флексографски мастила от гъбични лакази с естествени медиатори [36]. Фенолните естествени медиатори (ацетосирингон, метилова спринцовка и сирингалдехид) с два метокси заместителя в пръстена се окисляват от лаказа по-бързо от р-кумарова киселина без метокси група. Това показва, че метокси групите играят по-важна роля като донори на електрони, отколкото двойната връзка на страничната верига на р-кумаровата киселина. Когато се сравняват медиаторите с една метокси група, добивът на обезцветяване се увеличава в следния ред: ацетованилон > ванилин > ванилилов алкохол > ванилова киселина. Ацетованилонът, който има кетонна група, показва по-висока степен на обезцветяване и добив от медиаторите с алдехидни, хидроксилни и карбоксилни групи. Ацетосирингонът с кетонна група също показва по-висока степен на обезцветяване и добив от сирингалдехида с алдехидна група.

В следващите експерименти ацетосирингон, сирингалдехид и ацетованилон, които показват висока способност за обезцветяване на меланина, бяха избрани като медиатори за LMS за обезцветяване на меланин. Ефектът на медиатора върху реакцията на обезцветяване от LMS беше изследван във времето (Фигура S1). Реакцията на обезцветяване, използваща lacT с ацетосирингон, сирингалдехид и ацетованиллон, доведе съответно до 21 процента, 18 процента и 1 процента обезцветяване след 1 час реакция. Реакцията на обезцветяване с използване на lacM с ацетосирингон и сирингалдехид води до 19 процента и 18 процента добиви на обезцветяване след 1 час реакция, съответно. И двете лакази показват подобни реакционни профили, когато се използва един и същ медиатор. Ацетосирингонът и сирингалдехидът значително повишават скоростта на обезцветяване по време на първоначалната реакция. Тези резултати показват, че ацетозирингонът и сирингалдехидът, съдържащи диметокси групи, са по-ефективни при повишаване на началната скорост на обезцветяване чрез LMS, отколкото ацетованилон, съдържащ една метокси група. Филат и др. също съобщава, че метокси групите в пръстенните структури на медиаторите действат като ускорители за окисляване на субстрати [36]. От друга страна, добивът на обезцветяване след 24 часа реакция от ацетованиллон е подобен на този от сирингалдехид, въпреки че ацетованилонът умерено повишава скоростта на реакцията.

За повече информация: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501