Мета-анализът на резултатите от количественото определяне на NAD(P)(H) показва променливост в тъканите на бозайници Ⅱ

Ефектът от събирането на тъкан преди смъртта спрямо следсмъртното върху нивата на NAD(P)(H).

Ние прогнозирахме, че може да има известна видима разлика в редокс състоянието на NAD (P) (H), която зависи от процедурите за събиране на тъкани. За да отговорим на този въпрос, ние изследвахме ефекта от процедурите за събиране на тъкани преди и след смъртта върху редокс статуса на NAD(P)(H). За този анализ сравнихме стойности от чернодробни тъкани на плъх, предвид по-големия брой проучвания, определящи техния протокол за умъртвяване. Когато бяха разкрити, всички прегледани проучвания заявиха, че тъканните проби са били държани на студено и незабавно екстрахирани върху лед или замразени при -80 градуса преди измерванията на NAD(P)(H). Този анализ установи, че няма значителна разлика в концентрациите на NAD плюс в черния дроб на плъх (фиг. 6а) между тъканите, извлечени преди или след евтаназия. Въпреки това, докладваните нива на NADH в черния дроб на плъхове са значително по-високи в проби след смъртта (фиг. 6b). Не са наблюдавани разлики в общите нива на NAD(H) (фиг. 6c), но съотношението NAD плюс /NADH е по-ниско в тъканите, събрани след евтаназия (фиг. 6d), което е в съответствие с вариацията, наблюдавана в нивата на NADH. Резултатите от NADP плюс, NADPH и съотношението NADP плюс /NADPH в черен дроб на плъх, групирани по времева точка за събиране на тъкани, са показани на допълнителна фигура 9; въпреки това, недостатъчният брой проби след смъртта не ни позволява да интерпретираме ефекта от времевата точка за събиране на тъкани върху нивата на NADP(H). В черния дроб на мишка няма разлика между нивата на NAD плюс преди и след смъртта, но броят на докладваните проучвания е ограничен (фиг. 6e). НеНАДН,NADP плюс, илиNADPHследсмъртни данни вчерен дроб на мишкабеше достъпен за сравнение.

Щракнете тук, за да получите Hebrs Cistanche

Дискусия

Много скорошни проучвания показват, че регулирането на NAD(P)(H) е от съществено значение за клетъчната хомеостаза и редокс статуса. Данните, получени от гризачи, са довели до проучвания, изследващи нивата на NAD плюс в човешката кръв като по-малко инвазивен индикатор за нивата на NAD плюс в цялото тяло. Скорошни клинични проучвания показват, че нивата на NAD плюс са намалени при болестни състояния23,47 и са повишени след стратегии за повишаване на NAD плюс23,44,48,49. Извършихме мета-анализ на всички проучвания, публикувани между 1946 г. и 20 юни 2021 г., които съдържаха количествени данни за нивата на NAD(P)(H) при видове бозайници със специален фокус върху мишки, плъхове и хора, тъй като те представляват най-много изследвани видове в областта на биомедицината. Този анализ беше направен отчасти, за да се определи средното стандартно ниво на концентрациите на NAD(P)(H) в нормални тъкани на бозайници, като се има предвид добре познатата вариация в тези мерки в различните проучвания. Надяваме се, че тези данни могат да бъдат използвани за стимулиране на стандартизирани протоколи в областта на изследванията на NAD плюс и за насърчаване на използването на нивата на NAD (P) (H) и редокс съотношенията като надеждни биомаркери за заболявания и схеми на лечение.

Въпреки значителната променливост в мерките в тъканите на гризачи, този мета-анализ показва подобни средни нива на NAD плюс в тъканите с някои изключения. Интересното е, че скелетният мускул на мишка показва по-ниски средни нива на NAD плюс (Фиг. 2а) в сравнение с други силно метаболитни тъкани (т.е. черен дроб, бъбрек, сърце и мозък). Това може да показва различни редокс състояния на NAD(H) в скелетните мускули или може да сочи към по-големи проблеми с екстракцията на метаболитите във фиброзните тъкани. Въпреки това, тези наблюдения не могат да бъдат проверени при хора поради липса на проби от тъкани извън кръвта и мускулите.

Има много потенциални фактори, които могат да повлияят на точността на физиологичните измервания на NAD(P)(H) в тъканни проби. Когато са докладвани, всички проучвания описват тъканите като събрани и директно потопени в течен азот или държани върху лед преди замразяване или обработка, за да се запазят чувствителните към топлина фракции (NAD плюс и NADP плюс). Ефектът на рН върху различните NAD(P)(H) фракции, като киселинно-лабилния характер на редуцираните форми на NAD(P)H, е довел до използването на рН-неутрални екстракционни разтворители от повечето изследвания . Въпреки това, предвид бързото взаимно преобразуване на редуцираните и окислените метаболити и ефекта на аноксията върху NAD(H)50–53, също така е важно да се осигури бързо извличане на тъканни метаболити и подходящите процедури за охлаждане на клетъчния NAD(P)(H )-редокс/консумационни ензими, като например чрез депротеинизация. В тази насока нашият анализ на събирането на тъкани преди и след смъртта показва, че анализът след смъртта благоприятства намаляването на NAD плюс. Намаляването на тъканния NAD плюс е описано по-рано in vivo в мозъка, сърцето и черния дроб на плъхове, изложени на продължителна 2.{10}}h хипоксична атмосфера54, среда, която може да бъде частично рекапитулирана от продължителни периоди на пост- пожертвайте събирането на тъкани преди бързо замразяване. Това може да показва, че екстрахирането на тъкани, докато са под анестезия или приоритизирането на незабавното събиране на тъкани, предназначени за използване за метаболитен анализ след умъртвяването, трябва да се извърши, за да се получат представителни измервания на NAD(P)(H).

Съществува и потенциал за различни методи за количествено определяне, всеки от които има различни ограничения, да допринесе за цялостната променливост в рамките на изследването на измерванията на NAD(P)(H). През последните две десетилетия най-често използваните методи бяха анализи на ензимен цикъл, LC-MS и HPLC. Всеки от тези методи се влияе от техники за екстракция на метаболит, параметри за количествено определяне и прилагане на подходящ контрол на качеството. Използвайки LC-MS, Lu et al. са показали, че взаимното преобразуване между редуцирани и окислени форми на метаболитите на NAD(P)(H) се извършва с различни скорости в различни екстракционни буфери или разтворители с ацетонитрил:метанол:вода с 0.1 М смес от мравчена киселина, давайки най-високо възстановяване с най-малко взаимно преобразуване31. Въпреки това, когато се използва LC–MS, това взаимно преобразуване може да се наблюдава между отделни проби от изследване чрез добавяне на вътрешни контроли като NAD(P)(H) изотопи, което е предимство на техниката LC–MS пред тази на HPLC и ензима циклични анализи 31,33,55. Независимо от това, дори при добре контролирани LC-MS техники, различни фактори могат да повлияят на измерения сигнал, включително матрични ефекти и вариации в ефективността на йонизация. Например, някои проучвания използват маркирани с 13C екстракти от дрожди като вътрешни стандарти в базираната на LC-MS метаболомика. Обаче добавянето на метаболитната матрица на извлечената проба с 13C-белязана метаболитна матрица на екстракт от дрожди може да има различни последствия, като потискане на йони, което намалява сигнала на белязани и/или небелязани метаболити и може да доведе до грешки в абсолютното количествено определяне, ако не открити чрез задълбочена оценка на качеството56. Освен това, въпреки че техниките LC-MS теоретично позволяват измерването на множество метаболити на NAD(P)(H) в един експеримент, все още има ограничения, тъй като трябва да се извършат оптимални разреждания, ако метаболитите, които представляват интерес, имат големи разлики в концентрациите. По този начин, въпреки техните предимства пред по-простите анализи на ензимния цикъл, сложността на методите LC-MS налага необходимостта от цялостна оптимизация. Наскоро бяха разработени нови аналитични методи, като NAD плюс биосензори и базирана на изображения масспектрометрия, но все още няма достатъчно количествени данни, генерирани от тези техники, за да бъдат включени в мета-анализ. Въпреки това, едно проучване, включено в нашия мета-анализ, използва хартиен биолуминесцентен биосензор за измерване на нивата на NAD плюс в черния дроб на мишка и други видове проби57. Това изследване беше включено в групата на биолуминесцентните анализи поради сходния метод на откриване (фиг. 1а).

Методи

Извличане на данни.

Числените данни за метаболитите на NAD(P)(H) са или получени директно от статиите, или извлечени от фигури на статии с помощта на полуавтоматичен софтуер за извличане на данни (WebPlotDigitizer58). Освен това, където е приложимо, бяха записани времевите точки за вземане на проби от тъкани по отношение на жертвоприношението и/или методите за вземане на проби от тъкан/кръв (т.е. метод на анестезия и/или евтаназия, работа с тъкани и температура на съхранение). За животинските модели се записват видовете, характеристиките (напр. щам, генотип, възраст и тегло) и условията на околната среда (напр. цикъл на сън, тип диета, честота на хранене и състояние на хранене спрямо вземането на тъканни проби). Освен това, за всички проучвания, лечения (напр. фармакологични лечения, операции, облъчване, индуциране на тумори и други процедури, приложени към изследваните субекти) и цялата информация за проучвателните групи (напр. групи за лечение или заболявания и съответните контроли) са извлечени. И накрая, методът на метода за количествено определяне на NAD(P)(H) (напр. ензимни анализи, базирани на масспектрометрия, HPLC, NMR, биолуминесценция) и специфики на публикацията (т.е. заглавие на публикацията, референтен код [DOI, Medline UI, PMID] или хипервръзка и година на публикуване) бяха отбелязани (допълнителен материал 2).

Анализ на данни. Преди анализа всички концентрации бяха преобразувани в nmol/g тъкан или nmol/g протеини за тъканни проби или nmol/ml за кръвни фракции. Поради малкия брой резултати, нормализирани спрямо съдържанието на протеин, ние показваме само резултати, нормализирани спрямо теглото на тъканите и обема на кръвта. Статистическият анализ беше извършен с GraphPad Prism версия 9.3.1 (GraphPad Sofware Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ,Наличност на данниВсички данни, извлечени и анализирани по време на това проучване, са включени в тази публикувана статия и нейната допълнителна статияинформационни файлове.Получено: 29 април 2022 г.; Прието: 7 февруари 2023 г

Препратки

10. Love, NR et al. NAD киназата контролира биосинтезата на NADP при животни и се модулира чрез еволюционно различни механизми, зависими от калмодулин. Proc. Natl. акад. Sci. 112, 1386–1391 (2015).

Питай за още:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: плюс 86 15292862950