Мета-анализи идентифицират метилирането на ДНК, свързано с бъбречната функция и увреждане

edmund.chen@wecistanche.com

Хроничназаболяване на бъбрецитее голяма тежест за общественото здраве. Повишеното съотношение албумин към креатинин в урината е мярка заувреждане на бъбреците,и се използва за диагностициране и стадиране на хроничнизаболяване на бъбреците. Да се ​​разширят знанията за регулаторните механизми, свързани сбъбречна функцияи заболяването, ние проведохме изследване на асоциацията на епигенома на базата на кръвта за очакваната скорост на гломерулна филтрация (n=33,605) и съотношението албумин към креатинин в урината (n=15,068) и открихме 69 и седем CpG места, където метилирането на ДНК е свързано със съответната черта. По-голямата част от тези констатации показват насочени последователни асоциации със съответните клинични резултати от хроничниязаболяване на бъбрецитеи умерено повишена албуминурия. Асоциации на ДНК метилиране сбъбречна функция, като CpG при JAZF1, PELI1 и CHD2 бяха валидирани вбъбречна тъкан. Метилирането при PHRF1, LDB2, CSRNP1 и IRF5 показва причинно-следствени ефекти върхубъбречна функция. Анализите на обогатяване разкриват пътища, свързани с хемостаза и миграция на кръвни клетки за изчислена скорост на гломерулна филтрация и активиране на имунни клетки и отговор за CpGs, свързани със съотношението албумин към креатинин в урината.

Ключови думи:заболяване на бъбреците; увреждане на бъбреците; бъбречна функция; бъбречна тъкан; структура на бъбреците

хроничензаболяване на бъбреците(CKD) е голяма тежест за общественото здраве. Засяга повече от 10 процента от възрастните по света и повече от 40 процента от хората на възраст над 70 години1,2. ХБН е водеща причина за смърт в световен мащаб3 и има основен принос за сърдечно-съдовата заболеваемост и смъртност2,4,5. ХБН се определя като продължително наличие на аномалии набъбрекструктура или функция. Theбъбречна функциянай-често използваните мерки са скоростта на гломерулна филтрация, обикновено изчислена от концентрациите на серумния креатинин (eGFR), и съотношението албумин към креатинин в урината (UACR)6. Повишеният UACR е мярка заувреждане на бъбреците, използван за диагностициране и стадий на ХБН7 и се свързва с диабет и хипертониязаболяване на бъбреците8. Дори умерено повишен UACR е рисков фактор за сърдечно-съдови заболявания, независимо от другибъбречна функция markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >400 генетични локуса, които са свързани сбъбречна функция10,12,13. Вариантите на индекса при известни локуси, свързани с eGFR, обясняват приблизително 8,9 процента от вариацията на eGFR12.Скорошен мета-анализ на GWAS на eGFR интегрира отворени хроматинови региони с малки набори от единични нуклеотидни полиморфизми (SNPs)10. Резултатите от това проучване подкрепят значението на променената транскрипционна регулация като механизъм, допринасящ за ХБН. Да се ​​изследва метилирането на ДНК по отношение набъбречна функцияса проведени проучвания за асоцииране в целия епигеном (EWAS) на eGFR и CKD. Като ключов регулатор на транскрипцията, който може да бъде оценен по рентабилен и високопроизводителен начин, ДНК метилирането е изследвано в CpG места (CpGs) с разделителна способност с една база. Преди това проведохме EWAS, включващо 4859 възрастни от две популационни проучвания и идентифицирахме 18 валидирани, диференциално метилирани места в цяла кръв, свързани с eGFR14. Въпреки че това проучване разкрива прозрения за генните регулаторни механизми набъбрекфункция, свързаните CpG обясняват само 1,2 процента от вариацията на eGFR. Други предишни проучвания бяха фокусирани върху пациенти с ХБН и/или пациенти с диабет или пациенти с инфекция с човешки имунодефицитен вирус, или бяха ограничени от малък размер на извадката, липса на репликация, липсваща корекция за потенциални объркващи фактори или комбинация от тях14–19. Други изследвания се фокусират върху моделите на ДНК метилиране на диабетицизаболяване на бъбреците(DKD) пациенти20–22.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНО/БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ

Тук проведохме EWAS набъбречна функциячерти за идентифициране на допълнителни CpG, свързани с генни регулаторни механизми с потенциално значение за ХБН. Разширихме предишния EWAS за eGFR и CKD, като увеличихме значително размера на извадката до 33 605 индивида. Освен това, ние включихме UACR и умерено повишена албуминурия (микроалбуминурия) като допълнителни характеристики. EWAS са проведени в предимно базирани на населението проучвания, коригиращи за пол, възраст, диабет, хипертония, индекс на телесна маса (ИТМ), статус на тютюнопушене и най-разпространените пропорции на белите кръвни клетки. Репликирахме нашите резултати от EWAS в отделни проби, свързахме CpG сайтовете с нивата на генна експресия в различни тъкани, приложихме констатациите към клиничните резултати и оценихме причинно-следствената връзка между метилирането на ДНК ибъбречна функция(Допълнителна фигура 1).

Резултати

Проучете характеристиките на извадката. В това разследване 36 проучвания с общо 33 605 участници допринесоха за EWAS на eGFR и 15 068 за EWAS на UACR. Техните сборни характеристики са показани в таблица 1, а описанията на отделните изследвания са предоставени в допълнителни данни 1 и 2.

EWAS на eGFR и UACR.Разследвахме асоциацията набъбрекчерти с ДНК метилиране в кръвта при до 441 870 CpGs, припокриването на CpGs, обхванати от Illumina MethylationnEPIC BeadChip и Illumina HumanMethylation450 BeadChip array, които бяха използвани за измерване от всички проучвания с изключение на едно (допълнителни данни 3). Всички проучвания извършиха почистване на масиви от данни и приложиха централно разработени скриптове за подготовката набъбрекстойности на признаци, които впоследствие бяха свързани с метилиране на ДНК, като се използват модели на линейна регресия, коригирани с ковариат, със стойности на метилиране като зависима променлива, следвайки предварително определени протоколи за изследване (вижте Методи). Наблюдавахме никаква или малка инфлация в специфичното за проучването EWAS (eGFR средно инфлация=1.00, UACR средно инфлация=1.00, допълнителни данни 1 и 2). В многопроменливо коригиран трансетнически EWAS, 69 CpGs бяха значително свързани с eGFR и репликирани (Фиг. 1A, Допълнителни данни 4, вижте Методи), включително докладваните по-рано14. Репликираните места показват ясен модел на по-ниско метилиране (60 CpGs, Pbinom=2.2E−10; Фиг. 1A).

Фиг. 1 Резултати от EWAS за eGFR и UACR. Графики от Чикаго на резултатите от изследването на епигеномната асоциация (EWAS) за изчислена скорост на гломерулна филтрация (eGFR) (A) и съотношение албумин към креатинин в урината (UACR) (B), като се използва комбинираната проба за откриване и репликация. Местата са подредени по тяхната хромозомна позиция на оста x, като тяхната –log10 P-стойност на асоциирания Wald-тест е предоставена на оста y. CpGs, положително корелирани с чертата, са изобразени в горната част, сайтове с отрицателна корелация в долната част. Пунктираните хоризонтални линии представляват нивото на значимост (P-стойност <1.1e−7). нови="" репликирани="" сайтове="" са="" оцветени="" в="" оранжево,="" известни="" репликирани="" сайтове="" са="" оцветени="" в="" тюркоаз,="" а="" сайтовете,="" които="" са="" били="" допълнително="" свързани="" със="" съответния="" бинарен="" признак="">заболяване на бъбреците[CKD]/ микроалбуминурия [MA]) са маркирани с кръст.

В мета-анализа най-ниските P-стойности са наблюдавани за известни eGFR асоциации, включително cg17944885 (ZNF788,=−1.75E−04, P-стойност=8.7E−41), cg23597162 (JAZF1 ,=−1.48E−04, P-стойност=3.2E−24) и cg06158227 (ZSCAN29,=−1.08E−04, P-стойност=8 .7E−20)14, последвано от ново намиране на cg20777437 (CDCP2,=−8.28E−05, P стойност=1.1E−17). 69 репликирани eGFR-свързани CpGs сами по себе си обясняват 15,7 процента от вариацията на eGFR в отделна извадка от 1888 участници (вижте Методи). При добавяне на всички ковариати (пол, възраст, диабет, хипертония, ИТМ, тютюнопушене и пропорции на белите кръвни клетки) към модела на асоцииране, общият дял на обяснената вариация в eGFR се увеличава до 36,3 процента, с 2,4 процента вариация, приписана на 69 CpGs независимо от другите ковариати.

В трансетническия анализ на UACR, седем CpGs бяха значително свързани и репликирани (Фиг. 1B, Допълнителни данни 5, вижте Методи). От констатациите, cg18181703 (SOCS3,=−2.58E−03, P-стойност=2.6E−13) и cg02711608 (SLC1A5,=−1.63 E−03, P-стойност=9.9E−13) имаше най-малките P-стойности на асоциацията на мета-анализа. При шест от седемте CpG по-ниското метилиране се свързва с по-висок UACR. Поради броя на репликираните сайтове, мощността на биномния тест беше ограничена (6 CpGs, pbinom=0.13; Фиг. 1B). Репликираните CpG обясняват 3,9 процента, а пълният модел 14,6 процента от вариацията в нивата на UACR, като 0,07 процента се приписват на CpG независимо от другите ковариати.

Имаше ниско припокриване между репликирания EWAS и докладваните по-рано локуси на GWAS както за eGFR (припокриване=10 от 69; допълнителни данни 4), така и за UACR (припокриване=1 от 7; допълнителни данни 5). Нямаше припокриване на репликирани CpGs между eGFR и UACR, което показва специфични за признака профили на ДНК метилиране в кръвта. Дори сред 967 и 270 предполагаеми асоциации (P-стойност <1e−05) на="" комбиниран="" мета-анализ="" на="" проба="" за="" откриване="" и="" репликация="" за="" egfr="" и="" uacr,="" съответно,="" само="" 10="" места="" се="" припокриват="" между="" двете="" черти.="" подробните="" резултати="" от="" тези="" мета-анализи="" за="" всички="" предполагаеми="" асоциации="" са="" предоставени="" в="" допълнителни="" данни="" 6="" (egfr)="" и="" 7="">Хетерогенност на предците и устойчивост на констатациите. За да преценим дали резултатите от асоциирането на eGFR и UACR може да се дължат на специфично потекло, направихме стратифициран по потекло EWAS мета-анализ на проби от европейско потекло (EA) и афро-американско потекло (AA) с резултати от множество проучвания, допринасящи за тези две етноси. Сравнение на резултатите от асоциирането на репликираните CpGs в проби от EA (Negar=23,671; nUACR=9806) с AA проби (neGFR =

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >{{0}}.05) в или в рамките на 50 bp от 69 репликирани CpGs беше оценено, за да се прецени дали присъствието на SNP може да повлияе на свързването на сондата. Четири сонди бяха разположени близо до общ SNP (допълнителни данни 4; cg10960375-rs113564504; cg11544657-rs2083577; cg01817897-rs142643977; cg06930757-rs112223111), който обаче не са били свързани с нито една черта на GWAS според ресурса PhenoScanner V2 (достъпен на 12.02.2021 г., pGWAS < 5e−8,="" включително="" прокси="" snp="" с="" eur="" r²=""> 0,8)23. Това показва, че е малко вероятно резултатите от EWAS да бъдат объркани от обща черта, за която е известно, че е свързана сбъбречна функциячрез близка вариация на ДНК последователност. Вътрешните SNPs на сондата, които са повече от пет бази от 3'-края на сондата, обикновено се оказват с незначителни последствия24.

Връзка с ХБН и микроалбуминурия.От 69 CpG, свързани с eGFR, 53 също са свързани с преобладаваща ХБН в мета-анализ на 25,609 индивида, включително 2376 случая с последователна посока на ефекта (P-стойност < 0).="" 05/69;="" допълнителни="" данни="" 4,="" допълнителна="" фигура="" 3a).="" корелацията="" между="" ефектите="" на="" egfr="" и="" ckd="" беше="" висока="" (r="−0,93;" фиг.="" 3a).="" в="" независима="" кохорта="" от="" 551="" пациенти="" с="" хбн,="" 65="" cpg="" са="" насочено="" в="" съответствие="" с="" мета-анализа="" на="" egfr="" и="" пет="" са="" повторени="" (p-стойност=""><0,05 9,="" r="0.77;" допълнителна="" фигура="" 4,="" допълнителни="" данни="" 4,="" вижте="" методи).="" в="" същата="" кохорта,="" свързаните="" с="" egfr="" cpgs="" cg18194850="" (p-стойност="1.6E−5)" и="" cg07242931="" (p-стойност="2.3E−5)" също="" бяха="" свързани="" с="" времето="">бъбречна недостатъчностили остърувреждане на бъбреците(Допълнителни данни 8, вижте Методи). Всичките седем CpGs, свързани с UACR, също бяха значително свързани с микроалбуминурия в проба от 7279 индивида, включително 1186 случая със същата посока на ефект като за UACR (P-стойност < 0.05/7,="" r="" {{7}="" }.98;="" фигура="" 3b,="" допълнителни="" данни="" 5,="" допълнителна="" фигура="">

Корелация с генната експресия. За да получим представа за възможните функционални механизми на свързаните с eGFR и UACR CpGs, тествахме корелацията на техните нива на ДНК метилиране с нивата на иРНК на гени, кодирани в cis в цяла кръв, както и в кръвни моноцити (вижте Методи, Допълнителни данни 9 ). Известният eGFR-асоцииран cg17944885 на хромозома 19 близо до ZNF788 беше свързан с транскрипта, кодиран от 240 kb отдалечен протеин цинков пръст 439 (ZNF439, Таблица 2). В допълнение, метилирането на cg04864179 при интерфероновия регулаторен фактор 5 (IRF5) се свързва както с транскриптите на mRNA, кодирани от IRF5, така и с близкия транспортин 3 (TNPO3) (допълнителна фигура 5A). От асоциациите на UACR, двата репликирани CpGs cg02711608 и cg22304262 при член на фамилия 1 на разтворени носители 5 (SLC1A5) разкриват значителни асоциации с нивата на SLC1A5 mRNA и cg23570810 при индуцирания от интерферон трансмембранен протеин 1 (IFITM1) с неговите транскрипти в cis (Таблица 2). Всички резултати от анализа на генната експресия са предоставени в допълнителни данни 9.

Ефекти върху бъбречната тъкан.За да се оцени дали наблюдаваните ефекти на метилиране в кръвта се превеждат вбъбречна тъкан,ние приложихме регресионен модел, за да тестваме асоциациите на репликираните CpGs за значима (процент на фалшиви открития (FDR) < 0.05) и последователна връзка с eGFR ибъбрекфиброза, съответно при 506 микродисектиранибъбречна тъканмостри. В тези проби,бъбрек-тъканно-базирано ДНК метилиране на репликирани eGFR-свързани CpGs cg23597162 при JAZF1, cg26099045 близо до PELI1 и cg12644285 при CHD2 са значително свързани с eGFR със същата посока на ефекта, както в кръвта (допълнителна фигура 6A, таблица 2, допълнителни данни 10) . Освен това, същият CpG при PELI1 и шест допълнителни

сайтове (cg20146909 при LRRC8D, cg25767870 близо до FAM46C, cg16618493 при ZBTB7B, cg10632966 близо до RPEL1, cg01068906 при NOD2 и cg03297731 при GDPD3) са свързани с фиброза вбъбректъканни проби с последователни (т.е. обратни) посоки на ефекта (допълнителна фигура 6B, таблица 2). От репликираните UACR сайтове нивата на метилиране на ДНК вбъбректъкан на cg00008629 при PTBP3 и cg24859433 близо до IER3 са свързани с фиброза и показват същата посока на ефект (допълнителна фигура 6D, таблица 2). В съответствие с констатациите на EWAS, не е открита значителна връзка на свързаните с UACR CpGs с eGFR в донорите на бъбречни проби (допълнителна фигура 6C, допълнителни данни 10).

Причинно-следствени ефекти между метилирането на ДНК ибъбречна функциячерти. За да се прецени далибъбречна функциячерти каузално влияят на метилирането на ДНК или обратното, ние проведохме двупосочен двупосочен анализ на менделска рандомизация (MR) на значително свързаните CpG. Анализът на МР в посока в посока предполага, че CpGs cg02304370 (PHRF1), cg04460609 (LDB2), cg00501876 (CSRNP1) и cg04864179 (IRF5) причинно влияят върху нивата на eGFR (Таблица 3). Оценките за наследственост на тези четири CpG варират между трите набора от данни от популации от европейски произход, но са постоянно по-високи от средната наследственост за всички CpG, оценени във всяко от трите проучвания: 0,34 (каузални eGFR CpG) срещу 0,16 (HM450K масив) въз основа на Hannon et al.25, 0,55 срещу 0,19 за Dongen et al.26 и 0,51 срещу 0,19 за McRae et al.27. Не са идентифицирани значими причинно-следствени връзки за свързани с UACR CpG. За обратната MR, единственият значителен ефект е този на eGFR върху cg23597162 (JAZF1), когато се използва методът на първичната обратна вариация. Въпреки това, не са идентифицирани/наблюдавани значими ефекти при множеството обратни анализи на MR на чувствителността. Анализите с изоставяне на един не показват никаква индикация, че резултатите от МР могат да бъдат управлявани от един SNP. Освен това, изключвайки SNP, които са били свързани със захарен диабет тип 2, са основен рисков фактор зазаболяване на бъбрецитене доведе до различни констатации. Резултатите за всички първични и чувствителни МР анализи са показани в Допълнителни данни 11 и 12 и Допълнителна фигура 7. Анализите на чувствителността подкрепят първичните констатации на значимите предни МР резултати (FDR < 0.05,="" вижте="" методи)="" с="" оценки="" на="" последователен="" ефект,="" показващи="" потенциални="" причинно-следствени="" връзки="" от="" днк="" метилиране="" към="" egfr,="" но="" не="" и="">

Анализи на свързване на транскрипционен фактор, маркиране на хистони и обогатяване на пътя. Извършихме анализи на мястото на свързване на транскрипционния фактор, хистонната маркировка и обогатяването на пътя въз основа на 967 CpGs, които показаха сугестивна връзка с eGFR (P-стойност <1e−05; допълнителни="" данни="" 6)="" и="" 270="" cpgs,="" които="" показаха="" сугестивни="" асоциации="" с="" uacr="" (p-стойност="">< 1e−5;="" допълнителни="" данни="" 7)="" в="" мета-анализа="" за="" максимизиране="" на="" статистическата="" сила="" на="" анализите="" на="" обогатяване="" (вижте="" методи)="" 14="" първо,="" ние="" оценихме="" дали="" свързаните="" с="" egfr="" cpg="" преференциално="" са="" картографирани="" към="" местата="" на="" свързване="" на="" 169="" транскрипционни="" фактора="" (tfs)="" на="" базата="" на="" хроматин="" данни="" за="" имунопреципитация="" на="" днк="" секвениране="" (chip-seq)="" от="" проекта="" encode,="" които="" бяха="" събрани="" чрез="" консенсусни="" разговори="" в="" 91="" типа="" човешки="" клетки="" (161="" tf="" следи)="" и="" допълнени="" с="">бъбрекбазирани на тъкани следи (вижте Методи). След множество корекции при тестване за 169 TFs, осем TFs показват значително обогатяване за eGFR-асоциирани CpGs (FDR < 0.05;="" фиг.="" 4a,="" допълнителни="" данни="" 13),="" включително="" cebpb="" (p-стойност="1)." 75e−06,="" кръстосано="" тъканно="" трасе)="" и="" ep300="" (p-стойност="7.49E−09," кръстосано="" тъканно="" трасе).="" това="" е="" в="" съответствие="" с="" констатацията="" от="" chu="" et="" al.14="" в="" по-малка="" подгрупа="" от="" 4859="" участници="" от="" 33="" 605="" участници,="" анализирани="" тук.="" свързаните="" с="" uacr="" cpg="" бяха="" обогатени="" в="" местата="" на="" свързване="" на="" 56="" tfs="" (фиг.="" 4b,="" допълнителни="" данни="" 14)="" с="" най-силна="" връзка="" за="" polr2a="" (p-стойност="6.93E−19)," fos="" (p-стойност="" {{32="" }}.28e−12)="" и="" ep300="" (p-стойност="">

Бъбрек-свързаните с функцията CpG бяха широко обогатени за няколко хистонови маркировки, като 82 от 195 комбинации от клетъчни типове хистонови маркировки са значими (FDR q < 0.05)="" за="" egfr="" (фиг.="" 4c,="" допълнителни="" данни="" 15)="" и="" 79="" от="" 195="" за="" uacr="" (фиг.="" 4d,="" допълнителни="" данни="" 16).="" модификацията="" на="" хистон="" h3k4me1,="" белег,="" концентриран="" върху="" активни="" и="" първични="" подобрители,="" беше="" обогатен="" за="" всички="" клетъчни="" типове="" за="" uacr-асоциирани="" cpgs="" и="" почти="" всички="" клетъчни="" типове="" за="" egfr="" асоциирани="" cpgs.="" докато="" свързаните="" с="" uacr="" cpg="" показват="" обогатяване="" за="" промоторния="" знак="" h3k4me3="" в="" 34="" типа="" клетки,="" само="" четири="">

типове показаха обогатяване за сайтове, свързани с eGFR. Обратно, асоциираният с генното тяло белег H3K36me3 показва много по-широко обогатяване за свързани с eGFR CpG (30 клетъчни типа), отколкото свързани с UACR CpG (пет клетъчни типа). За разлика от H3K3me1/3 и H3K36me3, които всички са свързани с активни гени (енхансери, активни промотори, активна транскрипция), H3K9me3 и H3K27me3, които обикновено са свързани с конститутивен и факултативен хетерохроматин28–31, не са значително обогатени за UACR- асоциирани CpG във всеки тестван тип клетка (фиг. 4D, допълнителни данни 16). Обогатяване на гени, замесени отбъбречна функция-асоциираните CpGs бяха оценени в Gene Ontology (GO), Киотската енциклопедия на гените и геномите (KEGG) и бази данни Reactome (вижте Методи) 32–35. Наблюдава се значително обогатяване за 27 термина (25 GO, един KEGG, един Reactome; Допълнителни данни 17, Фиг. 5A) за eGFR и 91 термина (87 GO, четири Reactome; Допълнителни данни 18, Фиг. 5B) за UACR (Фиг. 5B). Пътищата, свързани с тип-специфична миграция на бели кръвни клетки, транслация на иРНК, хемостаза и коагулация, както и инсулинов отговор, показват значително обогатяване за свързани с eGFR CpGs (FDR < 0.05;="" фиг.="" 5a).="" пътищата="" с="" най-ниски="" p-стойности="" на="" обогатяване="" за="" uacr-асоциирани="" места="" бяха="" доминирани="" от="" активиране="" и="" отговор="" на="" имунни="" клетки="" и="" свързани="" с="" интерферон="" пътища="" (фиг.="" 5b).="" допълнителни="" пътища,="" които="" бяха="" обогатени,="" включват="" миграция="" на="" бели="" кръвни="" клетки,="" както="" за="" резултатите="" от="" egfr="" (допълнителни="" данни="">

Връзка с известни асоциации на EWAS с други черти. Като се има предвид наблюдаваното обогатяване на пътищата, свързани с имунния отговор, резултатите от метилирането на ДНК, включително CpG близо до гени на пътя на интерферона, и факта, че статусът на метилиране на ДНК е оценен предимно в левкоцити, ние оценихме дали нашите открития може да се дължат на объркващи ефекти на имунния отговор или възпалителния статус. По този начин, ние извършихме търсене на репликираните CpGs в голям EWAS на високочувствителни нива на серумен С-реактивен протеин (CRP)36. Само два CpGs, които също са свързани с ДНК метилиране и eGFR вбъбречна тъкан,cg09610644 при BDH1 и cg12644285 при CHD2, бяха сред свързаните с CRP сайтове. По този начин, общо объркване на нашите резултати чрез възпалителен статус, оценен от CRP, изглежда малко вероятно.

Някои отбъбречна функция-свързани CpGs, идентифицирани в това проучване, са свързани с няколко други черти, базирани на публикувани EWAS. Двадесет и един eGFR места бяха свързани с кръвно налягане, консумация на алкохол, ИТМ, пол, разтворим рецептор на тумор некротизиращ фактор 2 и/или статус на тютюнопушене, а пет UACR места бяха преди това свързани с консумация на алкохол, статус на тютюнопушене, ИТМ, образователни постижения, -глутамил трансфераза, рецептор на разтворим фактор на туморна некроза 2, захарен диабет тип 2 и/или няколко серумни метаболита (Таблица 2, Допълнителни данни 19). Три от тези CpG (всички UACR сайтове) бяха свързани с повече от две черти, а именно cg02711608 в SLC1A5 (с -глутамил трансфераза, -глутамилтреонин, ИТМ, консумация на алкохол), cg18181703 в SOCS3 (със захарен диабет тип 2, статус на тютюнопушене, ИТМ , рецептор на разтворим фактор на туморна некроза 2) и cg24859433 близо до IER3 (със статус на тютюнопушене, образователни постижения, 4-винилфенол_сулфат). Допълнителна фигура 5B илюстрира CpG, cg26099045, който е свързан с eGFR и фиброза вбъбречна тъканв нашия анализ и допълнително свързано със секс и тютюнопушене в предишни EWAS. И накрая, cg17944885 при ZNF788 се свързва и с eGFR в проба от пациенти с DKD22.

Дискусия

В този EWAS набъбречна функция, ние идентифицирахме и репликирахме нивата на метилиране на кръвна ДНК на 69 CpGs, свързани с eGFR. От тях 60 места не са докладвани по-рано, както и всичките седем CpG, идентифицирани във връзка с UACR. По-голямата част от eGFR- и UACR-асоциираните CpGs също бяха значително свързани с техните клинични резултати, т.е. ХБН и микроалбуминурия, и следователно може да имат потенциал за стратификация на лицата в риск. Дисперсията на eGFR, приписана на тези 69 CpG, е 2,4 процента - два пъти повече от по-ранен EWAS14 и е сравнима с дисперсията, обяснена от 29 SNP, открити от GWAS, които включват три пъти по-голям размер на извадката за откриване на локус37,38. Това предполага, че диференциалното ДНК метилиране при индивидуални CpGs, количествено определени от кръв, обяснява повече от вариацията на eGFR, отколкото отделните общи SNPs при даден размер на пробата. За UACR изглежда, че са необходими по-големи размери на пробите в сравнение с eGFR, за да се разкрие подобен брой CpG, свързани с черта. Като се има предвид, че албуминът и креатининът за изчисляване на UACR се измерват в урината, за разлика от количественото определяне на креатинина от серума за оценка на GFR, тази разлика не е неочаквана и е в съответствие с наблюденията от GWAS на тези характеристики 10,13. Освен това изглежда, че генетичните вариации засягатбъбречна функцияпризнаци по пътища, различни от промените в метилирането на ДНК. Това се подкрепя от ниското припокриване между репликираните EWAS и GWAS сайтове както за eGFR, така и за UACR.

Този мета-анализ на EWAS включва проби от различни популации и етноси. Наблюдавахме висока корелация на оценките на ефекта, получени от голямата подпроба от EA индивиди с ефектите, оценени в AA индивидите (фиг. 2). Въпреки включването на данни от значителен брой индивиди с произход извън EA, общите резултати от трансетническия EWAS може да се ръководят от данни от лица с произход от EA, които представляват 70 процента (eGFR) / 65 процента (UACR) на нашето проучване (допълнителни данни 3 и 4). За да се отговори на това ограничение, са необходими бъдещи анализи с увеличен дял на проби извън EA за надеждна и подробна оценка на хетерогенността между предците. Потенциалът за пренасяне на прозрения от EWAS за количествени характеристики в предимно популационни проучвания към хора с болестта се илюстрира от факта, че оценките на ефекта при 65 от 69 CpG, свързани с eGFR, са наблюдавани в същата посока в група от 551 пациенти с ХБН, насочващи към механизми, приложими в широк диапазон от нива на eGFR (фиг. 3). Освен това,

cg07242931 в MAN1C1 и cg18194850 в SUCLG2 не само се свързва с eGFR, но и предвижда времето забъбречна недостатъчностили остърувреждане на бъбреците(Допълнителни данни 8). Допълнителни доказателства за участието на SUCLG2, който кодира субединицата на сукцинил-CoA синтетазата, в бъбречно заболяване бяха предложени от GWAS върху диабетицизаболяване на бъбрецитепри американските индианци (SNP=rs4453858, P-стойност=2E−6)39. Генетичната вариация в този ген също се свързва с нивата на сукцинил-карнитин в урината (C4DC, SNP=rs115560420, P-стойност=7E−15)40. C4DC е метаболитен продукт от цикъла на трикарбоксилната киселина, който се катализира при участието на сукцинил-CoA синтетаза и по-високи нива на C4DC в кръвта, свързани с по-нисък eGFR41. Въпреки това, справка в резултатите от локусите на количествените признаци на метилиране (meQTL) на GoDMC (http://www.godmc.org.uk)42 не разкри значителна връзка на тези два SNP с cg18194850, което предполага липса на пряка връзка между тези SNP и сайта на CpG.

Тъй като метилирането на ДНК е основен регулатор на генната експресия, ние оценихме корелацията на свързаните с признака места за метилиране на ДНК с нивата на иРНК на гените в cis. Гени, чиито нива на иРНК значително корелират сбъбречна функцияасоциираните места за метилиране на ДНК са свързани с интерферонови пътища (както за eGFR, така и за UACR). Въпреки че тези констатации са в съгласие с резултатите от обогатяването на пътя за UACR (Фиг. 5B, Допълнителни данни 18), броят на значимите корелации между CpG, свързани с UACR, и нивата на транскрипт е доста нисък. Това не е изненадващо, като се има предвид сравнително малкия размер на извадката от 1915 индивида, налични за този анализ, и ограниченото покритие на ресурса за транскриптомика. Интересното е, че сред значимите констатации за UACR, два CpGs в член 5 на семейство носители на разтворени вещества 1 (SLC1A5) са свързани с диференциална генна експресия, а също и с кръвно налягане. Следователно метилирането на ДНК при SLC1A5, което кодира натриево-зависим неутрален аминокиселинен транспортер, може да бъде допълнителен елемент, допринасящ за известната корелация между UACR и кръвното налягане.

Значителни диференциално експресирани транскрипти не винаги са били кодирани от най-близкия ген (cg17944885 близо до ZNF788), или CpG място е корелирано с множество гени в cis (cg04864179 при IRF5). По-специално, корелацията на метилирането на ДНК при cg04864179 с нивата на транскрипт на IRF5 е забележима. Като се има предвид значителният MR резултат на този CpG с eGFR, метилирането на ДНК при IRF5 може причинно да повлияе на eGFR, медиирано от неговата генна експресия. Вземайки под внимание трансформацията на характеристиките на основните генетични асоциации (вижте Методи), ние наблюдавахме, че увеличението на ДНК метилирането с десет стандартни отклонения води до 3,2% по-висок eGFR. Въпреки че този изчислен ефект е много малък, причинно-следственото влияние на моделите на метилиране в кръвните клетки върху ХБН също беше подкрепено от базирана на обобщение МР с различен набор от данни meQTL в скорошно проучване, където причинно-следственият ефект беше насочено в съответствие с нашите резултати22. Чрез прилагане на колокализация с много черти те също показаха, че генетичните ефекти на този локус върху eGFR са медиирани от IRF5 метилиране и генна експресия в кръвта. Освен това, колокализацията на експресията на IRF5 ген с eGFR беше показана както в тубулните, така и в гломерулните отделения набъбректъкан43. При тълкуването на причинно-следствения ефект, наблюдаван в нашето проучване, трябва обаче да се има предвид, че MR анализите за CpG cg04864179 показват значителна хетерогенност (p <0,05) сред="" инструментите="" (допълнителни="" данни="" 11="" и="" допълнителна="" фигура="" 7="">

IRF5 кодира член на семейството на интерфероновия регулаторен фактор (IRF). Групата от членове на семейството на IRF съдържа транскрипционни фактори с различни роли, като модулиране на активността на имунната система, растеж и диференциация, както и контрол на генната експресия за реакцията на интерферон към вирусни инфекции. IRF5 може да повлияе на отговора на имунните клетки. Множество проучвания потвърждават, че промените в метилирането на IRF5 могат да повлияятбъбречна функциячрез имунни пътища: SNPs в IRF5 са свързани със SLE чрез промени в експресията на IRF5 в кръвни моноцити44-46. SLE е автоимунно заболяване, характеризиращо се с активиране на IFN пътя, който може да засегнебъбрецикато лупусен нефрит47. Инхибирането на хиперактивирането на IRF5 в миши модел на SLE, защитено от поява и тежест на лупусен нефрит и подобренобъбречна функцияи патология48,49. Въпреки че нашият EWAS не се фокусира върху изследването на пациенти със SLE, малки ефекти от метилирането на IRF5 върху резултатите, свързани с бъбреците, медиирани поне частично от неговата експресия и последващите IFN пътища, могат да бъдат открити като ефекти върху eGFR в общата популация.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА БОЛКА

Няколко от свързаните с eGFR CpGs, за които ДНК метилирането е количествено определено от кръвни клетки, също са свързани с eGFR ибъбрекфиброза, когато метилирането на ДНК е количествено определено отбъбректъкан, въпреки че размерът на пробата е значително по-малък в сравнение с набора от данни на EWAS. Това предполага, че поне някои от откритията, получени от кръвта, могат да бъдат преведени в допълнителна целева тъкан, специфична за чертата. Ето, кръв ибъбрекса двете основни специфични за характеристиките целеви тъкани, тъй катофункцияотбъбреке филтриране на кръвта за отстраняване на отпадъците. Анализи на обогатяване набъбречна функцияасоциираните CpGs показват централна роля в регулирането на транскрипцията. Открихме широко разпространено обогатяване на H3K4me1/3 и H3K36me3. H3K4me1/3 е свързан с първични и активни енхансери, както и с активни промотори и H3K36me3 е тясно свързан с транскрибираните региони на генома50. Ролята на транскрипционната регулация е допълнително подкрепена от най-силния сигнал за обогатяване на транскрипционен фактор на UACR-асоциирани CpGs, който е POLR2A, най-голямата субединица на основния ензим, синтезиращ иРНК в еукариотите.

Потенциалните ограничения, свързани с MR анализите, включват, че не са налични валидни инструменти за всички CpG за предходния MR. Като се има предвид, че всички инструменти на CpG са избрани от cis региони, т.е. от една и съща генетична област, е вероятно всички инструменти на CpG да са валидни или невалидни, като по този начин се ограничава броят на различните MR методи, които могат да се прилагат за тестване на устойчивост на резултатите51. Обратната MR беше с ограничена мощност поради малкия размер на извадката, наличен за оценка на асоциациите на метилиране на SNP-DNA. По-големи проучвания на meQTL като GoDMC не можаха да съхранят резултатите за асоцииране за всички SNPs (т.е. над определена граница на P-стойността на асоциацията) поради технически причини и следователно не бяха използваеми за обратната MR с две проби. Следователно незначителните констатации трябва да се интерпретират внимателно. В допълнение, тълкуването на размера на причинно-следствения ефект е трудно, тъй като основните генетични асоциации се изчисляват по скалата на стандартното отклонение на нивата на метилиране на ДНК. Друго потенциално ограничение на изследването е, че eGFR, CKD и UACR са фенотипове, оценени от различни основни параметри и имат многофакторни влияния. По този начин направихме няколко анализа, за да гарантираме, че нашите резултати от EWAS не са обусловени от известни объркващи фактори, включително диабет тип 2, потенциален объркващ фактор за връзката между DNAm ибъбречна функция. Първо, асоциациите на EWAS във всяка кохорта бяха коригирани за объркващи фактори, за да се премахнат техните ефекти в рамките на кохорта. Второ, EWAS бяха извършени във всяка кохорта поотделно и след това мета-анализирани, което съответства на корекция, например за разпространението на диабета в кохортите. И накрая, проверихме за асоциации на нашите репликирани CpGs в рамките на публикувани проучвания за диабет EWAS. От всички наши репликирани CpG асоциации, само UACR-свързаният CpG cg18181703 в SOCS3 показа връзка с диабет тип 2. Този CpG също беше свързан със статуса на тютюнопушене, BMI и кръвните нива на разтворимия рецептор на тумор некротизиращ фактор 2. Като се има предвид, че нашият EWAS също беше коригиран за статуса на тютюнопушене и BMI, ние приемаме, че ефектите на cg18181703 върху UACR са при поне частично независимо от диабет тип 2, ИТМ и състояние на пушене. Въпреки че контролирахме няколко от тези известни фактори, други фактори, като неизмерени ковариати, не можаха да бъдат изрично коригирани в анализите и могат да повлияят на констатациите.

Необходими са по-нататъшни проучвания на EWAS с увеличени размери на пробите и с ДНК метилиране, количествено определено от допълнителни тъкани, както и функционални анализи, за да разширим познанията си за регулаторните механизми набъбречна функцияи в крайна сметка да подобри прогнозирането и лечението набъбрекзаболяване. Това важи специално за UACR, предвид по-малкия брой наблюдавани значими CpG асоциации. В обобщение, този широкомащабен мета-анализ на EWAS значително разшири броя на CpGs, възпроизводимо свързани с eGFR и CKD, и разкри седем асоциации за UACR и микроалбуминурия. Метилирането на ДНК в тези места обяснява голяма част от вариацията на eGFR, а диференциалното метилиране при четири CpG показва доказателства за потенциална причинно-следствена връзка с eGFR. Цялостно характеризиране на репликирани CpGs сред пациенти с ХБН, вбъбречна тъкан,за диференциална генна експресия и за обогатени пътища и епигенетични белези предоставят представа забъбречна функция-свързана транскрипционна регулация.

Методи

Преглед.Създадохме съвместен мета-анализ, базиран на разпределителен модел на данни и процедури за контрол на качеството. За да се постигне максимална стандартизация на фенотипа в проучванията, бяха създадени план за анализ и скрипт от командния ред (https://github.com/generic-Freiburg/Skagen-pheno/tree/ckdgen-ewas-pheno) и предоставени на всички участващи проучвания ( предимно популационни проучвания; Допълнителни данни 1 и 2). Автоматично генерираните обобщени файлове бяха проверени централно. След одобрение на фенотипа, проучванията проведоха своя EWAS и качиха резултатите и обобщената информация за метилирането на ДНК на централен сървър. Контролът на качеството на EWAS беше извършен с персонализирани скриптове за оценка на инфлацията, положителните контроли, разпределението на CpG сонди и сравняване между проучванията на общите разпределения на размерите на ефекта, стандартните грешки и P-стойностите. Всички протоколи от проучването са одобрени от съответните местни комисии по етика. Всички участници във всички проучвания предоставиха писмено информирано съгласие.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ДИАЛИЗА

Дефиниция на фенотип.Стойностите на креатинина, получени с анализ на Jaffé преди 2009 г., бяха калибрирани чрез умножаване по 0,9552. Проучванията оценяват GFR с хрониченЗаболяване на бъбрецитеУравнение за епидемиологично сътрудничество (CKD-EPI)53. eGFR беше winsorized при 15 и 200 ml min-1 на 1,73 m2. CKD се определя като eGFR под 60 ml min-1 на 1,73 m2. Стойностите на UACR, измерени в mg/g, бяха естествено логаритмично трансформирани преди всички анализи. Микроалбуминурията се определя като 1 за UACR > 30 mg/g и като 0 за стойности на UACR < 10="">

Количествено определяне на ДНК метилиране и качествен контрол.За количественото определяне на ДНК метилирането, геномната ДНК се екстрахира от периферна кръв. Нивата на ДНК метилиране бяха количествено определени с помощта на Infinium MethylationEPIC BeadChip масив (EPIC), Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip масив (HM450K) или Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip масив (HM27K). Предварителната обработка на данни за ДНК метилиране беше извършена съгласно индивидуални протоколи за изследване, включително корекция на фона, нормализация на квантила, филтриране на проба, филтриране на проба, SNP съвпадение с местоположенията на контролната проба на SNP, филтриране на извънредни стойности и корекция на типа анализ (допълнителни данни 3). Нивото на метилиране на всяко място беше представено и анализирано като -стойност. CpG сонди, припокриващи се със SNP, бяха анотирани. Всяко проучване изчислява средно и стандартно отклонение на всяко място на CpG и тези обобщени статистически данни се сравняват между проучванията за систематични разлики между CpG и се проследяват с отделни анализатори на проучването

Ковариативна оценка.ДНК метилирането и ковариатите бяха измерени при едно и също посещение/времева точка. Разпространеният диабет се определя като плазмена глюкоза на гладно, по-голяма или равна на 126 mg/dl, плазмена глюкоза на гладно, по-голяма или равна на 200 mg/dl, лечение на диабет или самоотчитане на диагноза диабет. Разпространената хипертония се определя като систолично кръвно налягане, по-голямо или равно на 140 mm Hg, диастолично кръвно налягане, по-голямо или равно на 90 mm Hg, или лечение на хипертония. Ако измереното кръвно налягане не е налично, хипертонията се определя чрез самоотчитане. Текущият статус на тютюнопушене беше определен с помощта на информация, докладвана от самите тях. ИТМ (kg/m2) е изчислен чрез измерване на теглото и височината, както е оценено във всяко проучване. Възрастта беше включена като непрекъсната стойност в моделите на асоцииране. Структурата на популацията в несемейни проучвания беше коригирана чрез генетични основни компоненти (PC). Пропорциите на типа бели кръвни клетки бяха оценени въз основа на ДНК метилиране54. Допълнителни технически ковариати включват контролна сонда PCs55, изследователски център, партида за обработка, ID на сензора на матрицата и позиция на сензора.

Статистически методи и мета-анализ. За да се осигури сравнима мощност между анализираните сайтове, в анализите бяха включени само автозомни CpGs, измерени от двете, EPIC и HM450K. Всяко проучване извършва линейни регресионни анализи, разделени по групи от предци. За оценка на устойчивостта на резултатите от EWAS, анализите бяха ограничени до проучвания и подпроби на индивиди от европейски произход. Стойностите на ДНК метилиране бяха моделирани като зависими променливи с признак или непрекъснати стойности на eGFR или UACR или бинарни променливи на ХБН или микроалбуминурия: ДНК метилиране ~ черта плюс пол плюс възраст плюс генетични PC плюс пропорции на бели кръвни клетки плюс технически ковариати плюс диабет плюс хипертония плюс ИТМ плюс текущо пушене. Участниците се нуждаеха от пълна информация за всички променливи и обобщена статистика на проучването и бяха включени само ако бяха налични минимум 50 участници за eGFR/UACR и 50 случая/контроли за ХБН/микроалбуминурия. Всеки специфичен за проучването EWAS беше коригиран за инфлацията преди мета-анализа чрез подхода BACON, ако оценката на инфлацията беше по-голяма или равна на единица (допълнителна фигура 8)56. Проучванията бяха разделени на откриване и репликация по хронологичен ред на принос към мета-анализа на консорциума CKDGen (допълнителни данни 1 и 2). Беше извършен претеглен мета-анализ с обратна вариация с фиксиран ефект, както е внедрен в R пакета „metafor“ (версия 2.1-0) за проучвания за откриване, проучвания за репликация и за произтичащи оценки на ефекта от откриване и репликация. CpGs бяха изключени, ако по-малко от половината от съответния размер на пробата беше наличен в рамките на откриването или репликацията или ако оценката на I2 хетерогенността беше по-голяма от 95 процента. Успешната репликация на свързан CpG се определя като последователна посока на оценките на ефекта между откриването (neGFR диск=22,347, nUACR диск=11,458) и репликацията (neGFR repl=11,258 , nUACR repl=3610) мета-анализ, коригирана Bonferroni значимост на P-стойността на откритието (pdisc)<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

Анализи на генната експресия.Ефектите отбъбречна функцияCpG, свързани с признак, бяха тествани за асоциации с генна експресия в кръвта, като се използваха два набора от данни: (1) нива на иРНК на моноцити от 1202 участници в проучването MESA и (2) иРНК на цяла кръв на 713 индивида от KORA F4 проучване 57,58. Като начална стъпка беше извършено търсене на нивата на метилиране на CpG с нива на mRNA, налични в резултатите от асоциирането от проучването MESA. За това търсене бяха налични резултати за асоцииране с P-стойност < 1e{{10}}.="" анализът="" е="" описан="" подробно="" в="" kennedy="" et="" al.59.="" накратко,="" генната="" експресия="" беше="" оценена="" с="" помощта="" на="" illumina="" humanht-12="" v3.0="" и="" v4.0="" expression="" beadchips="" и="" днк="" метилиране="" чрез="" illumina="" hm450k="" масив.="" стойностите="" на="" експресията="" се="" нормализират="" с="" помощта="" на="" стабилизиращата="" дисперсия="" трансформация.="" 13="" 933="" транскрипта="" от="" масиви="" v3.0="" и="" v4.0,="" които="" са="" значително="" изразени="" над="" фоновите="" нива="" (откриване="" на="" p-стойност="">< 0,01)="" при="" най-малко="" 5="" процента="" от="" субектите.="" анализите="" на="" асоциацията="" в="" mesa="" бяха="" извършени="" като="" линеен="" смесен="" модел,="" използвайки="" логаритмично="" трансформирани="" стойности="" на="" генна="" експресия="" като="" зависима="" променлива,="" бета="" стойности="" на="" днк="" метилиране="" като="" независима="" променлива="" с="" възраст,="" пол,="" етническа="" принадлежност="" и="" център="" на="" изследване,="" добавени="" като="" ковариати="" в="" модела.="" беше="" извършен="" втори="" тест="" за="" асоцииране="" в="" набора="" от="" данни="" kora="" f4.="" връзката="" на="" нивото="" на="" метилиране="" при="" репликирани="" cpgs="" с="" нивата="" на="" генна="" експресия="" на="" гени="" в="" близост="" до="" ±500="" kb="" беше="" изчислена="" с="" помощта="" на="" log2-трансформирани="" нива="" на="" mrna,="" получени="" от="" illumina="" human="" ht-12v3="" масив="" за="" генна="" експресия.="" стойностите="" на="" генната="" експресия="" бяха="" регресирани="" спрямо="" бета="" стойностите="" на="" днк="" метилиране,="" коригирани="" за="" пол="" и="" възраст.="" преди="" анализа="" техническите="" фактори,="" както="" и="" пропорциите="" на="" типа="" кръвни="" клетки,="" бяха="" регресирани="" от="" нивата="" на="" метилиране="" на="" ирнк="" и="" днк="" и="" неговите="" остатъци="" бяха="" включени="" в="" окончателния="" модел="" на="" асоцииране.="" проверките="" за="" анотация="" и="" контрол="" на="" качеството="" на="" сондите="" за="" генна="" експресия="" се="" основават="" на="" таблицата,="" предоставена="" в="" schurmann="" et="" al.60.="" асоциации="" на="" експресия="" на="" cpg-ген="" в="" кръвта,="" които="" са="" налични="" в="" резултатите="" от="" mesa="" и="" имат="" асоциирана=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

ДНК метилиране в бъбречна тъкан.Анализите, използващи метилиране на ДНК вбъбречна тъканс eGFR и фиброза са извършени с помощта на данни от 506 микродисектиранибъбречна тъканпроби с помощта на Illumina EPIC BeadChip. Пробите от бъбречна тъкан бяха събрани отделно и се различават от кръвните проби, които бяха анализирани в мета-анализа на EWAS. Тези проби бяха събрани от незасегнати части от туморни нефректомии и приготвени, както е описано преди 61. Накратко, софтуерът SeSAMe62 беше използван за извършване на предварителна обработка и контрол на качеството, включително откриване на базата на нисък интензитет, корекция на кървене при изваждане на фона, корекция на нелинейно отклонение на багрилото, контрол за конверсия на бисулфит, изчисляване на бета стойности и оценка на левкоцитната фракция. Бета стойностите на CpGs, свързани с eGFR и UACR и клиничната информация бяха извлечени за анализ на асоциацията. Беше приложен регресионен модел за тестване на асоциациите на ДНК метилиране бета на крайните CpGs като зависими променливи с eGFR и нивата на фиброза, съответно, като независими променливи, коригирани за пол, възраст, генетични PC (1-5), статус на диабет, статус на хипертония , ИТМ, ID на матрицата, позицията на сензора и контрол на конверсията на бисулфит и изчислена левкоцитна фракция.

Целеви изследвания на сонди за eGFR при пациенти с ХБН. Асоциацията на 69 eGFR-асоциирани и валидирани CpG от общата популация с eGFR в German ChronicЗаболяване на бъбреците (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 mg g-1). Проследяването на пациентите за клинични крайни точки все още продължава. Крайните точки на изследването се записват непрекъснато по стандартизиран начин въз основа на писма за изписване от болница и смъртни свидетелства и включват събития, свързани с бъбреците, както и смърт. Дизайнът на изследването и избраната популация за проучване са описани по-подробно в предишни публикации 63, 64. Проучването GCKD беше одобрено от местните етични комисии и регистрирано в националния регистър за клинични проучвания (DRKS 00003971). Подгрупа от 559 пациенти с ХБН, приписвана на системен лупус еритематозус, мембранозна нефропатия, фокална сегментна гломерулосклероза или автозомно-доминантна поликистозазаболяване на бъбрецитебеше избран за количествено определяне на ДНК метилиране и измерен с помощта на Infinium MethylationEPIC BeadChip array (EPIC). Връзката с eGFR беше оценена аналогично на основния анализ (вижте Статистически методи и мета-анализ), с изключение на корекцията за тютюнопушене, която беше кодирана 0/1/2 за никога/бивши/настоящи пушачи. За да се оцени връзката на метилирането на ДНК с времето добъбречна недостатъчностот началото на проучването, регресионните модели на Кокс бяха монтирани за всеки CpG и аналогично за комбинирана крайна точка набъбречна недостатъчности остърувреждане на бъбреците.Освен предиктора за ДНК метилиране, моделите бяха коригирани за възраст, пол и подтип на ХБН. Регресионният модел на Кокс предоставя оценки за съотношението на рискове, специфични за причината (HR) в присъствието на конкуриращи се събития, т.е. всяка друга смърт, освен смърт, свързана с бъбреците. Допълнително бяха извършени анализи на опасността от подразпределението, за да се оценят потенциалните непреки ефекти чрез конкурентното събитие. Предположението за пропорционални опасности беше оценено въз основа на мащабирани остатъци на Шьонфелд. Графичната оценка за двата свързани CpGs не разкрива доказателства за големи нарушения (допълнителна фигура 9).

Регионални асоциационни сюжети и анотация. Графиките за допълнителна фигура 5 бяха създадени с помощта на пакетите „Gviz“ 65 и „rtracklayer“ 66 R. Максимум 40 места в рамките на 50,000 bp нагоре или надолу по течението от CpG мястото, представляващо интерес, бяха включени в графиката. Ако интервалът съдържаше повече от 40 места, начертаната област беше намалена до разстоянието на най-отдалеченото място плюс 10,000 bp. Разделът RefSeq Genes е базиран на песента UCSC NCBI RefSeq с генни символи от пакета 'org.Hs.eg.db' R, секцията CpG Islands е базирана на песента UCSC CpG Islands, секцията Roadmap chromHMM е базирана на Пътни карти 15- състояние chromHMM модел на плодабъбрекепигеном (идентификатор на епигеном на пътна карта: E086)67 и разделът за общи SNPs се основава на UCSC Common SNPs(151) track68. И накрая, диаграмата на корелация на CpG в долната част на фигурата се основава на данни от пробите за ДНК метилиране на изследването KORA F4, използвайки масива Illumina HumanMethylation450 BeadChip, като липсващите места са оцветени в светло сиво.

Вариацията се обяснява с метилиране на ДНК.Процентът на фенотипната вариация, обяснен от 69 репликирани CpGs, свързани с eGFR, беше оценен с помощта на данни от 1888 участници от проучването KORA FF4, седемгодишното проследяване на проучването KORA F457,58. KORA FF4 не беше част от мета-анализа на EWAS. Въпреки това, 988 индивида, включени в анализа на обяснената вариация, се припокриват с участниците в KORA F4 на EWAS. В този набор от данни вариацията, обяснена от всички CpG независимо от ковариатите, беше оценена като разликата в R2 на базовия модел, включително CpG и този без. Базовият модел беше определен катобъбрекчерта ~пол плюс възраст плюс пропорции на белите кръвни клетки плюс диабет плюс хипертония плюс ИТМ плюс настоящо пушене сбъбрекхарактеристика, представляваща eGFR и UACR. За два CpG, свързани с eGFR (cg06008406, cg20004659), няма налични данни в набора от данни KORA FF4.

Двупосочен менделски рандомизиращ анализ.В предния MR, използвайки пакета „TwoSampleMR“ R69, ние изследвахме потенциалните причинно-следствени ефекти на ДНК метилирането при репликираните CpG върху eGFR и UACR. MR използва генетични инструменти за минимизиране на пристрастията, дължащи се на объркваща и обратна причинно-следствена връзка70. Генетични инструменти за ДНК метилиране (meQTL) бяха налични съответно за 47 и пет CpG за eGFR и UACR, както беше идентифицирано по-рано от GoDMC при до 27,750 индивида42. Обобщените GWAS данни за европейското потекло за eGFR10 и UACR13 бяха използвани като съответните данни за резултатите. Прилагат се филтри за включване на meQTL (pSNP <1e-5 с="" днк="" метилиране="" в="" ±="" 500kb="" cis="" област,="" неравновесие="" на="" връзката="" r2=""><0,2 в="" рамките="" на="" 1mb="" област,="" филтриране="" на="" steiger,="" maf=""> 0,05). Извършихме MR, претеглен с обратна вариация, както и анализи на чувствителността на MR (прост режим, претеглен режим, претеглена медиана и MR Egger), или триангулация чрез оценка на съотношението на Wald в случай, че беше наличен само един инструмент за CpG място71–73. Оценките на ефекта, получени от MR, зависят от единиците на основните набори от данни и в този случай съответстват на промяна на единица в едно стандартно отклонение на нивата на метилиране на естествен логаритмичен трансформиран eGFR и стандартно отклонение на естествен логаритмичен трансформиран UACR, съответно. При обратна MR изследвахме потенциалните причинно-следствени ефекти набъбречна функцияхарактеристики на ДНК метилиране, като се използват значимите за целия геном SNPs от трансетнически GWAS на eGFR10 и UACR13 като генетични инструменти за eGFR и UACR, съответно. За да увеличим максимално мощността върху данните за резултатите, ние извършихме мета-анализ на Z-score на SNP-CpG асоциации от проучванията KORA F4 (n=1662) ​​и FHS (n=3868). Оценките на комбинирания ефект и техните стандартни грешки на meQTL, включени в MR, бяха оценени от размера на извадката, честотата на алелите и z-резултат74. Прилагат се филтри за включване на SNP (P-стойност <5e−8>бъбрекчерта, едностранна P-стойност < 0.05="" с="" уреен="" азот="" в="" кръвта="" за="" egfr="" инструменти,="" хетерогенност="" на="" предците="" p-стойност="" по-голяма="" или="" равна="" на="" 0.0="" 1,="" филтриране="" на="" steiger,="" maf=""> 0.05). Извършихме MR, претеглен с обратна дисперсия, с мултипликативни произволни ефекти (тъй като достатъчно голям брой инструменти от различни локуси бяха налични за черта)51 и анализи на чувствителността на MR (прост режим, претеглен режим, претеглена медиана и MR Egger)71–73. Като допълнителен анализ на чувствителността, насочен към плейотропни варианти, ние изключихме общо 35 инструмента, които бяха свързани със захарен диабет тип 2 в скорошен GWAS75, включително 898 130 индивида: единадесет SNP, които имаха асоциирана P-стойност < 5e-8="" с="" диабета,="" и="" 24="" допълнителни="" инструменти,="" които="" са="" били="" в="" неравновесие="" на="" връзката="" (r2=""> 0,2 в рамките на 1 Mb, 1000 G EUR референтен панел) с такъв свързан с диабета SNP. Неравновесието на връзката беше оценено чрез LDlink76. За обратната MR оценките на ефекта осигуряват промяната на единица в естествения логаритмично трансформиран eGFR и стандартното отклонение на естествения логаритмично трансформиран UACR, съответно, при стандартно отклонение на нивата на метилиране на ДНК. Корекцията на множествено тестване на P-стойност съгласно Benjamini–Hochberg FDR < 0,05="" беше="" приложена="" за="" черта="" на="" бъбрека="" и="" за="" права="" и="" обратна="" mr="" отделно77.="" р-стойностите="" за="" хетерогенност="" са="" получени="" от="">

Анализи на обогатяване.За да информираме потенциалните функционални ефекти на свързаните CpGs, ние оценихме обогатяването на тези CpGs в местата на DNase I или модификация на хистони (H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3), набори гени, базирани на GO термини и пътища в базите данни KEGG и Reactome32 –35. Анализите на обогатяване на TFBS бяха извършени, както е описано по-горе подробно14. Накратко, тестът за обогатяване беше оценен с помощта на eForge78, използвайки пермутация със съвпадение за локализация на ген- и CpG островен регион при вземане на проби. Данните са получени или от проекти ENCODE (125 проби), или Roadmap Epigenomics (299 проби), генерирани от метода Hotspot67,79,80. CpGs, които бяха свързани съответно с eGFR и UACR, при P-стойност < 1e−05="" в="" мета-анализа="" бяха="" използвани="" като="" вход="" (допълнителни="" данни="" 6="" и="" 7),="" и="" 10,000="" повторно="" вземане="" на="" проби,="" активен="" филтър="" за="" близост="" и="" се="" счита="" fdr="">< 0,05="" за="" значим="" (допълнителни="" данни="" 13="" и="" 14).="" анализите="" на="" обогатяване="" на="" хистонова="" маркировка="" бяха="" извършени="" аналогично="" (допълнителни="" данни="" 15="" и="" 16).="" обогатяването="" на="" генни="" набори="" или="" пътища="" беше="" оценено="" с="" помощта="" на="" пакета="" methylgsa="" и="" r="" версия="" 3.6.181.="" тестовият="" метод="" за="" обогатяване="" беше="" methylglm,="" прилагащ="" логистична="" регресия,="" коригираща="" броя="" на="" сондите="" на="" ген="" и="" автозомния="" фон,="" който="" припокрива="" 450k="" и="" epic="" масиви.="" бяха="" тествани="" набори="" от="" гени="" или="" пътища="" със="" 100–500="" гена="" (настройка="" по="" подразбиране).="" считахме,="" че="" набор="" от="" гени="" или="" път="" е="" значително="" обогатен="" при="" fdr=""><0,05, коригирайки="" за="" многократно="" тестване="" във="" всяка="" база="" данни,="" използвайки="" метода="" на="" бенджамини="" и="" хохберг="" (допълнителни="" данни="" 17="" и="">