Локалният нехипофизен хормон на растежа се индуцира с напредване на възрастта и улеснява увреждането на епитела

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

РЕЗЮМЕ

Факторите на микросредата, модулиращи свързаното с възрастта увреждане на DINA, са неясни. Нехипофизарен хормон на растежа (np) се индуцира в човешкото дебело черво, нетрансформираните човешки клетки на дебелото черво и фибробластите и в 3-димензионалните чревни органоиди със свързано с възрастта увреждане на ДНК. Автокринен/паракринен npGH потиска p53 и отслабва реакцията на увреждане на ДНК (DDR) чрез индуциране на TRIM29 и намаляване на ATM фосфорилирането, което води до намалено възстановяване на ДНК и натрупване на увреждане на ДНК. Органоидите, култивирани до 4 месеца, показват маркери на стареене, p16 и SA- -галактозидаза и намалена дължина на теломерите, както и натрупване на увреждане на ДНК, с повишен npGH, потиснат p53 и атенюиран DDR. Потискането на GH в старите органоиди увеличава p53 и намалява увреждането на ДНК. WT мишки показват зависимо от възрастта натрупване на увреждане на ДНК на дебелото черво, докато при възрастни мишки, лишени от GH сигнализиране на дебелото черво, увреждането на ДНК остава ниско, с повишен p53. Тъй като индукцията на npGH, свързана с възрастта, позволява про-пролиферативна микросреда, отмяната на сигнализирането на npGH може да бъде насочена като терапия против стареене чрез възпрепятстване на увреждането на ДНК и свързаните с възрастта патологии.

ВЪВЕДЕНИЕ

Биологичните функции намаляват с напредване на възрастта, съпътстващо увеличаване на свързаните с възрастта заболявания.флавоноидиСвързаните с възрастта патологии се задвижват от натрупано увреждане на ДНК и недостатъци в възстановяването на ДНК, които причиняват мутации и свързани с възрастта хромозомни аберации. Постоянното увреждане на ДНК може също да блокира клетъчната пролиферация, което води до стареене и апоптоза, като по този начин допълнително стимулира процеса на стареене (Ou and Schumacher, 2018). Увреждането на ДНК се натрупва с възрастта в дивия тип (WT), нетрансформирани човешки и миши клетки, както се вижда от увеличения вариант на фосфорилиран хистон 2A (yH2AX), маркер за разкъсвания на двойноверижна ДНК (DSB) (Sedelnikova et al., 2004) и непоправено увреждане на ДНК (Dolle et al., 1997; Hasty et al., 2003; Lombard et al., 2005; Petr et al., 2020). Геномната нестабилност в резултат на дефектно възстановяване на увреждане на ДНК може да благоприятства клетъчната трансформация (Negrini et al., 2010). Увреждането на ДНК задейства фосфорилирането на гени с мутация на атаксия-телеангиектазия (ATM), отговорни за възстановяването на едноверижни прекъсвания на ДНК и DSB. ATM фосфорилира и стабилизира туморния супресор p53, като по този начин осигурява възстановяване на увреждане на ДНК чрез улесняване на няколко пътя за възстановяване на ДНК. По този начин ATM играе ключова роля в активирането както на реакцията на увреждане на ДНК (DDR), така и на възстановяването на ДНК (Ou и Schumacher, 2018).

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Експресията и активността на ATM се влошават с възрастта (Feng et al..2007; Gutierrez-Martinez et al.,2018), което вероятно води до свързана с възрастта функционална загуба на p53 и води до натрупано увреждане на ДНК и хромозомна нестабилност (Simon et al,2009) Отговорите на .p53 към стресори като радиация са по-ниски при по-възрастни мишки (Feng et al., 2007) и при човешки дермални фибробласти, получени от възрастни индивиди (Goukassian et al., 2000). По този начин отличителните белези на стареенето включват намалена активност на DDR и потискане на p53 с натрупано непоправено увреждане на ДНК, като всички те позволяват благоприятна среда за епителна пролиферация (Lopez-Otin et al., 2013).

Тъй като секрецията на хормона на растежа на хипофизата (GH) намалява с възрастта, промененото сигнализиране на GH е замесено в процеса на стареене (Ho and Hoffman, 1993). Въпреки това, множество доказателства подкрепят благоприятните ефекти от намаляването на GH върху стареенето. В клетката, миши и модели на човешки заболявания (Brown-Borg et al., 1996; Junnila et al., 2013), ползите от дефицита на GH произтичат основно от наблюдения, благоприятстващи вторични фактори, които удължават продължителността на живота, включително повишена инсулинова чувствителност, намалено окисление на чернодробния протеин , намалена заболеваемост от рак и намалено свързано с възрастта възпаление (Aguiar-Oliveira and Bartke, 2019; Bartke, 2016; Junnila et al., 2013; Spadaro et al., 2016). Потомството на семействата на проучването в Лайден с дълголетие в семейството и по-ниска смъртност отколкото контролите, съответстващи на околната среда, имат по-ниски интегрирани циркулиращи нива на GH (van der Spoeletal., 2016), докато излишъкът от GH намалява продължителността на живота, както се наблюдава при пациенти с акромегалия (Chesno-kova et al., 2019a; Melmed, 2020; Waters и Barclay, 200 7) и в трансгенни миши модели, свръхекспресиращи GH (Bartke, 2003).използва хесперидинНякои предполагат отрицателна корелация между височината и дълголетието при хора (He et al., 2014; Samaras and Storms, 1992) и при кучета (Greer et al., 2007). Ние предположихме, че неблагоприятните ефекти на GH върху стареенето могат поне отчасти се дължи на натрупано увреждане на ДНК (Чеснокова и Мелмед, 2020). В подкрепа на тази предпоставка, лимфоцитите, получени от пациенти с акромегалия, показват увреждане на ДНК с повишени хромозомни аберации (Bayram et al., 2014), докато непоправеното увреждане на ДНК се натрупва в черния дроб на модел на акромегалия на риба зебра (Elbialy et al., 2018). Високите циркулиращи нива на GH отслабват възстановяването на ДНК на дебелото черво на мишка, предизвиквайки натрупване на увреждане на ДНК, докато увреждането на ДНК се отслабва след блокиране на GH рецептора (GHR) в човешки клетки на дебелото черво и при мишки с отменено GHR сигнализиране (Chesnokova et al., 2019a).

Нехипофизният GH (np), синтезиран локално в периферните тъкани, е идентичен на ендокринния GH1, произвеждан от хипофизата, и действа чрез автокринни/паракринни механизми чрез широко изразен GHR (Ballesteros et al., 2000), който разпознава както хипофизния GH, така и npGH лиганди ( Waters and Barclay, 2007; Waters et al, 2006).изгубената империя cistancheТъй като активирането на DDR индуцира npGH (Chesnokova et al., 2013), ние предположихме, че свързаното с възрастта натрупано увреждане на ДНК на дебелото черво индуцира експресия на npGH, което от своя страна би ограничило допълнително възстановяването на увреждане на ДНК.

Cistanche може да спре стареенето

Използвайки както in vitro, така и ex vivo човешки модели, отразяващи стареенето, ние показваме тук, че npGH се индуцира и увреждането на ДНК се натрупва в остарелите човешки тъкани, както се вижда от повишеното H2AX фосфорилиране (yH2AX). Освен това, увреждането на ДНК на дебелото черво е значително повишено при възрастни WT мишки, докато увреждането на епителната ДНК остава ниско при съответстващи на възрастта GHR--мишки, лишени от GH сигнализиране и при специфични за дебелото черво GHR нокаут мишки (GHRcolKO).

Локален npGH също беше индуциран в остарели 3-измерни (3D) интестинални органоиди, генерирани от индуцирани човешки плурипотентни стволови клетки (iPSCs) (Barrett et al, 2014; Chesnokova et al, 2019a). Органоидът npGH, от своя страна, потиска p53 и отслабва възстановяването на увреждане на ДНК.микронизирана пречистена флавоноидна фракция 1000 mg използваЕфектите на npGH вероятно са паракринни, тъй като съвместното култивиране на GH-експресиращи фибробласти с микрофлуидни устройства на колона, червата и чипа, вградени с човешки колоноиди, води до потискане на p53/p21 и засилено увреждане на ДНК. Обратно, потискането на GH в старите органоиди предотвратява увреждането на ДНК.

По този начин ние показваме, че епителният npGH е силно индуциран по време на стареенето и че npGH намалява възстановяването на ДНК и улеснява натрупването на увреждане на ДНК, свързано с възрастта. Като цяло, резултатите предполагат, че локалният епителен npGH на дебелото черво предизвиква промяна на лигавичното поле, създавайки среда на хромозомна нестабилност, която е благоприятна за неопластично развитие в старееща тъкан.

Важно е, че въпреки че има широко разпространено неподходящо използване на GH като хормон "против стареене", въпреки липсата на убедително въздействие върху процеса на стареене (Blackman et al., 2002; Clemmons et al.. 2014; Lieut al., 2007; Melmed, 2019), нашите резултати показват, че локалното сигнализиране на GH допринася за тъканната микросреда, благоприятствайки развитието на свързани с възрастта патологии. Следователно потискането на локалното npGH сигнализиране за ограничаване на неблагоприятното увреждане на епителната ДНК може да предложи терапевтична цел за ановулантно стареене. Резултатите от тези проучвания предоставят иновативен подход за удължаване на продължителността на живота (т.е. потискане, а не индуциране на локално GH сигнализиране). РЕЗУЛТАТИ

Увреждането на човешката ДНК на дебелото черво и npGH се натрупват с остаряването

Свързаното с възрастта увреждане на ДНК е оценено в проби от нетуморна човешка парафинова тъкан на дебелото черво, получени от кохорти пациенти, обхващащи 3 възрастови групи: млади (18-39 години), на средна възраст (40-60 години) и възрастни ( 61-88 години). При оценяване за yH2AX, 3 от 11 проби (27 процента) в младата кохорта показват увреждане на ДНК, 8 от 16 (50 процента) показват увреждане на ДНК на средна възраст и 8 от 18 (45 процента) проби на възраст показват увреждане на ДНК (фигури 1A-1C и 1J).

Тъй като по-рано показахме, че увреждането на ДНК индуцира npGH (Chesnokova et al, 2013), ние се опитахме да определим дали зависимото от възрастта натрупване на увреждане на ДНК е свързано с експресия на GH в нетуморна тъкан на дебелото черво. Тъй като не се експресира в невроендокринни клетки на дебелото черво (Chesnokova et al, 2016), ние изключихме тези клетки от анализа.

Експресията на епителен GH беше открита в 16 процента -17 процента от нормалните проби от дебелото черво, получени от кохорти на средна и възрастна възраст (38 и 42 проби, съответно), но само в 2 процента от младата кохорта (37 проби), докато Резултатът за експресия на GH беше повишен в кохортата на средна възраст и допълнително се увеличи в пробите от кохортата на възраст (p<0.01) (figures="" 1d-1f="" and="" 1k).="" furthermore,="" colon="" mrna="" gh="" expression="" increased="" in="" both="" middle-aged="" (30%="" of="" 10="" samples)="" and="" aged="" (26%="" of="" 14="" samples)="" versus="" young="" cohort="" samples(17%="" of9=""><0.01 and=""><0.05, respectively)(figures="" 1g-1).="">отефлавоноидВ обобщение, тези резултати сочат натрупване на увреждане на ДНК без индукция в стареещото дебело черво.

Активирането на DDR индуцира локално npGHin мише и човешко дебело черво

След това разгледахме дали активираният DDR задейства локална експресия на npGH в дебелото черво и третирахме мишки с nutlin3 за стабилизиране на p53 (Vassilev et al, 2004) и наблюдавахме индуциран p53 на дебелото черво и нагоре (Фигура 2A). Освен това, в проби от аденокарцином на дебелото черво, получени от същите пациенти преди и след увреждащи ДНК терапии (Таблица S1), наблюдавахме умерена изходна епителна експресия на npGH преди лечението и повишена експресия на npGH след терапия във всички 6 изследвани проби от пациенти (p<0.01) (figure="" 2b).="" enhanced="" gh="" expression="" was="" also="" observed="" in="" tumor-associated="" fibroblasts="" after="" dna="" damage(figure="" 2c),="" indicating="" that="" these="" findings="" are="" likely="" not="">

DDR активира експресията на GH in vitro

Използвахме инхибитора на топоизомераза II етопозид, за да произведем както едноверижни ДНК прекъсвания, така и DSBs (Walles et al, 1996) и да определим дали DDR активира GH in vitro. Индуцираният от увреждане на ДНК npGH в NCC, hNCF и HCT116 човешки аденокарциномни клетки на дебелото черво (фигури 3A и S1A-S1C); в органоиди, етопозид-индуциран GH и GH иРНК (Фигури 3B и S1D), докато нивата на IGF1 и пролактин иРНК са непроменени (Фигура S1E). Фосфорилирането на STAT5, GH сигнал надолу по веригата (Waters, 2016), е индуцирано във всички типове клетки (Фигури 3A-3C и S1A-S1C). За разлика от това, премахването на npGH с GH малка интерферираща РНК (siRNA) предотвратява индуцирането на pSTAT5 от етопозид (фигури 3C и S1F), предоставяйки доказателство, че индуцираният от увреждане на ДНК npGH на дебелото черво е функционално активен. Изобразяване на NCC, третиран с етопозид в продължение на 24 часа, показва съвместна експресия на GH и yH2AX в множество клетки (Фигура 3D).

Епителните клетки, подложени на увреждане на ДНК, секретират GH За да определим дали индуцираният вътреклетъчен npGH упражнява автокринни/паракринни ефекти, ние оценихме нивата на GH, секретирани в NCC и органоидна културална среда след лечение с етопозид. Среда, събрана от ANCC на 8 и 24 часа след третирането и от органоиди на 4-48 h след третирането, показва зависими от времето увеличения на GH след активиране на DDR (Фигура 3E). Тъй като NCC и органоидите експресират GH рецептори, както и човешката тъкан на дебелото черво (Chesnokova et al., 2016), тези резултати предполагат, че локалният GH, индуциран в отговор на увреждане на ДНК, може да подложи стареещата тъкан на автокринни/паракринни действия.

Автокринният/паракринният GH потиска р53 на човешките клетки на дебелото черво

Тъй като ендокринният GH потиска р53 на дебелото черво на мишка (Chesnokova et al, 2016), ние определихме дали локалният GH упражнява подобни ау-автокринни/паракринни ефекти в човешки епителни клетки на дебелото черво. Анализът на две отделни линии NCC, получени от двама различни пациенти след нуклеофекция с hGH или инфекция с лентивирусен експресиращ GH (lenti-GH) (Фигури 4A, 4B и S2), както и органоиди, стабилно експресиращи hGH (Фигура 4C), показва потиснат p53 и съпътстваща свръхекспресия. Клетки, получени от органоиди, инфектирани с lenti-GH или празен вектор (lenti-V), пулсиран с бромодезоксиуридин (BrdU), показват потискане на p53, последвано от умерено, но значително увеличено включване на BrdU, както се оценява чрез флуоресцентно активирано клетъчно сортиране (FACS) (Фигура S3A). Обратно, потискането на GH с лентивирус, експресиращ малка фибичка GH (GH), води до намалено образуване на колонии и размера на колониите в NCC (фигури S3B и S3C), което показва про-про-литературни npGH действия.

Ефекти на паракринния GH в човешкия чип на дебелото черво на дебелото черво За да оценим паракринните ефекти на npGH върху епителните клетки на чревната лигавица, ние съвместно култивирахме UNCF, инфектиран с lenti-GH и микрофлуидни устройства на чип на дебелото черво на дебелото черво (Kasendra et al, 2020), засети със здраво дебело черво епителни клетки, получени от органоиди, за 8 дни. Локалната секреция на GH от hNCF в средата беше потвърдена чрез ELISA (338 ng/mL/1 × 10 градуса клетки).5-Етинил-2'-деоксиуридин （EdU） （20 μM） беше добавен на ден 7 , чиповете се фиксират 24 часа по-късно и се оцветяват за EdU и H2AX, и EdU плюс ядрата се преброяват в епителните клетки. Отделен набор от чипове

с епителни клетки се използва за оценка на p53/p21 чрез Western blot. Увеличава се пролиферацията на епителните клетки на чипа (стр<0.05), likely="" due="" to="" decreased="" p53="" and="" p21="" (figures="" 4d="" and="" 4e).="" moreover,="" dna="" damage="" accumulation="" was="" evident,="" with="" increased="" numbers="" of="" cells="" expressing="" γh2ax="" （p=""><0.01） （figure="">

Автокринен/паракринен GH потиска DDR

Активирането на ATM при увреждане на ДНК фосфорилира H2AX, което маркира увредените ДНК сайтове за активиране на DDR и насърчаване на възстановяването (Turinetto and Giachino, 2015). ATM също фосфорилира p53, като допълнително подобрява възстановяването на ДНК (Blackford и Jackson 2017). В hNCC, както и в органоиди, инфектирани с pIRES2-ZsGreen1hGH или с lentil-GH, свръхекспресията на GH потиска фосфорилирането на ATM и ДНК-протеин киназа (PK)cs, и двете участващи в възстановяването на ДНК (Blackford и Jackson. 2017) и намалено фосфорилиране на целеви протеин p53 (Фигури 5A-5C).

Tip60 хистон ацетилаза активира ATM (Jackson и Bartek, 2009) и се регулира отрицателно от TRIM29 (Sho et al., 2011; Sun et al, 2005). Наблюдавахме, че свръхекспресията на GH в NCC и в органоидите също води до индукция на TRIM29, което от своя страна потиска Tip60 (Фигури 5A-5C). Подобни резултати се наблюдават във втората NCC линия 48 часа след нуклеофекция с плазмид, експресиращ GH и на 6 дни след инфекция с lenti-GH (фигури S4A и S4B).

Автокринният/паракринният GH отслабва възстановяването на ДНК

След това измерихме ефектите върху механизмите за възстановяване на DSB, по-специално склонното към грешки нехомоложно свързване на краищата (NHEJ) (Jackson and Bartek, 2009) и устойчивата на грешки хомоложна рекомбинация (HR) (Beucher et al., 2009 г. ; Блекфорд и Джаксън, 2017; Чапман и др., 2012). Ние нуклеофектирахме NCC, стабилно експресиращи NHEJ и HR репортерни касети с pcDNA3.1-човешки GH1 (hGH1) плазмиди, индуцирахме DSB чрез ко-трансфектиране с плазмид, кодиращ I-Excel ендонуклеаза, и измерихме повторното присъединяване на репортерите за възстановяване на DSB. Ефективността на трансфекцията се контролира чрез ко-трансфектиране с плазмид, кодиращ DsRed (Seluanov et al, 2010). Ефективността на NHEJ след pcDNA3.1-hGH1 нуклеофекцията беше 0.77-0.83 и намалена на 48h(p<0.05)(figure5d), and="" hr,while="" low(0.05),="" consistent="" with="" other="" reports="" (chitnis="" et="" al,2014;gatei="" et="" al.,2011),showed="" consistently="" decreased="" efficiency="" by="" up="" to="" 38.7%±3.5%="" (n="4" independent=""><0.05) at="" 72="">

Автокринният/паракринният GH увеличава непоправеното увреждане на ДНК

Изследвайки дали npGH увеличава увреждането на ДНК, ние наблюдавахме, че NCC и органоидите, стабилно трансфектирани с lenti-GH, показват повишено ендогенно неремонтирано увреждане на ДНК, измерено чрез Comet анализ (p< 0.05)="" (lee="" and="" paull,="" 2007)(figures="" 5e="" and="" 5f).="" levels="" of="" unrepaired="" dna="" were="" also="" markedly="" increased="" in="" a="" second="" ncc="" line="" in="" cells="" nucleofected="" with="" a="" plasmid="" expressing="" gh="" or="" infected="" with="" lenti-gh="" (figures="" s4c="" and="" s4d).="" overall,="" these="" results="" show="" that="" npgh="" is="" induced="" in="" response="" to="" dna="" damage="" and="" enhances="" dna="" damage="" accumulation="" by="" interfering="" with="" both="" ddr="" and="" dna="" repair="">

GH се индуцира в остарели 3D човешки чревни органоиди и отслабва DDR

След наблюдаваната повишена експресия на GH и увреждане на ДНК в стари проби от човешко дебело черво, ние "състарихме" органоиди, генерирани от три независими iPSC линии, за да обобщим модел на стареене на човешка тъкан. Тези органоиди са съставени от ентероцити, гоблетни клетки, клетки на Панет и ентероендокринни клетки и експресират хомеобокс 2 (CDX2) от каудален тип (Barrett et al., 2014; Gao et al., 2009; Workman et al., 2017). Две от три iPSC линии (редове 1 и 3) са получени от индивиди на възраст над 60 години, а третата iPSC линия (ред 2) е получена от фибробласти на 30-годишен индивид. Органоидите, генерирани от линии 1 и 3, се култивират до 2 месеца, в който момент клетъчната пролиферация се забавя значително. Обратно, органоидите, генерирани от линия 2, пролиферират стабилно в култура до 4 месеца. Клетъчното стареене беше потвърдено във всичките 3 линии чрез повишен p16, както и чрез намалена дължина на теломерите (p<0.05)(figures 6a="" and="" 6b).="" in="" aged="" organoids,="" we="" also="" found="" increased="" senescence-associated="" β-galactosidase="" (sa-β-galactosidase)="" activity,="" which="" has="" been="" shown="" to="" increase="" with="" age="" (kurz="" et="" al.,="" 2000;="" lee="" et="" al.,="" 2006),="" as="" well="" as="" increased="" β-galactosidase="" protein="" expression,="" which="" correlates="" with="" sa-β-galactosidase="" enzymatic="" activity(figures="" 6a="" and="">

Тъй като изглежда, че тези in vitro органоидни характеристики вярно рекапитулират клетъчните промени, съответстващи на стареенето на човешката тъкан (Baker et al.,2011;Lieut al.,2019; Lopez-Otin et al.,2013), използвахме това модел за по-нататъшно изследване на сигналните механизми, които са в основата на стареенето на човешкия епител на дебелото черво. В линия 1, нивата на GH mRNA се индуцират след 1 месец в култура и допълнително се повишават след 2 месеца (p <0,05) (фигура="" 6c),="" което="" е="" в="" съответствие="" със="" значително="" повишен="" npgh,="" наблюдаван="" в="" стари="" органоиди="" както="" при="" western="" blot,="" така="" и="" при="" имунохистохимия="" (ihc)="" (фигури="" 6d,="" 6e="" и="" s5b).="" yh2ax="" също="" беше="" силно="" индуциран="" с="" продължителна="" култура,="" което="" показва="" натрупано="" ендогенно="" увреждане="" на="" днк="" с="" in="" vitro="" стареене.="" в="" съответствие="" с="" резултатите,="" показващи="" потиснат="" p53="" в="" ncc="" и="" органоиди,="" трансфектирани="" с="" gh="" (фигури="" 4a-4c),="" ние="" наблюдавахме="" потиснат="" p53="" на="" 1="" и="" 2="" месеца="" култивиране,="" в="" съответствие="" с="" повишения="" npgh="" (фигури="" 6e="" и="" s5b).="" подобни="" резултати="" (="" a="" и="" b)="" уестърн="" блот="" на="" (a)="" ancc,="" hncf="" и="" hct116="" клетки="" и="" (b)="" органоиди.="" клетките="" се="" третират="" с="" посочени="" дози="" етопозид="" и="" се="" анализират="" 24="" часа="" по-късно.="" органоидите="" се="" третират="" с="" 3="" um="" етопозид="">

(C) NCC, нуклеофектиран с GH siRNA (siGH RNA) или разбъркана RNA (Scr RNA) като контрола за 24 часа се третира с посочени дози етопозид (Etop) и се анализира 24 часа по-късно. ImageJ количественото определяне на Western blots е изобразено на фигура S1.

（D） Представително изображение на NCC, третиран с 20 μM етопозид за 24 часа. GH, червено; yH2AX, зелено; фалоидин, сив; DAPI, син. Яркозеленото ядро ​​показва апоптоза. Мащабна лента, 20 um. Контролни, нетретирани клетки.

(E) Уестърн блот на GH в културалната среда на ANCC и органоиди, третирани съответно с 20 или 5 uM етопозид. Средата се събира от топлина 8 и 24 часа и от органоиди на 4-48 часа след третирането. Ponceau се използва като контрола на натоварването. Показани са представителни петна от поне 3 независими експеримента.

са получени чрез култивиране на органоиди, генерирани от iPSC линии 2 и 3 за съответно 4 и 2 месеца (фигури S6A-S6D).

Освен това, повишеният npGH в остарелите органоиди се свързва с атенюиран DDR, с потиснато фосфорилиране както на ATM, така и на ДНК-PKcs и по-ниски нива на фосфорилиран p53 (Фигури 6E и S5B). Тези резултати предполагат, че потиснатата DDR активност води до натрупано непоправено увреждане на ДНК, както се доказва и от индукцията на yH2AX (фигури 6E и S5B). След 2 месеца в култура, остарелите органоиди, заразени с GH shRNA, показват повишен p53 (Фигури 6F и S7A) и намалено увреждане на ДНК, измерено чрез Comet анализ (p<0.01)(figure 6g),="" indicating="" a="" requirement="" for="" npgh="" in="" age-related="" dna="" damage="" accumulation="" in="" this="">

Дефицитът на сигнализиране на GH отслабва in vivo увреждане на ДНК на дебелото черво при стареещи мишки

За да потвърдим нашите резултати, получени в стари органоиди, ние изследвахме възрастни мишки WT и GHR-7 in vivo. Увреждането на ДНК на дебелото черво е значително повишено при стари (24--месечни) спрямо млади (3--месечни) WT мишки (p<0.01), but,="" strikingly,="" was="" not="" increased="" in="" aged="" ghr-mice="" (figures="" 7a="" and="" s7b),="" likely="" due="" to="" p53="" in-duction.="" we="" also="" generated="" transgenic="" mice="" with="" colon-specific="" ghr="" excision="" (car1-cre/ghr"loxmox,="" ghrcolko)(figure="" s7d).="" control="" mice="" were="" derived="" from="" the="" same="" breeding,="" but="" they="" did="" not="" harbor="" the="" cre="" enzyme.="" colon="" dna="" damage="" was="" much="" reduced="" in="" 20-month-old="" male="" ghrcolko="" mice="" with="" ghr="" excision="" compared="" to="" control="" mice,="" but="" not="" in="" the="" small="" intestine="" with="" intact="" ghr(figure="" 7d).="" thus,="" it="" appears="" that="" dna="" is="" repaired="" more="" efficiently="" in="" mice="" devoid="" of="" gh="" signaling,="" likely="" due="" to="" the="" higher="" colon="" p53="" expression="" we="" observed="" in="" both="" ghr-/-and="" in="" ghrcolko="" animals(figures="" 7b,7c,="" 7e,="" s7c,="" and="" s7e).="" these="" in="" vivo="" results="" buttress="" our="" hypothesis="" that="" npgh="" en-hances="" age-associated="" colon="" dna="" damage="">

ДИСКУСИЯ

Ние показваме тук, че npGH се увеличава с възрастта в човешка тъкан на дебелото черво и в 3D човешки чревни органоиди. Ние демонстрираме няколко линии доказателства, които сочат, че в остарялата човешка тъкан на дебелото черво npGH се индуцира от увреждане на ДНК, както се наблюдава при човешки модели, включително епителни нетуморни клетки, нормални фибробласти на дебелото черво, органоиди и тъкан от рак на дебелото черво на пациенти, подложени на терапии, увреждащи ДНК ; ние също показваме подобни находки in vivo в дебелото черво на мишки с активиран DDR.

Използвайки 3D човешки чревни органоиди, ние наблюдавахме повишен p16, стареене и скъсяване на теломерите, всички в съответствие със свързаните с възрастта промени в човешката тъкан (Baker et al., 2011; Liu et al., 2019; Lopez-Otin et al., 2013 ). Въпреки ограниченията на органоидния модел, нашите резултати подкрепят чревните органоиди като вярна човешка рекапитулация за изследване на сигнални механизми, които са в основата на промените на дебелото черво, свързани с възрастта (Hu et al., 2018).

Открихме, че локалният npGH, действащ по автокринен/паракринен начин, потиска р53 и увеличава пролиферацията на съседни клетки. Индуцираният GH също потиска DDR и възстановяването на ДНК, като допълнително повишава натрупването на увреждане на ДНК. Резултатите също са в съответствие с наблюдаваните ефекти върху натрупването на увреждане на ДНК в рамките на GH-секретиращи човешки хипофизни тумори (Ben-Shlomo et al., 2020).

Действията на GH в нормалната тъкан на дебелото черво благоприятстват развитието на про-пролиферативна среда, която може да е в основата на свързаните с възрастта повишени нива на полипи на дебелото черво, илюстрирани от свързаното с възрастта увреждане на ДНК и хромозомната нестабилност като двигатели на разпространението на рак на дебелото черво при пациенти на възраст над 50 години (Aunan et al., 2017). Свързаното с възрастта повишено увреждане на ДНК, което показваме тук, също е в съответствие с докладите, че yH2AX нараства линейно с възрастта при нормални проби от дебелото черво (Risques et al., 2008). Нашата наблюдавана подчертана регулация на yH2AX в стареещите органоиди е показателна за натрупване на увреждане на ДНК, тъй като yH2AX маркира местата на увреждане на ДНК, за да привлече протеини за възстановяване на ДНК (Turinetto и Giachino, 2015). Тези резултати може да изглеждат несъвместими с факта, че GH, индуциран в стареещите клетки, потиска H2AX фосфорилирането. Въпреки това, ние интерпретираме тези наблюдения, за да покажем, че GH намалява активността на DDR чрез намаляване на фосфорилирането на ATM, което от своя страна намалява (но не премахва напълно) фосфорилирането на протеини надолу по веригата, включително H2AX. Когато DDR не е активиран по подходящ начин, възстановяването на ДНК се променя, но yH2AX все още се натрупва, тъй като маркира неремонтирани места за увреждане на ДНК. По този начин нивата на yH2AX, наблюдавани в старееща човешка тъкан и органоиди, отразяват нетния резултат от активността на DDR и количеството неремонтирана ДНК.

Увреждането на ДНК може да се натрупа в стареещата тъкан поради загубата на възстановяване при изрязване на основата, вероятно от загубата на отговор на p53 към увреждане на ДНК (Cabelof et al., 2006; Simon et al., 2009, 2012). В нашите експерименти p53 намалява в клетките на дебелото черво и органоидите, експресиращи npGH, в съответствие с по-ранните констатации на GH, потискащ p53 (Chesnokova et al., 2016). За разлика от това, възрастни GHR-/-мишки, които са резистентни към рак и имат по-дълъг живот (Basu et al., 2018), както и специфични за дебелото черво GHRcolKO мишки показват повишена експресия на p53 на дебелото черво, което вероятно подобрява възстановяването на ДНК. Тъй като GH потиска p53 (Chesnokova et al., 2013), индукцията на npGH може да доведе до промени в локалната микросреда, съответстващи на свързаното с възрастта понижено p53 (Feng et al., 2007; Goukassian et al., 2000). GH промоторът съдържа р53 място за свързване (Chesnokova et al., 2013), а индуцираното от увреждане на ДНК p53 активира експресията на GH (Chesnokova et al. 2013, 2019a). По този начин нашите резултати показват, че в остарелите органоиди натрупването на увреждане на ДНК индуцира npGH, което от своя страна регулира надолу p53.

Важно е, че тъй като npGH се секретира локално от ДНК-увредени клетки, паракринното действие за секретирания GH върху съседни клетки може да бъде оперативно. Докато съвместно култивирахме GH-експресиращ hNCF с Colon Intestine-Chip, ние наблюдавахме повишено увреждане и пролиферация на ДНК и понижено регулиране на p53/p21 в вградени в чип епителни клетки, изложени на паракринните ефекти на получените от фибробласти. Тези резултати предполагат, че локалното неиндуцирано стареене в човешката тъкан променя тъканната микросреда чрез потискане на туморни супресорни протеини и засилване на епителната пролиферация и увреждане на ДНК.

Резултатите са в съответствие с наблюденията, че лечението с екзогенен GH повишава пролиферативния капацитет, образуването на колонии и метастазите при DJ-1 KO мишки (Chien et al., 2016), и с доказателства, че индукцията на GH в човешки туморни клетки е свързана с прогресията на няколко вида рак (Perry et al., 2017); те съответстват на нашите резултати, показващи по-малко образувания на колонии и по-малък размер на колониите с потискане на GH.

Пътищата за възстановяване на увреждане на ДНК предпазват от хромозомна нестабилност, която задвижва клетъчната трансформация (Negrini et al. 2010). Например, Tip60 активира ATM (Jackson и Bartek, 2009), а ATM, централен регулатор на DDR, фосфорилира и стабилизира p53. Стареещите клетки показват намалено потискане на ATM и p53, както и дисрегулация на възстановяването на ДНК с последващо непоправено увреждане на ДНК (Lan et al., 2019). По този начин в клетките на дебелото черво увреждането на ДНК се натрупва с възрастта (Risques et al., 2008; Schu-macher et al., 2008), поне отчасти поради намаляващата ефективност на DDR (Jackson и Bartek, 2009) и потискането на p53 в отговорът на y-облъчване при стареещи мишки се дължи на свързан с възрастта спад в p53-стабилизиращия ATM (Feng et al, 2007). В нашите експерименти неиндуцираното в отговор на увреждане на ДНК също потиска Tip60, което вероятно е довело до намалено възстановяване на ДНК, както се вижда от атенюираното съответно ATM и p53 фосфорилиране. Тези резултати предполагат, че локалната свръхекспресия на npGH може да допринесе за свързана с възрастта нерегулирана DDR и възстановяване на ДНК. В старите органоиди индукцията на GH отслабва DDR, докато потискането на GH активира DDR, както се вижда от намаленото увреждане на ДНК. Тези резултати са подкрепени от нашите по-ранни наблюдения, че блокирането на сигнализирането на GH в ANCC води до намалено увреждане на ДНК (Chesnokova et al., 2019a). Освен това, ние показваме, че увреждането на ДНК на дебелото черво не се натрупва в насочени към дебелото черво GHRcolKO мишки с изрязан GHR, но се натрупва в тънките черва, където GHR е непокътнат. Тези резултати, заедно с нашата демонстрация, че старите GHR-7-мишки не натрупват увреждане на ДНК на дебелото черво, осигуряват in vivo подкрепа за хипотезата, че локалната индукция на npGH с agemayrender клетки, податливи на трансформация и може би също допринася за резистентност към терапия на рак, като е предложено (Basu and Kopchick, 2019).

Показаните тук резултати също повдигат възможността ефектите на GH да бъдат медиирани от инсулиноподобен растежен фактор 1 (IGF1). За разлика от GH, сигнализирането на IGF1 активира възстановяването на ДНК в нетуморни и туморни клетки (Chesnokova and Melmed, 2020; Chitnis et al., 2014; Turney et al., 2012) и ние показахме, че GH потиска р53 и индуцира ДНК увреждането настъпва независимо от IGF1 в нормалната тъкан на дебелото черво (Ches-nokova et al., 2019a, 2019b). Въпреки това, в клетки и тъкани, в които GH активира IGF1, последният растежен фактор може също да сигнализира по клетъчно-специфичен начин, за да противодейства на действието на GH върху стабилността на генома.

Констатациите предполагат, че npGH, индуциран в стареещата тъкан на дебелото черво в отговор на натрупаното увреждане на ДНК, улеснява по-нататъшното увреждане на ДНК и изглежда е неблагоприятна детерминанта за възстановяването на увреждане на ДНК. Екстраполацията на тези открития осигурява платформа за няколко потенциални клинични приложения. Тъй като натрупването на увреждане на ДНК е отличителен белег на свързаните с възрастта заболявания, насочването към GH сигнализиране за блокиране на автокринни/паракринни ефекти може да се окаже полезно за възпрепятстване на свързаното с възрастта увреждане на епителната ДНК и в крайна сметка за подобряване на прогресията на свързаните с възрастта епителни патологии (Miman et al. ,2016) Такъв подход може също така да е от полза за пациенти с рак, подложени на терапии, увреждащи ДНК, при които промени в епителните полета, породени от автокринни/паракринни, никакво действие не може да увреди нормалната съседна тъкан. В това отношение прекъсването на сигнализирането на GH с одобрен GHR антагонист (List et al., 2011; Trainer et al, 2000) може да осигури клинични ползи. Важно е, че човешкият GH е неподходящо популяризиран като неодобрена терапия против стареене и укрепваща сила (Giordano et al., 2008; Holt and Ho, 2019; Medeiros and Siegel Watkins, 2018; Melmed, 2019). Като се имат предвид вредните паракринни ефекти на npGH, които докладваме тук, дългосрочното неподходящо приложение на GH като еликсир против стареене може да предизвика сигнализиране на GHR и да рискува развитието на увреждане на ДНК на епителните клетки, както и потенциалното активиране на окултни пролиферативни лезии.

Тази статия е извлечена от Cell Reports 37, 110068, 14 декември 2021 г., ª 2021 г. Авторът(ите). 1 Това е статия с отворен достъп под лиценз CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)