Контакт:jerry.he@wecistanche.com

LP Arantes1, ML Machado1, DC Zamberlan1, TL da Silveira1, TC da Silva1, IBM da Cruz1, EE Ribeiro2, M. Aschner3 и FAA Soares1

1Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil 2Universidade Aberta da Terceira Idade, Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM, Brasil

3 Департамент по молекулярна фармакология, Медицински колеж Алберт Айнщайн, Бронкс, Ню Йорк, САЩ

Цистанче има ефект против стареене

Резюме

Гуарана (Paullinia cupana) обичайно се приема от хората в региона на Амазонка и е ключова съставка в различни енергийни напитки, консумирани по целия свят. Удължаването на дълголетието и ниското разпространение на хроничните заболявания, свързани с възрастта, са свързани с обичайния прием на гуарана.Анти-стареенетопотенциалът на гуараната също е демонстриран в Caenorhabditis elegans; обаче механизмите, включени в неговите ефекти, не са ясни. Тук изследвахме предполагаемите пътища, които регулират ефектите на етаноловия екстракт от гуарана (GEE) върху продължителността на живота, използвайки C. elegans. Основните известни пътища на дълголетие бяха анализирани чрез мутантни червеи и RT-qPCR анализ (DAF-2, DAF-16, SKN-1, SIR-2.1, HSF{{6 }}). Възможното участие на пуринергично сигнализиране също беше изследвано. Това проучване показа, че GEE действа чрезантиоксидантактивност, DAF-16, HSF-1 и SKN-1 пътища и човешки аденозин рецепторен ортолог (ADOR-1) за удължаване на продължителността на живота. GEE също понижи skn-1, daf-16, sir-2.1 и hsp-16.2 в 9-дневни C. elegans, което може да отразява по-малка нужда от активиране на тези защитни гени поради прекияантиоксидантефекти. Нашите резултати допринасят за разбирането на ефектите на гуараната in vivo, което може да бъде полезно за предотвратяване или лечение на нарушения, свързани със стареенето, и също така предполагат пуринергично сигнализиране като правдоподобна терапевтична цел за проучвания за дълголетие.

Ключови думи: стареене; антиоксидант; Гуарана; Продължителност на живота; Натурални продукти; Ксантини

Въведение

Paullinia cupana, наричана още гуарана, е местно растение в басейна на Амазонка и особено разпространено в Бразилия. Прахът от семената му се приема обичайно от хора от всички възрасти в региона на Амазонка главно заради тонизиращите и стимулиращи свойства (1). Освен това гуарана е ключова съставка в различни енергийни напитки, консумирани в много страни (2). Други докладвани фармакологични ефекти на гуарана включват загуба на тегло, понижаване на синтеза на тромбоксан в тромбоцитите, защита срещу стомашни лезии, антиоксидантна активност и противовъзпалителни ефекти [за преглед вижте: (1)]. Въпреки това, когато се консумира в излишък, гуарана може също така да повлияе неблагоприятно на човешкото здраве, причинявайки тревожност, нарушения на съня и тахикардия, например, поради високото съдържание на кофеин (2,3).

Удължаването на дълголетието при хората, живеещи в Maués, регион на Amazon в Бразилия, е свързано с амазонската диета, включително обичайния прием на гуарана (4). Освен това, едно епидемиологично проучване свързва поглъщането на гуарана с ниското разпространение на хронични заболявания, свързани с възрастта сред населението на Амазонка (5). Наскоро проучване също демонстрирапротив стареенепотенциал на екстракта от семена на гуарана в Caenorhabditis elegans (6). Въпреки това, механизмите, които са в основата на ефектите на гуараната върху стареенето, не са идентифицирани.

C. elegans е подходящ модел за разбиране на реакциите на организма към различни синтетични и природни съединения и тяхното влияние върху стареенето и продължителността на живота. Жизненоважните биологични пътища и множество аспекти на стареенето са аналогични при нематодите и бозайниците, включително хората (7).

Тъй като процентът на възрастните хора нараства в световен мащаб, съпроводен с повишена честота на свързаните с възрастта заболявания, от съществено значение е да се идентифицират ефикасни терапии и терапевтични цели, които могат да подобрят качеството на живот (8). Тук изследвахме предполагаемите пътища, които регулират ефектите на гуарана върху продължителността на живота, използвайки C. elegans.

Материали и методи

Химикали

Агар, етанол (96 процента), хлороформ, холестерол, FUDR (5-флуоро-20-деоксиуридин), протеазен инхибитор, коктейли от фосфатазен инхибитор, праймери за полимеразна верижна реакция (PCR) и говежди серумен албумин (BSA) са закупени от Sigma (САЩ). Праймерите TaqMans, използвани за qRT-PCR анализ и Trizol бяха закупени от Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific Corporation (САЩ). Всички други реагенти са закупени от Synth (Бразилия).

Щамове и поддръжка

Щамове, използвани в това изследване, са Bristol N2 (див тип); CB1370, daf-2 (e1370) III; CF1038, daf-16 (mu86) I; EU1, skn-1(zu67); PS3551, hsf-1(sy441) I; TK22, mev-1(kn1); и VC199, sir-2.1(ok434), получени от Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Университет на Минесота, САЩ, както и Escherichia coli OP50. EG6890 щам, ador-1 (ox489), беше любезно доставен от лабораторията на д-р Ерик Йоргенсен (Университет на Юта, САЩ). Този щам има делеция от 1 kb нагоре по веригата и първите три екзона на ador-1 гена и е кръстосван 6 пъти; ador-1 генът кодира ортолог на човешки аденозин рецептор (9).

Нематодите се поддържат и анализират при 20 градуса върху агарови плаки със среда за растеж на нематоди (NGM), носещи морава от Е. coli OP50 (10). Синхронизирането на нематодните култури се постига чрез избелващо третиране на бременни хермафродити и яйцата се оставят да се излюпят за една нощ в М9 буфер (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8,5 mM NaCl и 1 mM MgSO4) (10).

Растителен материал и препарат за екстракт

Прахът от препечени семена на Paullinia cupana Kunth var. sorbilis (Mart.), гуараната, е изолирана и доставена от EMBRAPA Oriental (Agropecuary Research Brazilian Enterprise), разположена в Западна Амазонка в Maués, Amazonas, Бразилия. Хидроалкохолният екстракт се получава, както е описано другаде (11). Накратко, екстрактът се получава с помощта на 70 процента етанол. След 24 часа полученият разтвор се филтрува, етанолът се отстранява и екстрактът се лиофилизира. Преобладаващите ксантини и катехини, представени в екстракта от гуарана, бяха анализирани с помощта на HPLC, показвайки следните концентрации: кофеин=12.240 mg/g, теобромин=6.733 mg/g и общи катехини{{ 9}}.336 mg/g (11).

Лечение на глисти

NGM плочи, носещи морава от Е. coli OP50 (като източник на храна), преди това бяха инкубирани при 37 градуса за една нощ. Лиофилизиран етанолен екстракт от гуарана (GEE) се разтваря в студена дестилирана автоклавирана вода (121 градуса, 30 минути) и се разстила върху плочите при крайни концентрации от 100, 500 и 1,000 mg/mL агар. Синхронизирани L1 ларви (10) се прехвърлят с пипета към повърхността на третираните плаки и се култивират до зряла възраст при 20 градуса.

Продължителност на живота

Анализите на продължителността на живота започнаха при L4 ларви в NGM плаки, посяти с E. coli OP50 в отсъствие или присъствие на GEE (ден 0). Животните се прехвърлят в свежи плаки със или без GEE през ден, за да се избегне объркване на поколенията, и се оценяват по едно и също време до смъртта. Липсата на отговор на механичен стимул се оценява като смърт. Червеите бяха цензурирани, ако изпълзяват от чинията, показват екструдирани вътрешни органи или умират поради излюпване на потомство в матката. Анализите на продължителността на живота бяха повторени три пъти с 60–120 червеи на анализ. Чрез мутантни щамове бяха анализирани основните известни пътища на дълголетие (12,13): i) daf-2 и daf-16, инсулин/инсулиноподобен растежен фактор (IGF){{11} } сигнализиране (IIS), което DAF-2 рецепторът сигнализира чрез запазен път на PI3-киназа/АКТ и регулира надолу DAF-16/FOXO, отговорен за насърчаване на експресията на гени, които придават удължено дълголетие и повишена устойчивост на стрес; ii) skn-1, който е свързан с протеини от семейство Nrf на гръбначни и насърчава експресията на ензими за детоксикация в отговор на оксидативен стрес, като глутатион-S-трансфераза; iii) sir-2.1, който кодира протеин, подобен на хистон деацетилаза, който интегрира метаболитния статус с продължителността на живота и е свързан с калорийното ограничение; и iv) hsf-1, който кодира фактора на транскрипция на топлинен шок -1 (HSF-1) и индуцира активиране на различни гени на топлинен шок или шаперони, участващи в поддържането на конформационната хомеостаза на протеини наред с други важни функции. Възможна връзка между дълголетието и пуринергичното сигнализиране също беше изследвана чрез ador-1 мутантен щам.

Тъй като бактериите играят роля в смъртността на C. elegans, растежът на E.coli OP50 беше оценен в присъствието или отсъствието на GEE, за да се проучи дали благоприятните ефекти могат да бъдат отговор на антимикробно свойство. Абсорбцията на бактериите се измерва по време на 12-h период в течна среда (14).

Продължителност на здравето

Бяха оценени параметрите на поведение, свързани с продължителността на здравето (15). Фарингеалното изпомпване беше оценено с микроскоп Nikon E200 чрез наблюдение на броя на фарингеалните контракции по време на интервал от 60-s при млади възрастни индивиди от див тип.

Честотата на ударите беше избрана за анализ на движението. Млади индивиди от див тип от контролни или GEE третирани бяха индивидуално избрани и поставени в капка M9. Червеите бяха оставени да се адаптират за 1 минута и след това броят на ударите беше количествено определен с микроскоп Nikon E200 по време на интервал от 20- s. Траш се определя като промяна в посоката на огъване в средата на тялото.

Анализите бяха извършени в три независими анализа. Тридесет нематоди бяха изследвани на група.

Изолиране на РНК и полимеразна верижна реакция в реално време (RT-qPCR)

Див тип червеи в 9-дневни възрастни червеи бяха анализирани за генна експресия, свързана с дълголетието и реакциите на оксидативен стрес. След зряла възраст червеите се прехвърлят през ден в плочи, съдържащи 150 mM FUDR (5-флуоро-20-деоксиуридин), за да се инхибира възпроизвеждането, в присъствието или отсъствието на GEE. РНК от 20 000 червея за състояние се изолира с помощта на Trizol, последвано от екстракция с хлороформ, както е описано по-горе (16) и 1 mg от входящата РНК се транскрибира обратно в сДНК от комплект за обратна транскрипция на сДНК с голям капацитет на Applied Biosystems (Applied Biosystems , САЩ). Анализът на експресията беше извършен чрез Custom TaqMans Array анализ, използвайки съответните анализи на TaqMans Gene Expression за митохондриална супероксид дисмутаза sod-3 (Ce02404515_g1), глутатион-S-трансфераза gst-4 (Ce{ {16}}g1), гама глутамилцистеин синтетаза gcs-1 (Ce02436726_g1), daf-16 (Ce02422835_g1), сър-2.1 (Ce02 459018_g1), hsf-1 (Ce02423758_m1), протеин на топлинен шок hsp-16.2 (Ce02506738_s1) и skn{ {35}} (Ce02407445_g1) (Приложни биосистеми). Експресията на целевия ген беше нормализирана до стойностите на експресията на актин afd-1 (Ce02414 573_m1). Относителната експресия на всеки ген се определя чрез метода 2 DDCt (17) и данните се докладват като многократна промяна в нивата на иРНК спрямо afd-1. Този експеримент беше проведен в три независими препарата от червеи, всеки в три екземпляра.

Статистически анализ

Статистическите анализи бяха извършени с помощта на GraphPad Prism версия 5 за Windows (GraphPad Software, САЩ). Резултатите се отчитат като средни стойности ±SD от най-малко три отделни експеримента. T-тестът на Student беше използван за сравняване на двойки групи, докато еднопосочен или двупосочен ANOVA, последван от post hoc теста на Bonferroni, беше използван за сравняване на три или повече групи. Всички криви на оцеляване бяха анализирани чрез логаритмичен ранг (Mantel-Cox) тест. Статистическата значимост се определя като Po0.05.

Резултати

В нашето проучване контролният див тип C. elegans има средна продължителност на живота от 11 дни и максимална продължителност на живота от 14 дни. В среда, съдържаща GEE, средната продължителност на живота на червеи от див тип е удължена до 13 дни при 100 mg/mL (18 процента) и до 15 дни при 500 и 1,000 mg/mL (36 процента). Максималната продължителност на живота е удължена средно с 28 процента при трите тествани концентрации (Таблица 1). Нямаше разлика в растежа на E. coli в присъствието или отсъствието на 1,000 mg/mL GEE (данните не са показани).

Продължителността на здравето на червеите също беше удължена след лечение с GEE. Екстрактът забави свързаното с възрастта намаляване на фарингеалното изпомпване (100, 500 и 1,000 mg/mL) и ударите (1,000 mg/mL), започващи на 9-ия ден от зряла възраст ( Фигура 1 A и B). Съответно, концентрацията от 1,000 mg/mL GEE и проби от 9-дневни възрастни червеи бяха избрани за по-нататъшен анализ.

GEE екстракт (1,000 mg/mL) удължава средната продължителност на живота на mev-1 мутанти с 44 процента и максимална продължителност на живота със 77,8 процента (Таблица 1), показвайки връзка междуантиоксидант

Анализите на продължителността на живота са извършени при 20 градуса. Максималната продължителност на живота е представена като средната продължителност на живота на най-дълго живеещите 10 процента от популацията на червеите. Всеки експеримент се повтаря три пъти, започвайки с най-малко 60 нематоди на група. Данните се докладват като средна стойност ± SD. *Po0,05 в сравнение с нетретираната група (логаритмичен рангов тест на Mantel-Cox).

Фигура 1. Ефекти на етаноловия екстракт от гуарана (GEE) върху поведенческите параметри, свързани със здравето. Скорост на фарингеално изпомпване (A) и

честота на удар (B) по време на стареене при див тип червеи. Данните са докладвани като средно ±SD (n=30 червеи на група). *P o0.05 в сравнение с контролата (еднопосочен ANOVA, последван от тест за множествено сравнение на Bonferroni.

ипротив стареенедейности. Екстрактът също удължава средната продължителност на живота на daf-2 и sir 2.1 мутанти, установявайки, че екстрактът не действа по тези пътища, за да насърчи удължаването на продължителността на живота. Обратно, лечението не удължи продължителността на живота на daf-16, skn-1, hsf-1 и ador-1 мутанти (Таблица 1).

PCR анализите оценяват генната модулация чрез GEE (Таблица 2). GEE при 1,000 mg/mL надолу регулиран skn-1, daf-16, сър-2.1 и hsp-16.2 в {{9 }}еднодневни възрастни. Не е наблюдаван ефект върху експресията на hsf-1, gst-4, gcs-1 и sod-3.

Дискусия

Както беше демонстрирано по-рано (1), в нашето проучване екстрактът от гуарана също удължи продължителността на живота и здравословното състояние на C. elegans от див тип. По този начин предполагаемите пътища, които могат да бъдат замесени в негопротив стареенеефектите са изследвани. тук,против стареенеефектите са показани при по-висока концентрация на екстракта (1,000 срещу 300 mg/mL, както е показано по-рано). Това несъответствие може да се дължи на разлики в приготвянето на екстракта (хидроалкохолен срещу воден екстракт)

Таблица 2. Сгъваема промяна на експресията на мРНК на гени, свързани с дълголетието и оксидативния стрес в див тип 9-дневни възрастни червеи, третирани с етанолов екстракт от гуарана (GEE)

Този експеримент беше оценен чрез RT-qPCR и проведен в три независими препарата от червеи, всеки в три екземпляра. Данните се докладват като средства за многократна промяна в нивата на иРНК спрямо afd-1 (актин) ±SD. *Po0.05 в сравнение с нетретирани (двупосочен ANOVA, последван от теста за множествено сравнение на Bonferroni).

и метод на доставяне (агар срещу течна среда) и може да е резултат от естествено отклонение в генетичните вариации в популацията на червеите (18,19).

Оксидативният стрес изглежда е основен фактор, ограничаващ продължителността на живота както при C. elegans, така и при хората и е свързан с много заболявания, свързани с възрастта (20, 21), което насочва вниманието къмантиоксидантсъединения с ефекти in vivo. За по-нататъшно проучване дали GEE може да удължи живота чрезантиоксидантбеше оценен ефектът му върху червеите mev-1. Този щам се характеризира със свръхпроизводство на супероксид и има по-кратък живот в сравнение с див тип щам (22). В съответствие с описаното по-гореантиоксидантефектите на екстракта от гуарана (6), лечението с GEE значително удължава средната и максималната продължителност на живота на червеите mev-1.

Освен това пътищата DAF-16, HSF-1 и SKN-1, включени в сигнализирането на инсулин/IGF (IIS), изглеждат от съществено значение за GEE-медиираното удължаване на живота. Намаленият IIS се свързва с дълголетие и адаптиране към неблагоприятни условия на околната среда при C. elegans, Drosophila, бозайници и вероятно хора (13). HSF-1 функционира в сътрудничество с DAF-16, за да активира експресията на общи целеви гени, включително семейството на sHsp (малки гени на протеини от топлинен шок) (23). SKN-1/Nrf интегрира IIS и регулира отговора на оксидативния стрес и експресията на гени за детоксикация (24).

DAF-16, HSF-1 и SKN-1 могат също така да опосредстват удължаването на продължителността на здравето и протеиновата хомеостаза (25). DAF-16 участва в образуването на по-малко токсични протеинови агрегати с високо молекулно тегло (26) и въпреки че HSF-1 регулира активността на дезагрегация на протеини, освобождавайки малки токсични агрегати, той може да има благоприятен ефект, допринасяйки за клирънс на протеин чрез ензимен метаболизъм (27,28). SKN-1 е най-известен като регулатор наантиоксиданти ксенобиотична защита, но също така е замесен в допълнителни функции, които включват протеостаза и метаболитна регулация (24).

Метилксантините, както и кофеинът, са основните компоненти на гуарана и е добре известно, че тези съединения могат да действат чрез аденозинови рецептори при бозайници (29). Кофеинът се свързва с благоприятни ефекти, включително ефекти, свързани със стареенето (30, 31) и подобряване на фенотипове на когнитивно увреждане чрез антагонизиране на аденозиновите рецептори A1 и A2A при гризачи (32). По този начин тествахме дали индуцираното от GEE удължаване на живота може също да зависи от ADOR-1, хомолог на аденозин рецептор (33). Нашите резултати показват, че червеите ador-1(ox489) не са успели да покажат удължен живот, демонстрирайки за първи път възможна роля на пуринергичната система за удължаване на живота. Съответно, пуринергичното сигнализиране може да бъде изгодно проучено в бъдеще като потенциална цел за модулиране на дълголетието.

Въпреки че GEE има високи нива на кофеин и предишни проучвания описват ефектите на кофеина върху червеите (34–36),против стареенеефектите на GEE могат да бъдат свързани със синергични ефекти на различни съединения. Концентрацията на кофеин в екстракта е много по-ниска от ефективната концентрация, демонстрирана по-рано и беше показано, че алкалоидният екстракт от гуарана няма същите полезни ефекти (6). Освен това данните от литературата показват, че екстрактите могат да имат по-голяма фармакологична активност от изолираните съединения (37,38).

Понижаването на skn-1, daf-16, sir-2.1 и hsp-16.2 в 9-дневни C. elegans, третирани с GEE, може да отразяват по-малка нужда от активиране на тези гени за възстановяване на клетъчните увреждания по време на стареенето в сравнение с нетретираните червеи, възможно поради директниантиоксидантефекти, упражнявани от екстракта (39,40).

По този начин това проучване показа, чепротив стареенеефектите на гуарана се медиират отантиоксидантактивност и пътища на DAF-16, HSF-1 и SKN-1. В допълнение, ADOR-1 също е необходим за ефектите на GEE върху продължителността на живота, което показва възможно участие на пуринергичната система в дълголетието. Нашите резултати допринасят за разбирането на ефектите на гуараната in vivo, което може да бъде полезно за предотвратяване или лечение на нарушения, свързани със стареенето, и предполагат пуринергично сигнализиране като правдоподобна терапевтична цел за проучвания за дълголетие.

Благодарности

Авторите са благодарни на Caenorhabditis Genetics

Център (CGC) към Университета на Минесота, САЩ за предоставяне на щамове червеи и на лабораторията на д-р Ерик Йоргенсен (Университет на Юта, САЩ) за любезното предоставяне на щама EG6890. Това проучване беше подкрепено от Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientíco e Tecnológico, Бразилия (CNPq), Coordenac¸ão de Aperfeic¸oamento de Pessoal a Nível Superior, Бразилия (CAPES), PRONEM/FAPERGS/ CNPq и MCTI/CNPq #472669/{{ 3}} и #475896/ 2012-2. Майкъл Ашнер беше подкрепен частично от грант R01 ES10563 на NIH. Източниците на финансиране не са включени

в дизайна на изследването или интерпретацията на данни.