Ко-имунотерапия на базата на липозоми с TLR агонист и CD47-SIRP блокада на контролна точка за ефикасно лечение на рак на дебелото черво

Резюме:

Антитуморният имунитет е основен компонент на терапията на рак и се медиира предимно от вродения имунен отговор, който играе критична роля в инициирането и оформянето на адаптивния имунен отговор. Появяващите се доказателства идентифицират вродени имунни контролни точки и рецептори за разпознаване на образи, като CD47 и Toll-подобен рецептор 7 (TLR7), като обещаващи терапевтични цели за лечение на рак. Въз основа на слетия протеин Fc-CV1, който включва вариант на SIRP с висок афинитет (CV1) и Fc фрагмента на човешкото IgG1 антитяло, ние използвахме препарат, който свързва Fc-CV1 с ​​липозоми, натоварени с имиквимод (TLR7 агонист) ( CILPs) за активно насочване към CT26. WT сингенни модели на тумор на дебелото черво. Проучванията in vitro разкриха, че CILPs показват превъзходни свойства на продължително освобождаване и ефективност на клетъчно усвояване в сравнение със свободния имиквимод. In vivo, анализите доказаха, че CILPs показват по-ефективно натрупване в тумори и по-значителен туморен супресивен ефект от контролните групи. Този имунотерапевтичен препарат притежава предимствата на ниски дози и ниска токсичност. Тези резултати показват, че комбинация от терапия с блокада на имунна контролна точка (ICB) и агонисти на вроден имунитет, като Fc-CV1 и зареден с имиквимод липозомен препарат, използван в това проучване, може да представлява високо ефективна стратегия за туморна терапия.

Ползи от cistanche tubulosa-антитуморен

Ключови думи:

имиквимод; липозома; Fc-CV1; имунотерапия; рак на дебелото черво

1. Въведение

Заболеваемостта от рак в световен мащаб продължава да нараства всяка година, представлявайки сериозна заплаха за здравето на световното население и тежко бреме върху системите на здравеопазване. Според доклад на Световната здравна организация през 2020 г. в света са регистрирани 19,29 милиона нови случая на рак и 9,96 милиона смъртни случая от рак [1]. Въпреки това, с непрекъснатия напредък в клиничната диагностика, хирургията, лъчетерапията и химиотерапията, общата преживяемост и качеството на живот на пациентите с рак се подобриха значително. Трябва да се отбележи, че имунотерапията, която произхожда от ваксината на Coley през 1890 г. [2], предшества както лъчетерапията, така и химиотерапията и постигна значителен напредък през последното десетилетие, като е от полза за пациентите с рак.

Туморната имунотерапия е призната за отличната си биосъвместимост и висока специфичност и е способна да индуцира имунни отговори за елиминиране на туморни клетки [3–5]. Две основни стратегии за имунотерапия на тумори са имунното усилване и имунното нормализиране [6]. Моделите на усилване на имунитета се състоят главно от терапия с цитокини, ваксини за лечение на тумори и моноклонални антитела. Toll-подобните рецептори (TLRs) се считат за потенциални цели за имунотерапия на рак поради тяхната роля в активирането на вродената имунна система. TLR агонистите са разработени като имунен адювант и различни TLR агонисти са подложени на клинични изпитвания [7]. Монофосфорил липид А и имиквимод, TLR4 и TLR7 агонисти, съответно, са получили одобрение от Администрацията по храните и лекарствата за клинично приложение [7–9]. Имиквимод, агонист на TLR7 [9], активира имунните отговори и повишава антитуморната активност чрез задействане на TLR7 [10,11]. Стратегията за нормализиране на имунитета е представена от лекарства за блокиране на имунна контролна точка (ICB), които регулират дефектния адаптивен туморен имунен отговор. Тъй като първият инхибитор на контролни точки, ипилимумаб беше одобрен за клинично приложение в САЩ през 2011 г., инхибиторите на имунните контролни точки, като инхибиторите на PD1/PDL1, направиха пробив в имунотерапията на рака [12–14]. С изключение на адаптираните имунни контролни точки, подобни на PD1/PDL1, някои вродени имунни контролни точки, като SIRP -CD47, също привлякоха много внимание и се превърнаха в области от значителен интерес при разработването на лекарства за антитела [15–17].

Контролният пункт SIRP -CD47 е идентифициран за първи път през 1999 г. [18,19]. SIRP е CD47 рецептор, експресиран в неврони на централната нервна система [20] и миелоидни клетки, включително моноцити, макрофаги, гранулоцити и дендритни клетки. CD47 е "самомаркираща се молекула", експресирана върху почти всички нормални клетки и свръхекспресирана върху повечето туморни клетки [21]. На повърхността на туморните клетки CD47 се свързва със SIRP, инхибирайки медиираната от макрофагите фагоцитоза, която е важно средство за имунно бягство на тумора [22]. Доказано е, че фагоцитозата на макрофагите в микросредата на тумора може да се засили, когато свързването на CD47 и SIRP е блокирано [20–25]. Следователно, инхибитори на имунната контролна точка, които блокират пътя на CD47/SIRP, са разработени и приложени в терапията на рак [26].

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

В това проучване използвахме комбинация от имиквимод и слят протеин (Fc-CV1) за лечение на рак на дебелото черво. CV1 е модифициран човешки рекомбинантен SIRP протеин, който има 50,000-пъти по-висок афинитет към CD47 от оригиналния протеин [27]. Fc-CV1 е конструиран с помощта на технологията "Knobs-into-holes", базирана на CV1 мономер и Fc фрагмент на човешки IgG1. За да преодолеем ограниченията на слабата терапевтична ефикасност и системната токсичност, свързани с имиквимод [28,29], подготвихме нанолипозоми чрез метода на инжектиране на етанол. Нанолипозомите имат характеристиките на ниска токсичност при доставяне на лекарства [30,31]. Впоследствие имиквимод се капсулира в липозоми, които повърхностно конюгират Fc-CV1. И накрая, този нов нанопрепарат може активно да доставя TLR7 агонисти на туморни тъкани и има двойни функции като ICB лекарство и TLR агонист. Използва се за лечение на модела на сингенен тумор на дебелото черво CD47+ CT26.WT [32].

2. Резултати и дискусия

2.1. Характеризиране на LPs (празни липозоми), ILPs (не-CD47-насочени имиквимод-капсулирани липозоми), CLPs (CD47 насочени липозоми) и CILPs (свързани Fc-CV1 с ​​имиквимод (TLR7 агонист)-натоварени липозоми)

CILP бяха успешно получени чрез инжектиране на етанол и метода на градиента на амониев сулфат. Фигура 1А показва процеса на синтез на CILP. TEM анализ показа, че CILPs са сферични и еднакви по форма (Фигура 1B). Освен това, резултатът от DLS разкри, че размерът на частиците на четирите липозоми е унимодално разпределение (Фигура 1C). Скоростта на свързване (BR) се проверява чрез SDS-PAGE, която е показана на Фигура 1D, E. Фигура 1D показва молекулното тегло на Fc-CV1 и относителната яркост на лентата на диализирани и предварително диализирани CILPs. BR беше изчислен на 67,13 ± 37,10% чрез сканираща денситометрия на Image J на ​​електрофоретични ленти (Фигура 1E), предоставяйки възможност за CD47-насочване към туморни клетки.

Фигура 1. (A) Схематична илюстрация на синтеза на CILP. (B) TEM изображение на CILP

HPLC се използва за откриване на ефективността на капсулиране (EE) на имиквимод (допълнителна фигура S1). Както е показано на допълнителна фигура S1A, свободният имиквимод показва значителен единичен пик, докато CLPs не показват пик при същите условия на изпитване (допълнителна фигура S1B). Следователно е възможно да се открият CILP директно при условията на изпитване. Както се очакваше, стойностите на откриване на CILP преди и след диализа се разглеждат съответно като общото съдържание на лекарството и съдържанието на лекарството в липозомите (допълнителна фигура S1C, D). EE на имиквимод се изчислява на 85,44 ± 4,11%. В сравнение с докладваната система за доставяне на лекарства с пасивно натоварване [33–35], това проучване постигна по-висока ефективност на капсулиране и по-удобен процес на приготвяне.

DLS демонстрира, че диаметрите на LP са 111,567 ± 0.655 nm, докато CLP, ILP и CILP показват малко по-голям размер от 117.467 ± 0.34{{10} } nm, съответно 120.233 ± 0.776 nm и 13{{30}}.033 ± 0.974 nm (Таблица 1). Промените в размера на тези липозоми могат да бъдат приписани на модификацията на Fc-CV1 и имиквимод. PDI беше близо до 0,1 (Таблица 1), което показва, че тези превозни средства за доставяне на лекарства са силно хомогенни в тяхното разпределение. Освен това стойностите на зета-потенциала на LPs, CLPs, ILPs и CILPs бяха измерени съответно на -2,231 ± 0,167 mV, -2,492 ± 0,033 mV, -2,383 ± 0,070 mV и -2,075 ± 0,070 mV (Таблица 1) , което предполага, че повърхностно конюгираният Fc-CV1 и капсулираният имиквимод имат малък ефект върху заряда на липозомите.

Таблица 1. Диаметри, зета-потенциал, PDI и EE съответно на LPs, CLPs, ILPs и CILPs.

2.2. Ефективност на ин витро клетъчно усвояване

Ефективността на клетъчното поглъщане на CILPs беше оценена чрез интензитета на флуоресценция на Cy5, поет от CT26.WT клетки, използвайки система за изображения с високо съдържание. Както е показано на Фигура 2, в сравнение със свободните Cy5 и ILP-Cy5 групите, CILPs-Cy5 групите показват по-силен капацитет за усвояване на клетките след 30 минути инкубация. Тези резултати предполагат, че Fc-CV1 повишава способността за вътреклетъчно доставяне на липозоми, заредени с имиквимод, поради специфичния афинитет към Fc-CV1 рецептора, което води до по-мощен антитуморен ефект.

Фигура 2. Изображения на CT26.WT клетки след инкубиране със свободните Cy5, ILPs-Cy5 и CILPs-Cy5 (червено) за 0.5 часа и оцветяване с DAPI (синьо). Мащабна лента: 50 µm. (n {{10}}). * p < 0.05; **** p < 0,0001

2.3. Криви на освобождаване на липозоми

Кривите на освобождаване на лекарството на свободния имиквимод, ILPs и CILPs бяха измерени в симулирана in vivo среда. Фигура 3 показва, че свободният имиквимод се освобождава напълно след 1 час, докато скоростта на освобождаване (RR) на имиквимод, капсулиран с ILP и CILP, е само 54,75 ± 4.{8}}8% и 39,70 ± 0,05% на 12 часа , съответно. Освен това, бавното освобождаване на имиквимод в ILPs и CILPs може да бъде затворено със свойството на липозомите за контролирано освобождаване на лекарството. RR на имиквимод в ILPs и CILPs не показва значителна разлика след 96 часа, което показва, че "пост вмъкването" показва незначително влияние върху мембранната стабилност на липозомите.

фигура 3. Криви на освобождаване на имиквимод на свободния имиквимод, ILPs и CILPs в PBS при 37 ◦C. Данните са представени като средна стойност ± стандартно отклонение (n=3). * p < 0.05, ** p < 0,01

2.4. Проучване за цитотоксичност

За да се изследва цитотоксичността на CILPs in vitro, анализът CCK{{0}} беше извършен върху CT26.WT клетки. Както е показано на фигура 4, CILP при ниски концентрации (0,1–1 µg/mL) не показват цитотоксичност, което е в съответствие с безопасността на имунизационната терапия. Клетъчната жизнеспособност е леко намалена след лечение с 5 µg/mL имиквимод, вероятно поради ROS и медиираната от ендоплазмения ретикулум имуногенна клетъчна смърт, индуцирана от имиквимод [36]. Освен това, CILP води до значително намаляване на клетъчната жизнеспособност в сравнение с контролните групи, което се дължи на синергичния ефект на имиквимод и Fc-CV1.

Фигура 4. Жизнеспособността на клетките, третирани с Fc-CV1, имиквимод, CLPs, ILPs и CILPs за 24 часа. Концентрациите на Fc-CV1 и имиквимод бяха 0–10 µg/mL. * p < 0.05, ** p < 0.01, ns=няма значими разлики

2.5. Проучване на биоразпределението

Разпределението и натрупването на различни форми в тумори и основни органи пряко влияе върху терапевтичния ефект. След интравенозно приложение, флуоресцентните сигнали се наблюдават с помощта на система за вивисекция в близък инфрачервен спектър, за да се оцени разпределението и натрупването на различни формулировки в тумори и основни органи след 24 часа. Както е показано на Фигура 5, общият интензитет на флуоресценция на ILPs-Cy5 и CILPs-Cy5 е по-висок от свободния Cy5, което показва, че липозомите притежават дълго циркулиращо свойство in vivo. В допълнение, интензитетът на флуоресценция на групата за лечение с CILPs-Cy5 е най-високият в туморната тъкан, което може да се припише на тумор-таргетния ефект на Fc-CV1 лигандите, като по този начин засилва антитуморния ефект. Поразително е, че интензитетът на флуоресценция на черния дроб и далака е по-мощен от други органи, което вероятно се дължи на фагоцитозата на липозомите от ретикулоендотелната система (RES) в черния дроб и бъбреците [37].

Фигура 5. Разпределението на Cy5-флуоресценция в тумори и основни органи на 24-ия час след интравенозно приложение. Данните са показани като средна стойност ± стандартно отклонение (n=3). **** p < 0.0001

2.6. In vivo проучване за инхибиране на тумора

Терапевтичният график (Фигура 6А) и ефектите на различните препарати са показани на Фигура 6. В сравнение с PBS и LP групите, други групи на лечение показват определени тумор-супресорни ефекти. Трябва да се отбележи, че обемът на тумора е минимален след лечение с CILPs, което предполага, че CILPs притежават отличен туморен супресорен ефект (Фигура 6B).

Фигура 6. (A) Схематична илюстрация на лечение срещу рак на дебелото черво върху туморен модел CT26.WT. (B) Кривите на растеж на обема на тумора по време на периода на лечение. (C) Относителни туморни снимки и (D) тегло на тумора, събрани от различни групи на лечение на ден 17. (E) Съотношението на относителното телесно тегло към телесното тегло в сравнение с 0 ден. Данните са представени като средно ± стандартно отклонение (n=5). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.

В края на експеримента мишките бяха умъртвени и техните тумори бяха изрязани, фотографирани и претеглени, за да се определи терапевтичната ефикасност на различните препарати. Както е показано на Фигура 6C, D, групата за лечение на CILPs има най-малките и най-леки тумори в сравнение с други групи, което показва, че CILPs притежават най-големите туморни супресорни ефекти. Таблица 2 показва, че степента на инхибиране на туморния растеж на CILPs е изчислена на 84,35%. В допълнение, степента на потискане на тумора от 84,35% е значително по-висока от тази на групите CLPs и ILPs и това означава, че има синергичен ефект от блокирането на оста „не ме яж“ и активирането на имунния отговор . В сравнение с еквивалентния препарат in vitro (2,5–5 µg/mL), по-високата степен на инхибиране е тясно свързана с тази на активирания от формулировката имунен отговор и блокира механизма за освобождаване на имунната система in vivo, който не е наличен in vitro.

Таблица 2. Данните за теглото на тумора и инхибирането на растежа на тумора (TGI) на различни третирани групи.

2.7. CILPs Повишена Т-клетъчна инфилтрация и секреция на IFN

За да се изследва имунната клетъчна среда на туморите, имунната клетка, индуцирана от CILPs, се анализира имунохистохимично в края на антитуморния анализ. CD4+ и CD8+ Т клетките бяха увеличени в туморните секции на CILPs групите (Фигура 7). Съвместното доставяне на Fc-CV1 и терапия с имиквимод доведе до значителна CD4+ и CD8+ Т клетъчна инфилтрация. В допълнение, имаше значителна секреция на IFN в туморите, подложени на лечение с CILPs, което се дължи на това, че CILPs задействаха Toll-подобен рецептор 7 и активираха имунния отговор.

Фигура 7. Имунохистохимия на миши туморни тъкани; положителните клетки са оцветени в кафяво. Мащабна лента, 50 µm (n=5).

2.8. Оценка на биосигурността на CILP

Биобезопасността на терапията, медиирана от CILPs, също беше важен показател по отношение на достъпа до терапевтичната оценка. По време на изследването за инхибиране на тумора in vivo, CILPs не предизвикват значителна загуба на тегло в периода на лечение (Фигура 6D). Всички биохимични параметри на черния дроб и бъбреците бяха в нормални граници според стандартния референтен диапазон на мишки (Таблица 3), а хистологията на органа не показа значителни промени, което показва, че CILP притежават отлична биобезопасност (Фигура 8). Тези констатации са от решаващо значение за оценката на потенциала на CILPs като безопасно и ефективно имунотерапевтично средство за лечение на рак.

Таблица 3. Биохимични параметри на черния дроб и бъбреците

Фигура 8. H&E (хематоксилин и еозин) оцветяване на основните органи. Мащабна лента, 50 µm (n=3)

3. Материали и методи

3.1. Материали

Имиквимод е закупен от MedChem Express (Шанхай, Китай). Fc-CV1 беше предоставен от Държавната ключова лаборатория за лекарства с антитела и таргетна терапия. Холестерол, хидрогениран лецитин (HSPC), DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NHS и DSPE-PEGCy5 бяха закупени от Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, Китай). 40,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) са получени от Keygen Biotech (Nanjing, Китай). Амониевият сулфат беше получен от Sinopharm (Шанхай, Китай). Метанол (хроматографски клас) и ацетонитрил (хроматографски клас) бяха закупени от Aladdin Reagent Company (Шанхай, Китай). Останалите реактиви са с местно качество за анализи. Клетъчна линия CT26 на миши рак на дебелото черво. WT беше предоставен от Клетъчната банка на Китайската академия на науките. Клетките се отглеждат в клетъчен инкубатор в среда RPMI 1640, съдържаща 10% FBS (Thermo Fisher Scientific, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ) при 5% CO2 и 95% въздух. Женски BALB/c мишки от 4–6 седмици бяха доставени от Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd. (Jinan, Китай).

3.2. Приготвяне на празни липозоми

Първо, 13,455 mg HSPC, 4,3595 mg DSPE-PEG2000 и 4,7095 mg холестерол бяха прецизно претеглени и разтворени в 0,1 ml етанол (HSPC: DSPE-PEG2000:холестерол=55).5: 5,05:39,3 моларно съотношение). Второ, разтворът на етанол се инжектира бързо в предварително загрят разтвор на амониев сулфат (250 mM, 1 mL, 65 °C) чрез спринцовка и след това се инкубира за 30 минути при 65 °C с магнитно разбъркване. Впоследствие приготвеният разтвор беше последователно екструдиран през поликарбонатните мембрани (Avanti, Alabaster, AL, USA); размерът беше съответно 200 nm, 100 nm и 50 nm. Накрая, полученият разтвор беше празните липозоми (LP) с липидна концентрация от 22,5 mg/mL.

3.3. Приготвяне на CD47 насочени имиквимод-капсулирани липозоми

Първо, DSPE-PEG2000-NHS се разтваря в ddH2O (60 ◦C) и след това се смесва с Fc-CV1 и се инкубира в разклащаща се маса при стайна температура в продължение на 5 часа (Fc-CV1:DSPEPEG2000- NHS=12:1 моларно съотношение). Механизмът на химическата реакция на връзката между Fc-CV1 и DSPE-PEG2000-NHS включва NHS естера, реагиращ с първичния амин на Fc-CV1 и образува конюгат на трапезна аминна връзка. Приготвеният разтвор се смесва пропорционално с LPs и се инкубира при 60 ◦C за 1 час, за да се вмъкне Fc-CV1 в липозоми, което се нарича "след вмъкване" [38]. Пропорциите на сместа са, че 2,25 mg Fc-CV1 се модифицират на 22,5 mg липозоми. След това бяха получени CD47 насочените липозоми (CLPs).

Впоследствие CLPs се поставят в диализна торба (300 kDa) и се диализират срещу HEPES (10 mM, рН=7.4) в продължение на 1 час за отстраняване на амониевия сулфат и остатъчния Fc-CV1 във външната водна фаза. Диализираните CLP се инкубират с разтвор на имиквимод (5 mg/mL) в съотношение 1 mg към 7 µmol общи фосфолипиди при стайна температура в продължение на 24 часа и след това се диализират срещу PBS (300 kDa) три пъти, за да се елиминира некапсулираният имиквимод, който се отнася до техниката на градиент на амониев сулфат [39]. След това бяха получени CILP. Освен това бяха приготвени не-CD47-насочени имиквимод-капсулирани липозоми (ILPs). CLPs и ILPs се считат за контрола за CILPs.

3.4. Характеризиране

Морфологията на тези липозоми беше фотографирана с трансмисионен електронен микроскоп (ТЕМ, Джоел, Токио, Япония). Размерът, зета-потенциалът и индексът на полимерна дисперсност (PDI) на тези липозоми бяха определени чрез динамично разсейване на светлината (DLS) и електрофоретично разсейване на светлината (ELS), използвайки Zeta sizer ZSE на Malvern (Malvern, UK). Скоростта на свързване (BR) на Fc-CV1, вмъкнат в липозоми, се измерва чрез електрофореза с 15% натриев лаурил сулфат-полиакриламиден гел (SDS-PAGE) и софтуер Image J (Bethesda, MD, USA). Ефективността на капсулиране (EE) на имиквимод беше открита чрез високоефективна течна хроматография (HPLC, Thermo Fisher Scientific, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ).

Ползи от cistanche tubulosa-антитуморен

3.5. In Vitro изследване на клетъчното усвояване

In vitro клетъчното усвояване на тези липозоми се определя от кумулативния интензитет на флуоресценция на Cy5 в CT26. WT клетки. DSPE-PEG-Cy5 се инкубира с CILPs и ILPs (DSPE-PEG-Cy5: CILPs или ILPs=1:5 масово съотношение) при 60 ◦C за 1 час, съответно, и след това флуоресцентни липозоми наречени CILPs-Cy5 и ILPs-Cy5 бяха получени. Клетките CT26.WT се посяват в 96-плаки с ямки и се разделят на случаен принцип в три групи (1 × 104 клетки/ямка, n=3). След като клетъчната конфлуентност достигне 50–70%, всяка група се инкубира със свободен Cy5, ILPs-Cy5 и CILPs-Cy5, съответно, за 30 минути при 37 ◦C, при което крайните концентрации на Cy5 са 1 µg/mL в 0,1 ml RPMI 1640 среда. Впоследствие клетките се имобилизират с 4% параформалдехид за 15 минути, след като се промиват два пъти с PBS и след това се оцветяват с 10 µL DAPI (1 µg/µL) за 10 минути, след като се промиват два пъти с PBS. Накрая, поглъщането на всяка група клетки се записва от система за изображения с високо съдържание (Molecular Devices, Сънивейл, Калифорния, САЩ) след два пъти промиване с PBS.

3.6. Проучване за освобождаване на имиквимод

Кривите на освобождаване на различни заредени с лекарство липозоми бяха проведени с помощта на метода на диализа (300 kDa) и резултатите бяха сравнени със свободния разтвор на имиквимод. Накратко, 0.6 mL ILPs, CILPs и разтворът на имиквимод бяха отделно опаковани в торбичките за диализа и след това поставени в 500 mL PBS разтвор (pH=7.4, 37 ◦C). Равни обеми проби бяха извлечени от торбите на предварително определени интервали от време (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72 и 96 часа) и скоростта на освобождаване (RR) на имиквимод се изчислява с помощта на следното уравнение:

където Sund и Sd представляват HPLC площта на пика на имиквимод в предварително диализирани и диализирани препарати в различни моменти, съответно (n=3).

3.7. Цитотоксичността на CILP

CT{{0}}.WT клетки се посяват в 96-ямкова плака (1 × 104/ямка, n=3) и се култивират в 100 µL среда RPMI 1640 до сливането близо достига 70%. За да се определи цитотоксичността на CILPs, средата RPMI 1640 се отстранява от всяка ямка и се заменя с комплексен разтвор на CILPs и среда RPMI 1640, с концентрации на Fc-CV1 и имиквимод, вариращи от 0 до 10 µg/mL. Клетките се инкубират с комплексен разтвор в продължение на 24 часа. В допълнение, клетките, които са третирани с Fc-CV1, CLPs, разтвор на имиквимод и ILPs в подобна концентрация, се считат за контролни групи. Оцелелите клетки бяха открити с CCK-8 анализ след 24 часа и жизнеспособността на нетретираните клетки беше счетена за 100%.

3.8. Проучване на биоразпределението

Девет женски BALB/c мишки бяха инжектирани подкожно с CT26. WT клетки (5 × 105) в десния хълбок и тези мишки, носещи тумор, бяха разделени на случаен принцип в три групи (n=3). Обемът на тумора се измерва с помощта на дебеломер и се изчислява по следната формула:

Когато обемът на тумора достигне 100 mm3, свободният Cy5, ILP-Cy5 и CILPs-Cy5 се инжектират интравенозно при доза от Cy5 от 0,4 mg/kg. Двадесет и четири часа след интравенозната инжекция туморът, сърцето, черният дроб, далакът, белият дроб и бъбрекът бяха извадени. Флуоресцентните сигнали на туморите и основните органи бяха открити от системата за оптично изображение IVIS (IVIS Lumina LT III, PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

3.9. In vivo проучване за инхибиране на тумора

Тридесет и пет женски BALB/c мишки бяха разделени на случаен принцип в седем групи (n=5) и 5 ​​× 105 CT26. WT клетки се инжектират подкожно в десния хълбок на всяка мишка. Когато размерът на тумора на мишката беше около 100 mm3, лечението беше започнато. PBS, LPs, имиквимод, Fc-CV1, ILPs, CLPs и CILPs бяха инжектирани интравенозно на дни 0, 4, 8 и 12. Дозата на имиквимод беше 2,5 mg/kg при първата и втората инжекции и 5 mg/kg при третата и четвъртата инжекция. При всички инжекции дозата на Fc-CV1 е 5 mg/kg. При тази доза концентрацията на лекарството в тялото е 2,5–5 µg/mL, което проявява цитотоксичност върху клетките в in vitro експеримент. Диаметърът на тумора и телесното тегло се измерват всеки ден по време на лечението. На 17-ия ден туморите на мишките бяха извадени и теглото им беше измерено. Инхибирането на туморния растеж (TGI) се изчислява съгласно следната формула:

3.10. Имунохистохимия

Имунохистохимичното оцветяване на CD4, CD8 и IFN се извършва в туморни тъкани съгласно стандартен протокол. След депарафинизиране и рехидратиране на парафиновата секция на срезовете на туморните тъкани, към кръга се добавя 3% BSA, за да покрие тъканта, и след това се запечатва за 30 минути при стайна температура. Срезовете се оцветяват с CD4, CD8 и IFN антителата (Servicebio, Wuhan, Китай) за една нощ при 4 ◦C и след това се инкубират с вторично антитяло (HRP-белязано, Servicebio, Wuhan, China) при стайна температура за 50 минути след две измивания с PBS. В крайна сметка срезовете бяха визуализирани под микроскоп (Nikon, E100, Токио, Япония) след реакция с DAB хромогенния агент.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

3.11. Оценка на биосигурността на CILP

В края на изследването за инхибиране на тумора, всички тумори бяха събрани и теглото на тези тумори беше измерено. Биохимичните параметри, включително аланин трансаминаза (ALT), аспартат трансаминаза (AST), креатинин (CREA) и урея (UREA), бяха открити в кръвта на мишки. Пресни туморни тъкани и основни органи бяха фиксирани с 4% параформалдехид и вградени в парафин с помощта на машина за вграждане (Wuhan Junjie Electronics, JB-P5, Ухан, Китай). Тъканни срезове с дебелина 5 µm се нарязват през микротома (Leica Instrument, RM2016, Шанхай, Китай) и след това се оцветяват с хематоксилин и еозин (H&E) съгласно протокола. Впоследствие оцветяващите срезове се наблюдават под микроскоп (Nikon, E100, Токио, Япония).

3.12. Статистически анализ

Всички данни са изразени като средно ± SD. Нивото на значимост между групите беше тествано чрез еднопосочен ANOVA с помощта на Graphpad Prism 8.0.2. p < 0.05 се определя като значима разлика.

3.13. Етика на животните

Всички процедури и препоръки относно животните бяха одобрени от Специалния комитет по етика на научните изследвания на университета Liaocheng, следвайки националните насоки за грижа и използване на лабораторни животни (Код за одобрение: 2022111010; Дата на одобрение: 1 ноември 2022 г.).

растение цистанче, повишаващо имунната система

4. Изводи

В обобщение, имиквимод-капсулирани CD47-насочени липозоми бяха успешно разработени и in vitro резултатите доказаха, че CILP притежават по-продължително освобождаване и специфичен насочен ефект. Резултатите in vivo показват, че препаратът може да бъде ефективно погълнат от туморни клетки и че той показва отлична ефективност при лечение на тумори и биобезопасност поради двойната функция на имунния отговор и вродената блокада на имунната контролна точка. Следователно, капсулираните с имиквимод липозоми, свързани с Fc-CV1, изглеждат обещаваща нова наномедицина за подобряване на лечението на тумор на експресия на CD47. Имунотерапията, базирана на вродения имунитет, може да служи като обща стратегия срещу растежа на тумора за синергични комбинации с ICB в бъдеще.

Препратки

1. Сунг, Х.; Ferlay, J.; Siegel, RL; Laversanne, М.; Соерджоматарам, И.; Джемал, А.; Брей, Ф. Глобална статистика за рака 2020: Оценки на Globocan за заболеваемост и смъртност в световен мащаб за 36 вида рак в 185 страни. CA Cancer J. Clin. 2021, 71, 209–249. [CrossRef] [PubMed]

2. Карлсън, RD; Flickinger, JC, Jr.; Snook, AE Talkin' Toxins: From Coleys to Modern Cancer Immunotherapy. Токсини 2020, 12, 241. [CrossRef] [PubMed]

3. Barbari, C.; Фонтейн, Т.; Parajuli, P.; Lamichhane, N.; Якубски, С.; Lamichhane, P.; Deshmukh, RR Имунотерапии и комбинирани стратегии за имуноонкология. Вътр. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5009. [CrossRef]

4. Хегде, PS; Chen, DS Топ 10 предизвикателства в имунотерапията на рака. Имунитет 2020, 52, 17–35. [CrossRef]

5. Jain, KK Персонализирана имуноонкология. Med. Принц. Практ. 2021, 30, 1–16. [CrossRef]

6. Санмамед, МФ; Chen, L. Промяна на парадигмата в имунотерапията на рака: от подобряване към нормализиране. Cell 2018, 175, 313–326. [CrossRef]

7. Хюсеин, WM; Liu, TY; Скварчински, М.; Toth, I. Тол-подобни рецепторни агонисти: Патентен преглед (2011–2013). Експертно мнение. Там. Потупване. 2014, 24, 453–470. [CrossRef]

8. Чи, Х.; Li, C.; Zhao, FS; Джан, Л.; Ng, ТВ; Джин, Г.; Sha, O. Антитуморна активност на Toll-подобен рецептор 7 агонисти. Преден. Pharmacol. 2017, 8, 304. [CrossRef] [PubMed]

9. Уанг, Й.; Джан, С.; Li, H.; Wang, H.; Джан, Т.; Hutchinson, MR; Ин, Х.; Wang, X. Модулатори с малка молекула на Toll-подобни рецептори. Acc. Chem. Рез. 2020, 53, 1046–1055. [CrossRef] [PubMed]

10. Льо Мерсие, И.; Poujol, D.; Sanlaville, A.; Сисирак, В.; Gobert, M.; Дюран, И.; Дюбоа, Б.; Treilleux, I.; Marvel, J.; Влах, Й.; et al. Стимулирането на тумора от интратуморни плазмоцитоидни дендритни клетки се обръща чрез лечение с Tlr7 лиганд. Cancer Res. 2013, 73, 4629–4640. [CrossRef]

11. Ма, Ф.; Джан, Дж.; Джан, Дж.; Zhang, C. Tlr7 агонистите Imiquimod и Gardiquimod подобряват DC-базираната имунотерапия за меланом при мишки. клетка. Mol. Immunol. 2010, 7, 381–388. [CrossRef]

12. Билан, С.; Kaidar-Person, O.; Gil, Z. Лечение след прогресия в ерата на имунотерапията. Lancet Oncol. 2020, 21, e463–e476. [CrossRef] [PubMed]

13. Дарвин, П.; Toor, SM; Сасидхаран Наир, В.; Elkord, E. Инхибитори на имунната контролна точка: скорошен напредък и потенциални биомаркери. Exp. Mol. Med. 2018, 50, 1–11. [CrossRef] [PubMed]

14. Ли, Б.; Чан, HL; Chen, P. Инхибитори на имунната контролна точка: основи и предизвикателства. Curr. Med. Chem. 2019, 26, 3009–3025. [CrossRef] [PubMed]

15. Джия, X.; Ян, Б.; Тиен, X.; Liu, Q.; Джин, Дж.; Shi, J.; Hou, Y. Cd47/Sirpalpha Pathway посредничи при имунното бягство на рака и имунотерапията. Вътр. J. Biol. Sci. 2021, 17, 3281–3287. [CrossRef]

16. Свобода, Д.М.; Sallman, DA Обещанието за насочени към макрофаги инхибитори на контролни точки при миелоидни злокачествени заболявания. Най-добри практики и изследвания. Clin. Haematol. 2020, 33, 101221.

17. Ленц, RW; Колтън, MD; Митра, СС; Месерсмит, Вашингтон Инхибитори на вродена имунна контролна точка: следващият пробив в медицинската онкология? Mol. Рак Ther. 2021, 20, 961–974. [CrossRef]

18. Дзян, П.; Lagenaur, CF; Narayanan, V. Интегрин-асоциираният протеин е лиганд за P84 невронна адхезионна молекула. J. Biol. Chem. 1999, 274, 559–562. [CrossRef]

19. Зайферт, М.; Cant, C.; Чен, З.; Раполд, И.; Brugger, W.; Канц, Л.; Браун, EJ; Ullrich, A.; Buhring, HJ Човешкият сигнално-регулаторен протеин се експресира върху нормални, но не и върху подгрупи от левкемични миелоидни клетки и медиира клетъчната адхезия, включваща неговия контрарецептор Cd47. Blood 1999, 94, 3633–3643. [CrossRef]

20. Матлунг, HL; Szilagyi, K.; Barclay, NA; van den Berg, TK Сигналната ос на Cd47-Sirpalpha като вродена имунна контролна точка при рак. Immunol. Rev. 2017, 276, 145–164. [CrossRef] [PubMed]

21. Олденборг, Пенсилвания; Железняк, А.; Fang, YF; Lagenaur, CF; Gresham, HD; Lindberg, FP Роля на Cd47 като маркер за себе си върху червените кръвни клетки. Наука 2000, 288, 2051–2054. [CrossRef]

22. Ли, З.; Li, Y.; Гао, J.; Fu, Y.; Hua, P.; Jing, Y.; Кай, М.; Wang, H.; Tong, T. Ролята на Cd47-Sirpalpha имунна контролна точка при туморна имунна евазия и вродена имунотерапия. Life Sci. 2021, 273, 119150. [CrossRef]

23. Хаят, СМГ; Бианкони, В.; Пиро, М.; Jaafari, MR; Хатамипур, М.; Sahebkar, A. Cd47: Роля в имунната система и приложение при терапия на рак. клетка. Oncol. 2020 г., 43, 19–30. [CrossRef]

24. Хуанг, Й.; Може.; Гао, П.; Yao, Z. Насочване към Cd47: Постиженията и опасенията на текущите изследвания върху имунотерапията на рака. J. Thorac. дис. 2017, 9, E168–E174. [CrossRef]

25. Джан, В.; Хуанг, Q.; Xiao, W.; Zhao, Y.; Pi, J.; Xu, H.; Zhao, H.; Xu, J.; Evans, CE; Jin, H. Напредък в антитуморните лечения, насочени към Cd47/Sirpalpha Axis. Преден. Immunol. 2020, 11, 18. [CrossRef] [PubMed]

26. Лю, X.; Pu, Y.; Крон, К.; Deng, L.; Kline, J.; Фрейзър, Вашингтон; Xu, H.; Peng, H.; Fu, YX; Xu, MM Cd47 блокада задейства Т-клетъчно медиирано унищожаване на имуногенни тумори. Нац. Med. 2015, 21, 1209–1215. [CrossRef] [PubMed]

27. Вайскопф, К.; Пръстен, AM; Ho, CC; Volkmer, JP; Левин, AM; Volkmer, AK; Озкан, Е.; Fernhoff, NB; van de Rijn, M.; Weissman, IL; et al. Създадени варианти на Sirpalpha като имунотерапевтични адюванти към противоракови антитела. Наука 2013, 341, 88–91. [CrossRef]

28. Сюн, З.; Ohlfest, JR Локален имиквимод има терапевтични и имуномодулиращи ефекти срещу интракраниални тумори. J. Immunother. 2011, 34, 264–269. [CrossRef]

29. Камат, П.; Дарвин, Е.; Arora, H.; Nouri, K. Преглед на терапията с имиквимод и дискусия за оптимално управление на базалноклетъчни карциноми. Clin. Разследване на наркотици. 2018, 38, 883–899. [CrossRef]

30. Лиу, Й.; Кастро Браво, KM; Liu, J. Целенасочена доставка на липозомни лекарства: нанонаучна и биофизична перспектива. Наномащаб Horiz. 2021, 6, 78–94. [CrossRef] [PubMed]

31. Farjadian, F.; Гасеми, А.; Гохари, О.; Roointan, A.; Карими, М.; Hamblin, MR Нанофармацевтични продукти и нанолекарства в момента на пазара: предизвикателства и възможности. Наномедицина 2019, 14, 93–126. [CrossRef]

32. Джоу, X.; Jiao, L.; Qian, Y.; Dong, Q.; Sun, Y.; Zheng, W.; Zhao, W.; Zhai, W.; Qiu, L.; Wu, Y.; et al. Препозициониране на азелнидипин като двоен инхибитор, насочен към Cd47/Sirpalpha и Tigit/Pvr пътища за имунотерапия на рак. Биомолекули 2021, 11, 706. [CrossRef]

33. Ни, К.; Луо, Т.; Culbert, A.; Кауфман, М.; Jiang, X.; Lin, W. Наноразмерна метало-органична рамка доставя съвместно Tlr-7 агонисти и анти-Cd47 антитела за модулиране на макрофагите и оркестриране на имунотерапията на рака. J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 12579–12584. [CrossRef]

34. Чен, Q.; Xu, L.; Liang, C.; Wang, C.; Peng, R.; Liu, Z. Фототермична терапия с имуно-адювантни наночастици заедно с блокада на контролни точки за ефективна имунотерапия на рак. Нац. Общ. 2016, 7, 13193. [CrossRef] [PubMed]

35. Wei, J.; Дълги, Y.; Гуо, Р.; Лиу, X.; Танг, X.; Rao, J.; Ин, С.; Джан, З.; Ли, М.; He, Q. Многофункционална полимерна мицело-базирана химио-имунотерапия с блокада на имунна контролна точка за ефикасно лечение на ортотопичен и метастатичен рак на гърдата. Acta Pharm. грях. B 2019, 9, 819–831. [CrossRef]

36. Хуанг, SW; Wang, ST; Чанг, SH; Chuang, KC; Wang, HY; Као, JK; Liang, SM; Wu, CY; Као, SH; Чен, YJ; et al. Имиквимод проявява антитуморен ефект чрез индуциране на имуногенна клетъчна смърт и се подсилва от гликолитичния инхибитор 2-дезоксиглюкоза. J. Разследване. Dermatol. 2020, 140, 1771–1783.e6. [CrossRef] [PubMed]

37. Уанг, Б.; Той, X.; Джан, З.; Zhao, Y.; Feng, W. Метаболизъм на наноматериали in vivo: кръвообращение и изчистване на органи. Acc. Chem. Рез. 2013, 46, 761–769. [CrossRef]

38. Ахтари, Дж.; Резаят, С.М.; Teymouri, М.; Алавизаде, SH; Gheybi, F.; Badiee, A.; Jaafari, MR насочване, биоразпределение и инхибиране на туморния растеж Характеризиране на свързване на анти-Her2 афитяло към липозомален доксорубицин с помощта на Balb/C мишки, носещи Tubo тумори. Вътр. J. Pharm. 2016, 505, 89–95. [CrossRef]

39. Уудъл, MC; Papahadjopoulos, D. Приготвяне на липозоми и характеризиране на размера. Методи Enzymol. 1989, 171, 193–217. [PubMed]