Метформин облекчава неврокогнитивното увреждане при стареене чрез активиране на пътя на AMPK/BDNF/PI3K ЧАСТ 1

Забавянето на свързаното с възрастта неврокогнитивно увреждане е предизвикателство. Ние оценихме терапевтичните ефекти на метформин при стареене, предизвикано от d-галактоза. Освен това проучихме потенциалните молекулярни механизми, които биха могли да бъдат отговорни за ефектите на метформин против стареене. Тридесет мъжки плъха бяха разделени поравно на 1-контролна група, която получи физиологичен разтвор, 2-d-галактоза (D-gal) група, която получи d-галактоза (100 mg/kg/ден) чрез стомашна промивка в продължение на осем седмици, и група, лекувана с 3-d-галактоза плюс метформин (D-gal плюс Met), която получава d-галактоза плюс метформин (200 mg/kg/ден) чрез стомашен лаваж в продължение на осем седмици. Направена е неврокогнитивна оценка. Извършено е измерване на възпалителен, оксидативен стрес и BDNF биомаркери. Бяха оценени генната експресия на AMPK и PI3K. Хипокампалните тъкани бяха дисектирани за хистопатологични и имунохистохимични изследвания. D-gal доведе до неврокогнитивни увреждания, повишаване на възпалителните биомаркери, променени маркери за оксидативен стрес, намален BDNF и намалена експресия на синаптофизин и Bcl2 с повишена експресия на каспаза-3 и понижаване на регулацията на AMPK и PI3K гените. Налице са невродегенеративни промени в хипокампуса. Метформин възстановява значително индуцираните от D-gal невродегенеративни промени. Заключихме, че метформин може да облекчи индуцирания от възрастта неврокогнитивен дефицит чрез облекчаване на невровъзпалението, отслабване на оксидативния стрес, намаляване на апоптозата, както и насърчаване на синаптичната пластичност. Тези механизми могат да бъдат медиирани чрез активирането на AMPK/BDNF/PI3K пътя.

Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Cistanche phenylethanoid гликозидите имат силна способност за изчистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да улавя свободните радикали DPPH и може да улавя реактивни кислородни видове, да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колагена и също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на аниона от свободните радикали на тимина.

Щракнете върху Cistanche на урду за ПРОТИВ СТАРЕЕЕНЕ

【За повече информация: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Съкращения

D-gal d-галактоза

ROS Реактивни кислородни видове

IL-1 интерлевкин-1

IL-1 интерлевкин-1

IL-6 интерлевкин-6

IL-10 интерлевкин-10

TNF- фактор на туморна некроза

BDNF Мозъчен невротрофичен фактор

AMPK AMP-активирана протеин киназа

PI3K/Akt Фосфатидилинозитол 3-киназа/протеин киназа B

RT-PCR Полимеразна верижна реакция с обратна транскриптаза

EPM Издигнат плюс лабиринт

Забавяне на TL трансфер

MDA малондиалдехид

SOD супероксид дисмутаза

MPTP Митохондриална пропускливост преходна пора

H&E Хематоксилин и еозин

iNOS Индуцируема азотен оксид синтаза

NF-κB Ядрен фактор-κB

LTP Дългосрочно потенциране

Постоянната загуба на физиологична функция, умствена гъвкавост и памет, която се случва със стареенето, е многостранен процес, който може да бъде предизвикан от невронна клетъчна смърт1. Очакваната продължителност на живота в много страни се очаква да надхвърли 85 години до 2030 г.2. Поради пониженото качество на живот на възрастните хора и свързаните с това икономически и лични разходи, свързаните със стареенето когнитивни увреждания се очертаха като важен социален проблем. В допълнение, стареенето на мозъка е основната причина за развитието на невродегенеративни заболявания, които често прогресират необратимо3. Понастоящем има малко или никакви ефективни лечения за свързано със стареенето неврокогнитивно увреждане4.

d-галактоза (D-gal), монозахарид, изобилстващ в млечните продукти, обикновено се превръща в глюкоза от ензими. Въпреки това, дългосрочното системно приложение на D-gal може да представлява значителна опасност за здравето5. Предишни изследвания предполагат, че постоянното системно доставяне на D-gal на плъхове може да ги трансформира в модели на стареене и свързани с възрастта невродегенеративни разстройства6. Моделът на стареене D-gal има няколко предимства пред модела на естествено стареене, включително способността да се концентрираме единствено върху процеса на стареене. В модела на естественото стареене съпътстващите заболявания, включително диабет и хипертония, са усложняващи променливи7.

Смята се, че D-gal генерира биохимични аномалии, подобни на тези, наблюдавани в стареещия човешки мозък, като намалената активност на антиоксидантните ензими и отслабването на холинергичните неврони. Усъвършенстваните крайни продукти на гликиране, които са свързани както с нормалното стареене, така и с патофизиологията на много заболявания, се произвеждат чрез взаимодействието на D-gal с протеинови амино групи. Животните, на които е предоставен D-gal, причиняват невровъзпаление, увреждане на митохондриите и окислително увреждане от развитието на реактивни кислородни видове (ROS), заедно с проблеми в привикването към новост, недостатъци в пространственото обучение и когнитивните функции8.

Възпалението може да бъде ключов фактор за когнитивното влошаване сред възрастните хора. Високите нива на интерлевкин-6, IL-1, фактор на туморна некроза и С-реактивен протеин са свързани с повишен риск от заболеваемост и смъртност при възрастни хора9. Хронично лечение с d-галактоза при плъхове индуцира активиране на невронни апоптотични сигнални пътища и невровъзпаление в мозъчната кора и хипокампуса1.

Стареенето води до намаляване на невротрофичния фактор, произхождащ от мозъка (BDNF), който е ключов протеин, участващ в пластични промени, свързани с ученето и паметта, както и жизненоважен медиатор за невронална пролиферация и интегритет10.

Откриването на нови съединения, забавящи стареенето и поддържащи когнитивните функции, се превърна в едно от най-големите предизвикателства. Метформин бързо прониква през кръвно-мозъчната бариера и се натрупва в няколко области на мозъка, включително хипофизната жлеза и хипокампуса11. Доказано е, че дългосрочното приложение на метформин намалява появата на свързани с възрастта патологични усложнения и удължава дълголетието при хората12. Освен това е доказано, че метформин подобрява когнитивното увреждане и поведенческите разстройства като тревожност при диабетици и недиабетици13,14 и пациенти с невродегенеративни заболявания15. Въпреки това, основните механизми на ефектите на метформин за подобряване на свързаните с възрастта неврокогнитивни увреждания са сложни и все още не са напълно разбрани.

Невропротективните ефекти на метформин могат да се дължат основно на активирането на сигналния път на AMP-активираната протеин киназа (AMPK)11. Активирането на AMPK регулира нагоре експресията на BDNF, който има критична роля в синаптичното предаване и консолидирането на паметта10. В допълнение към това добре установено свойство на активиране на AMPK, предишни резултати показват, че метформинът може да подобри паметта чрез възстановяване на оксидативния стрес, намаляване на невровъзпалението и инхибиране на апоптозата, което може да разшири неговите клинични показания в областта на невродегенеративните разстройства14. Метформин е силен активатор на пътя на фосфатидилинозитол 3-киназа/протеин киназа В (PI3K/Akt), който е важен критичен сигнален път за инхибиране на апоптозата и насърчаване на клетъчното оцеляване16.

Като се вземат предвид предимствата на метформин, които включват неговата безопасност, достъпност и използваемост; ние изследвахме невропротективните ефекти на приложението на метформин срещу неврокогнитивно увреждане, причинено от индуцирано от d-галактоза стареене при плъхове. Освен това бяха изследвани основните молекулярни механизми на тези защитни ефекти.

Материали и методи

Животни.Мъжки плъхове албиноси Tirty Wister с тегло 200–250 грама бяха използвани в експеримента след получаване на необходимите одобрения от Изследователската етична комисия във Факултета по медицина, Университет Менуфа, Египет (регистрационен № 10/2022 PHYS 9). Експерименталните процедури следваха указанията на ARRIVE. Плъховете бяха настанени в клетки от телена мрежа (80×40×30 cm). На всички животни е осигурен пълен достъп до храна и вода по време на периода на изследване след кондициониране в продължение на 2 седмици при постоянни условия на околната среда и 12:12-h цикъл светлина/тъмнина.

Експериментален дизайн.Животните бяха разделени на случаен принцип в три групи (10/група):

1. Контролна група: Получен физиологичен разтвор чрез орална сонда.

2. D-галактоза (D-gal) група: Получена d-галактоза (Sigma-Aldrich St. Louis, САЩ), разтворена във физиологичен разтвор в доза от 100 mg/kg телесно тегло чрез стомашен лаваж в продължение на осем последователни седмици17

3. Група, лекувана с d-галактоза плюс метформин (D-gal плюс Met): Получена d-галактоза (със същата доза в групата с D-gal) плюс метформин (Sigma-Aldrich St. Louis, САЩ), разтворен във физиологичен разтвор в доза от 200 mg/kg/ден чрез стомашна промивка в продължение на осем последователни седмици16

След завършване на осем седмици беше направена невроповеденческа оценка на всички плъхове. След това плъховете се анестезират и умъртвяват чрез удължаване и дислокация на шийката на матката. Мозъкът се екстрахира и се промива с фосфатен буферен физиологичен разтвор (рН 7.4). Лявото полукълбо беше претеглено и разделено на две половини; един от тях е използван за биохимичен анализ, а другата половина е използвана за RT-PCR изследвания. Дясното полукълбо се фиксира в 10% формалинов физиологичен разтвор за хистопатологична и имунохистохимична оценка на тъканите на хипокампа.

Невро-поведенчески тестове.Разпознаване на нов обект. Тестът за разпознаване на нов обект беше използван за оценка на способността на плъховете да разпознават нов обект в позната среда. Всеки плъх имаше три дни тестване, което включваше три фази: привикване, обучение и тестване. Плъховете бяха поставени в апарат с открито поле (50 cm × 50 cm × 40 cm) по време на фазата на привикване и им бяха дадени десет минути за адаптиране без никакви предмети. Всеки плъх беше държан в камера с два еднакви предмета в продължение на пет минути по време на фазата на обучение. След двадесет и четири часа всеки плъх беше поставен в камерата за пет минути по време на тестовата фаза, която включваше замяната на един от старите предмети с нов. Хронометърът се използва за измерване на продължителността на изследването на обекта. Индексът на дискриминация [=(време за изследване на нов обект–време за изследване на семеен обект)/общо време за изследване × 100 процента] се използва за оценка на когнитивното представяне на плъхове. Използван е алкохол за почистване на откритото поле и предметите между плъховете18.

Водният лабиринт на Морис. Водният лабиринт на Морис беше използван за изследване на въздействието на метформин върху пространственото обучение и паметта. Басейнът е направен от неръждаема стомана с диаметър 210 cm и височина 50 cm, включително потопена платформа за спасяване на 1 cm под повърхността на водата. Водата се поддържа на 24±1 градуса. Задачата за придобиване беше тествана в продължение на пет дни тестване с четири опита всеки ден. Времето, необходимо за достигане до тайната платформа по време на всяко изпитание, беше записано като латентност за бягство. На плъховете бяха дадени максимум 60 секунди, за да открият скритата платформа. Определен е максимален срок от 60 s и плъхът е насочен ръчно към скритата платформа. Изпитване с една сонда беше проведено 24 часа след последното изпитване на петия ден. Платформата се отстранява и плъхът се поставя в басейна от квадранта, противоположен на тренировъчния квадрант. След това плъхът беше оставен свободно да плува в продължение на 60 s. Времето, прекарано в целевия квадрант, беше записано19.

Тестът за повдигнат плюс-лабиринт (EPM). EPM е утвърдена техника за оценка на подобно на тревожност поведение при плъхове. Изработена е от дърво и се състои от отворени и затворени рамена (50 см дължина × 10 см ширина). Двата затворени ръкава бяха оградени от стени с височина 40 см. Ръцете бяха прикрепени към централна квадратна платформа (10 × 10 cm). Апаратът беше на 50 см над пода. Всеки плъх се поставя в центъра на апарата с лице към затворена ръка и се оставя да се движи свободно в продължение на пет минути. Записва се времето, прекарано в отворени и затворени ръце. Също така бяха записани записи с отворени ръце в 20. Ние също така измерваме латентността на трансфера (TL), която се използва за оценка на паметта и ученето. През първия ден (сесията за придобиване), всеки плъх беше изложен на EPM за 90 s. Времето, необходимо на плъха да достигне затворената ръка, се записва като TL. Плъхове, които не са успели да влязат в затворени ръце за 90 s, са изключени от проучването. На втория ден (сесията на задържане), всеки плъх се поставя в отворената ръка и TL се записва за максимум 90 s21.

Биохимичен анализ.Мозъчната тъкан се перфузира с PBS разтвор, след което се хомогенизира в 5 ml студен буфер на грам тъкан. Центрофугирането на мозъчната тъкан се извършва при 4000 rpm за 15 минути, след което супернатантата се отстранява и се съхранява при -80 градуса до измерване на малондиалдехид (MDA) и супероксид дисмутаза (SOD) с помощта на конвенционален колориметричен (QuantiChrom™, BioAssay Systems, САЩ), серумен фактор на туморна некроза (TNF-), интерлевкин 10 (IL-10) и мозъчен невротропен фактор (BDNF) чрез използване на комплект ELISA (Quantikine, компания Abcam, Кеймбридж, Обединеното кралство) според производителя инструкции.

Количествен анализ на експресията на AMPK и PI3K гени с помощта на техника на полимеразна верижна реакция с обратна транскриптаза (RT-PCR).Мозъчните тъкани бяха подготвени за пълно изолиране на РНК с помощта на Qiagen RN Easy plus Universal Kit от САЩ. След това качеството и чистотата на РНК бяха осигурени. РНК се съхранява при -80 градуса до употреба. След това първата стъпка беше синтез на кДНК с помощта на комплект за обратна транскрипция QuantiTect, Qiagen от САЩ, с помощта на термоциклер Applied Biosystems 2720 (Сингапур) само за един цикъл. GAPDH праймери се използват в RT-PCR реакции като контрола за натоварване на РНК. Втората стъпка беше cDNA амплификация: cDNA беше използвана в базирана на SYBR зелена количествена PCR в реално време за относително количествено определяне (RQ) на експресията на AMPK и PI3K гени от SensiFASTTMSYBR Lo-ROX Kit, САЩ, като се използват следните проектирани праймери (Midland, Texas ): Предварителният праймер за AMPK беше (TGCGTGTACGAAGGAAGAATCC). И обратният праймер беше (TGTGACTTCCAGGTCGGGAGTT). Правият праймер за PI3K беше (AGCTGGTCTTCGTTTCCTGA), а обратният праймер беше (GAAACTTTTTCCCACCACGA). Накрая беше направен анализ на данните със софтуера Applied Biosystems 7500 версия 2.0.1. RQ на генната експресия на AMPK и PI3K се извършва с помощта на сравнителен ∆∆Ct метод, където количеството на целевите гени (AMPK и PI3K) mRNA се нормализира към ендогенен референтен ген (GAPDH) и спрямо контрола.

Хистопатологична оценка на мозъчната тъкан.Хистологично изследване. Мозъчната тъкан се фиксира в 10% разтвор на формалин, вграден в парафин и се получават серийни коронарни срезове с дебелина 5 μm. След това секции от мозъчния хипокампус се оцветяват с хематоксилин и еозин (H&E) за изследване със светлинен микроскоп.

Имунохистохимично оцветяване на хипокампуса. Имунохистохимично оцветяване на каспаза-3 (CAT номер: ab32351, Abcam компания 152 Grove Street Waltham, M02453, САЩ) и синаптофизин (CAT номер: ab32127, Abcam компания 152 Grove Street Waltham, M02453, САЩ) бяха извършени с помощта на заек моноклонални антитела. За Bcl-2 (CAT номер: ab59348, компания Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, САЩ), това се случи чрез използване на заешки поликлонални антитела. Те бяха получени в един флакон, съдържащ 1 ml антитяло. Анти-каспаза-3, анти-синаптофизин и анти-Bcl-2 бяха използвани в разредени количества съответно 1:50, 1:400 и 1:100. Срезовете се нарязват на 5 µm и се оцветяват с автоматизиран имунооцветител LINK 48 (Dako, Agilent Technologies Inc, Санта Клара, САЩ). За възстановяване на топлината се използва цитратен буфер чрез имунооцветител. Слайдовете се оцветяват автоматично с първично разредени антитела. Положителна контрола за реакцията беше извършена с помощта на специфични вградени в парафин участъци от нормална човешка сливица, човешки панкреас и фоликуларен аденом за каспаза-3, синаптофизин и Bcl-2, съответно. Отрицателните контроли бяха направени чрез заместване на първичните антитела с неимунен серум.

Оценката на хистопатологията и имунохистохимичните маркери (каспаза-3, синаптофизин и Bcl-2) беше извършена в различни области на хипокампуса, включително CA1, CA2 и CA3.

Статистически анализ.Резултатите са изразени като средно ± стандартно отклонение (SD). Анализът на отклоненията (ANOVA) беше използван за статистически анализ на различните групи, като се използва софтуер Origin® и вероятността за случайност (p стойности). P стойности<0.05 were considered significant.

Етично одобрение и съгласие за участие.Тази работа беше одобрена от и от насоките на Комитета по етика на Медицинския факултет, Университет Менуфа, Египет.

Резултати

Невро-поведенчески тестове.По отношение на теста за нов обект, процентът на индекса на дискриминация е значително по-нисък в групата на D-gal в сравнение с контролната група (-37.16±3.31 процента срещу 30.16±2.92 процента, съответно, P<0.05). The percentage of discrimination index was significantly higher in the D-gal+Met group  (16.66±4.67%, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, this percentage is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 1).

По отношение на теста за лабиринт на Морис, средната стойност на продължителността на латентността на бягство е значително по-висока през първия, втория, третия, четвъртия и петия ден в групата на D-gal в сравнение с контролната група (58,16±1,94, 4{ {19}}.62±1.33, 32.75±1.10, 24.37±1.58 и 15.29±0.98 s срещу 40.16±2.92, 25.16±1.15, 17.04±1.08, 11.75±1.31 и 5.83±0. 86 s, съответно, P<0.05). The means value of the duration of escape latency was significantly lower in the D-gal+Met group in the five training days (50±1.41, 34.08±1.15, 25.16±1.31, 16.04±1.75,   and 10.25±1.01 s, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean values of the durations of escape latency in the five training days in the D-gal+Met group were still significantly higher when compared with the control group. The means value of the duration that the rats spent in the target quadrant were significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 23.50±1.87 s,   respectively, P < 0.05). However, the mean value of the duration that the rat spent in the target quadrant was significantly higher in the D-gal+Met group (19.66 ± 2.16 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group.  However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 2).

В теста с повдигнат плюс-лабиринт, средната стойност на продължителността, която плъховете прекарват в отворени ръце, е значително по-ниска в групата на D-gal в сравнение с контролната група (60±6,54 s срещу съответно 90,83±3,48 s , П<0.05). On the other hand, the mean value of the duration that the rats spent in the open arms was significantly higher in the D-gal+Met group (73.83±5.41 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly lower when compared with the control group. On the contrary, the mean value of the duration that the rats spent in the closed arms was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (107.33±3.07 s vs. 57.66±5.12 s respectively, P<0.05). The means value of the duration that the rats spent in the closed arms were significantly lower in the D-gal+Met group (74.66±2.58 s, P<0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group. The mean value of the number of open-arm entries was significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 32.33±3.07, respectively, P<0.05). On the contrary, the mean value of the number of open-arm entries was significantly higher in the D-gal+Met group (21.66±2.16,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group. The mean value of the duration of the transfer latency was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (48.33 ±6.88 s vs. 25 ±1.87 s, respectively, P < 0.05). While the mean value of the duration of the transfer latency was significantly lower in the D-gal+Met group (34.66±3.77 s,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group (Fig. 3).

Биохимични изследвания.Средната стойност на нивото на MDA в мозъка е значително по-висока, докато средната стойност на нивото на SOD в мозъка е значително по-ниска в групата на D-gal в сравнение с контролната група (70±3,23 nmol/mg протеин и 13,05±1.{{7 }} U/mg протеин срещу съответно 33,76±2,13 nmol/mg протеин и 29,11±4,34 U/mg протеин, P<0.05). The mean value of brain MDA level was significantly lower, while the mean value of brain SOD level was significantly higher in the D-gal+Met group (50.02±4.26 nmol/mg protein and  21.90±2.33 U/mg protein, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean value of MDA is still significantly higher, and the mean value of SOD is significantly lower when compared with the control group (Fig. 4a,b).

Средната стойност на нивото на мозъчния TNF- беше значително по-висока, докато средната стойност на нивото на мозъчния IL-10 беше значително по-ниска в групата на D-gal в сравнение с контролната група (67,50 ± 10,03 pg/mg протеин и 72,91 ±8,45 pg/mg протеин срещу съответно 16,61 ±1,21 pg/mg протеин и 157,23 ±12,46 pg/mg протеин, P<0.05). The mean value of brain TNF-α level was significantly lower, while the mean value of brain IL-10 level was significantly higher in the D-gal+Met group (49.83±1.89 pg/mg protein and 131.67±4.54 pg/mg protein,   respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. But, the mean value of TNF-α was still significantly higher, and the mean value of IL-10 was significantly lower when compared with the control group (Fig. 4c,d).

Средната стойност на мозъчното ниво на BDNF е значително по-ниска в групата на D-gal в сравнение с контролната група (125,72±4,17 pg/mg протеин спрямо съответно 225,20±5,52 pg/mg протеин, P<0.05). The mean value of brain BDNF level was significantly higher in the D-gal +Met group (215.03±3.65 pg/mg protein, P < 0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 5).

Количествена RT‑PCR (qRT‑PCR). Експресията на гените AMPK и PI3k (0.52±0.11 и 0.37±0.03, съответно, P<0.05) was significantly down-regulated in the D-gal group when compared with the control group (1). However, the expression of AMPK and PI3k genes was significantly up-regulated in the  D-gal+Met group (0.95±0.08 and 0.98±0.04, respectively, P<0.05), when compared with the D-gal group, but it was insignificantly changed (P>0.05) в сравнение с контролната група (фиг. 6).

Хистопатология.H&E оцветяването на хипокампалната тъкан в контролната група разкрива незабележими патологични промени. D-gal групата показва много невронална дегенерация и апоптотични тела с масивен оток и глиоза. Въпреки това, секциите на групата D-gal плюс Met показват малко невронални дегенерации и малко апоптотични тела с лек оток и лека фокална глиоза (фиг. 7).

Имунохистохимия. Имунохистохимичните резултати разкриват, че стойността на Н резултата на експресията на синаптофизин в хипокампалната тъкан е значително по-ниска (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (100±5.78 vs. 260±4.03). However, the expression of synaptophysin (180±5.26) in hippocampal tissue in the D-gal+Met group was significantly higher when compared with the D-gal group. However, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 8).

Стойността на H резултата на експресията на каспаза-3 в хипокампалната тъкан е значително по-висока (P<0.05) in the  D-gal group when compared with the control group (279±5.35 vs. 89±3.54). On the other hand, the H score value of the caspase-3 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (151±4.73) was significantly lower when compared with the D-gal group, but still significantly higher when compared with the control group  (Fig. 9). 

Стойността на H резултата на експресията на Bcl-2 в хипокампалната тъкан е значително по-ниска (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (161±4.36 vs. 301±6.11). While the H score value of Bcl-2 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (179±7.48) was significantly higher when compared with the D-gal group, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 10).

Дискусия

Увеличаването на средната продължителност на живота увеличава риска от заболяване при възрастните хора, особено в когнитивната сфера, което може да се дължи, поне отчасти, на загуба на неврони в мозъка. Добре прието е, че дългосрочното инжектиране на d-галактоза допринася за напредъка на стареенето и леки невронални увреждания и дефекти на паметта. Тъй като стареенето, предизвикано от D-galin, е придружено от невродегенерация, това може да бъде идеален модел за изучаване на молекулярните механизми, свързани с невродегенерацията, свързана с възрастта, и за тестване на нови терапевтични подходи22.

Нашето проучване показа, че хроничното приложение на D-gal уврежда провокираното от новост поведение и работната памет при плъхове. Това беше очевидно в резултатите от новия обект, водния лабиринт на Морис и тестовете с повдигнат плюс лабиринт. Тези резултати са в съответствие с други отчетени проучвания23. От друга страна; лечението с метформин подобри работната памет и предпочитанието за новости в сравнение с групата на D-gal. В подкрепа на нашите резултати, предишно проучване съобщава, че метформин подобрява краткосрочната памет при индуцирани от стрептозотоцин диабетни мишки24. Добре документирано е, че стареенето е свързано не само с намаляване на когнитивните функции, но и с емоционални промени, включително подобно на тревожност поведение, което води до функционално увреждане25. В настоящото проучване резултатите от EPM теста показват повишено подобно на тревожност поведение в групата на D-gal в сравнение с контролната група. Докато лечението с метформин отслабва подобно на тревожност поведение.

Настоящото проучване разкрива, че невроповеденческите промени, причинени от перорално приложение на D-gal, са придружени от нарушения в мозъчните маркери за оксидативен стрес. Средната стойност на нивото на MDA в хомогената на мозъчната тъкан е значително по-висока, докато активността на антиоксидантния ензим SOD е значително по-ниска в групата на D-gal в сравнение с контролната група. Подобни резултати бяха докладвани по-рано 23, 26. D-gal взаимодейства с различни свободни амини в протеиновата архитектура чрез неензимно гликиране, което води до генериране на напреднали продукти на гликиране. Това води до генериране на ROS, което увеличава стареенето на мозъка чрез окислително увреждане на ДНК, липиди и протеини. Загубата на паметта и увреждането на ученето, предизвикани от хронично приложение на D-gal, могат да се отдадат на генерирането на свободни радикали, което води до увреждане на неврогенезата и в крайна сметка до невродегенерация27. Освен това мозъчните неврони са по-податливи на оксидативен стрес поради наличието на високо липидно съдържание и по-висока консумация на кислород26.

Напротив, приложението на метформин значително възстановява редокс баланса. Доказателствата показват, че метформин може да инхибира преходната пора на митохондриалната пропускливост (mPTP) и да намали производството на ROS и липидната пероксидация28. Следователно, това показва, че анти-стареещият ефект на метформин може евентуално да бъде медииран от неговата антиоксидантна защита.

Освен оксидативния стрес, възпалението също е важен механизъм, предизвикващ стареене, при лечение с D-gal. D-gal насърчава генерирането на ROS, които активират възпалителни пътища3. Хроничното невровъзпаление и секрецията на провъзпалителни цитокини са отличителни белези на стареенето29. Съществува споразумение, че възпалителните цитокини участват в оксидативния стрес. TNF-, IL-6 и IL-1 са от съществено значение за развитието и прогресирането на оксидативния стрес. Тези цитокини са свързани с ROS и активират ядрен фактор-κB (NF-κB), за да се преместят в ядрото и да регулират експресията на провъзпалителни гени като iNOS и COX2, които участват във възпалителни и имунни отговори и следователно водят до фиброза, апоптоза и отговори на острата фаза, които причиняват увреждане на органи30. Гореспоменатите данни са в съответствие с нашите резултати, тъй като нивото на TNF-алфа е значително по-високо, а IL-10 е значително по-нисък в D-gal групата в сравнение с контролната група.

От друга страна, лечението с метформин води до значително намаляване на възпалителните маркери в сравнение с групата на D-gal. Противовъзпалителните ефекти на метформин могат да се отдадат на активирането на AMPK сигнализацията, която потиска възпалителните реакции чрез инхибирането на NF-κB29. Също така намалява производството на провъзпалителни цитокини и микроглиалното активиране в мозъка, което от своя страна намалява оксидативния стрес30

За по-нататъшно разбиране на молекулярните механизми, които са в основата на действията на метформин, ние изследвахме протеиновите експресии на AMPK и PI3k. Нашето проучване разкри, че експресията на AMPK е значително понижена в групата на D-gal в сравнение с контролната група, докато нивото му е значително повишено в групата, лекувана с метформин, в сравнение с групата на D-gal. Предишни проучвания съобщават, че активирането на AMPK и реакцията на AMPK намаляват с възрастта, което може да обясни променената метаболитна регулация, водеща до намалена автофагия и увеличаване на оксидативния стрес31. Установено е, че метформин активира AMPK чрез увеличаване на фосфорилирането на AMPK при Tr-17232. AMPK е основната цел на метформин поради защитната му функция срещу нарушаване на когнитивните способности. Ghadernezhad и др. съобщават, че индуцираното от метформин активиране на AMPK води до активиране на пътя BDNF/P70S6K в невроните на хипокампа за подобряване на формирането на памет при задача за пасивно избягване в глобален модел на плъх с церебрална исхемия/реперфузия. Активирането на BDNF има жизненоважна роля в регулирането на неврокогнитивните функции като учене, памет, синаптично предаване и пластичност 33. Няколко проучвания показват, че AMPK може да действа като модулатор на дългосрочното потенциране (LTP) и е необходим за формирането на памет 34 . Следователно, индуцираното от метформин подобрение на паметта в нашето проучване може да бъде медиирано чрез AMPK сигнализиращо активиране.

【За повече информация: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】