Методи за генериране и оценка на модели на рибки зебра на човешки бъбречни заболявания, част 1

РЕЗЮМЕ

Свързаните с бъбреците заболявания засягат милиони хора по света. Проучване на пациенти с хронично бъбречно заболяване (ХБЗ) показа, че тежестта на бъбречните заболявания се увеличава всяка година. Проучването на глобалното бреме на болестта (GBD) от 2017 г. класира ХБН като 12-та водеща причина за смърт в света. Следователно идентифицирането на причините за бъбречните заболявания, разработването на точни диагностични методи и нови терапевтични средства са от голямо значение. Моделните организми, които вярно рекапитулират човешките болести, играят важна роля в разбирането на болестния процес и предоставят ценна основа за намиране на тяхното лечение. Zebrafish е отличен модел за изследване на развитието, патофизиологията и молекулярните аспекти на човешките бъбречни заболявания. В този преглед ние обобщаваме различни генетични и експериментални манипулации, които могат да бъдат извършени при рибки зебра, за да разберем по-добре патофизиологията на човешките бъбречни заболявания. Предполагаме, че тези методи ще бъдат полезни при разработването на потенциални терапии за лечение на бъбречни заболявания.

Според съответните проучвания,цистанчее традиционна китайска билка, която се използва от векове за лечение на различни заболявания. Научно доказано е, че притежава противовъзпалителни, против стареене и антиоксидантни свойства. Проучванията показват, че цистанхата е полезна за пациенти, страдащи от бъбречни заболявания. Известно е, че активните съставки на цистанче намаляват възпалението, подобряват бъбречната функция и възстановяват увредените бъбречни клетки. По този начин интегрирането на цистанхе в план за лечение на бъбречно заболяване може да предложи големи ползи на пациентите при управлението на тяхното състояние. Cistanche помага за намаляване на протеинурията, понижава нивата на BUN и креатинина и намалява риска от по-нататъшно увреждане на бъбреците. В допълнение, цистанче също помага за намаляване на нивата на холестерола и триглицеридите, което може да бъде опасно за пациенти, страдащи отзаболяване на бъбреците.

Кликнете върху Cistanche Norge

За повече информация:

David.deng

@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

КЛЮЧОВИ ДУМИ:CKD, AKI, модел на риба зебра на човешки бъбречни заболявания, пронефрос, бъбречна патология

Въведение

Бъбрекът е един от жизненоважните органи при гръбначните животни, който отстранява отпадъчните продукти и поддържа концентрациите на pH, йони и метаболити в кръвта в рамките на физиологичния диапазон. Бъбрекът отделя еритропоетин, който регулира производството на червени кръвни клетки и активира витамин D, който помага на костите да абсорбират калций. Във всеки човешки бъбрек има около един милион нефрона, които са структурните и функционални единици на този орган. Следователно, дефектите в нефроните засягат структурата и функциите на бъбреците. Дисфункция на бъбреците може да възникне поради генетични мутации, инфекции, наранявания, лекарства или излагане на токсични съединения в околната среда. Хроничните заболявания като диабет, сърдечно-съдови заболявания и хипертония допринасят основно за тежестта на бъбречните заболявания (Levey et al., 2010). Нарушената бъбречна функция повишава риска от усложнения и в други органи (Thomas et al., 2008). Често срещаните видове бъбречни заболявания и техните причини са посочени в таблица 1.

Бъбречни заболявания

Бъбречните заболявания допринасят за значителна част от тежестта на заболяването в световен мащаб. Около 750 милиона души по света са засегнати от заболявания, свързани с бъбреците (Crews et al., 2019). ХБН е най-разпространено сред тях с глобално разпространение от 13,4 процента (Hill et al., 2016). Проучването на GBD от 2010 г. класира ХБН като 18-та водеща причина за смърт в световен мащаб, която скочи до 12-та до 2017 г. за причиняване на максимален брой смъртни случаи в световен мащаб (Jha et al., 2013; Carney, 2020). Според проучването на GBD през 2017 г. в света са докладвани около 697,5 милиона случая на ХБН, сред които 1,2 милиона души са починали. Смята се, че броят на смъртните случаи, дължащи се на ХБН, ще нарасне до 4 милиона до 2040 г. в най-лошия сценарий (Foreman et al., 2018). Една трета от пациентите с ХБН живеят в две страни, Китай и Индия (Bikbov et al., 2020). Състоянието на ХБН сред индийското население е неясен поради липсата на точни системи за събиране на данни. Около 115 милиона случая на ХБН са докладвани в Индия през 2017 г. (Bikbov et al., 2020). Най-често срещаните заболявания в индийското население са диабет и хипертония (Geldsetzer et al., 2018). Според доклада на Индийския съвет за медицински изследвания (ICMR), разпространението на диабет и хипертония сред възрастното градско население е съответно 28 процента и 21,4 процента (Varma, 2015). Между 40% и 60% от случаите на ХБН се дължат на тези усложнения и техният брой бързо нараства (Rajapurkar et al., 2012). Центърът за данни за бъбречни заболявания на Международното дружество по нефрология съобщава за 16,8% разпространение на CDK сред индийското население (Ene-Iordache et al., 2016). Причините за ХБН варират в Индия. Андхра Прадеш, Одиша и Гоа съобщават за високи нива на ХБН с неизвестна етиология, известна като хронична интерстициална нефропатия (Varughese and Abraham, 2018). Тъй като броят на пациентите с ХБН се увеличава в световен мащаб с тревожна скорост, има спешна нужда да се извърши задълбочен анализ на основните причини за често срещаните бъбречни заболявания, за да се намерят по-добри начини за тяхната превенция и лечение. Моделните организми, които могат да имитират човешката физиология и болестни състояния, могат да осигурят чудесни възможности за справяне с горните проблеми. Рибките зебра се превърнаха в полезен модел за изследване на развитието и болестите и предоставят обещаващи начини за идентифициране на нови терапевтични цели и лекарства. В този преглед обсъдихме различни методи за рекапитулация на човешки бъбречни заболявания при зебра и как тези модели могат да се използват за разбиране на патогенността на заболяването и неговите основни молекулярни механизми. Това може да доведе до създаването на нови терапевтични подходи за управление и лечение на бъбречни заболявания.

Прилики между човешки бъбрек и бъбрек на зебра

Развитието на бъбреците при бозайниците е уникално, тъй като се осъществява чрез три различни структури по време на ембриогенезата: пронефрос, мезонефрос и метанефрос. Първите две структури са преходни при бозайниците и само метанефросът продължава през целия живот (Smyth et al., 2017; Jain, 2014). Пронефрос е функционалният бъбрек по време на ембрионалното развитие при нисши гръбначни като земноводни и риби, който се заменя от мезонефрос като функционален бъбрек на по-късни етапи (Tahara et al., 1993; Diep et al., 2015). Таблица 2 описва времевата продължителност на различните форми на бъбрек при хора, мишки, Xenopus и риба зебра.

Въпреки че цялостната сложност на бъбреците се увеличава с придвижването към по-високите форми, нефроните са структурните и функционални единици на всички видове бъбреци. Всеки нефрон има три части: бъбречно телце за филтриране на кръвта, тубул за абсорбиране и отделяне на разтворени вещества и събирателен канал за събиране на нежелани отпадъци за екскреция. Тубулният епител е оформен в различни сегменти, за да изпълнява специфични функции. Нефроните от всички форми на бъбреците притежават подобен модел на сегментиране (Desgrange and Cereghini, 2015). Сегментната организация на нефрона на пронефрос и мезонефрос на риба зебра е подобна на метанефроса на бозайник, както е показано на Фиг. 1. Пронефричният тубул на рибата зебра е разделен на проксимален извит тубул (PCT), проксимален прав тубул (PST) и дистален ранен (DE ) и дистални късни (DL) тубули, които са аналогични на сегментационния модел на метанефричните нефрони на бозайниците. Рибките зебра имат ендокринна жлеза, наречена корпускули на Stannius (CS), която поддържа калциевата хомеостаза (Krishnamurthy, 1976). CS се формира чрез трансдиференциране на бъбречни епителни клетки между DE и DL сегменти, които постепенно се отделят от тубула и образуват сдвоената CS жлеза, която е разположена ретроперитонеално на повърхността на бъбрека при възрастни риби (Roberts and Ellis, 2012; Naylor). и др., 2018). Една от основните разлики между нефроните на рибата зебра и бозайника е липсата на верига на Хенле в рибата зебра, която действа като мултипликатор на противоток за генериране на медуларен осмотичен градиент за опазване на водата. Този сегмент няма никаква полза при рибата зебра, тъй като е сладководна риба (Elmonem et al., 2018). Всеки сегмент притежава различни типове клетки и специфични за сегмента генни експресии, които са запазени сред гръбначните животни (Verlander, 1998; Desgrange и Cereghini, 2015). Всички видове бъбреци следват сходни пътища на развитие. Следните четири етапа участват последователно в развитието на нефрона; A: индукция на междинна мезодерма за образуване на бъбречен примордиум, B: епителизация и растеж на нефричния канал, C: моделиране на нефрона в специализирани сегменти и D: васкуларизация на нефрона за филтриране на кръвта (Drummond, 2003).

Методи за генериране на модели на риба зебра на човешки бъбречни заболявания

Рибките зебра притежават една двойка пронефроси, които започват да се образуват след 12 часа след оплождането (hpf) и стават напълно функционални с 48 hpf. Наличието на пълна геномна последователност, 71 процента човешки гени с поне един ортолог на риба зебра, лекота на боравене, прозрачни ембриони, кратко време за генериране, ефективни техники за манипулиране на гени, методи за генериране на трансгенни риби и нейното бързо скриниране правят рибата зебра най-подходящия моделен организъм за изследване на аномалии на бъбреците (Howe et al., 2013; Poureetezadi and Wingert, 2016). Една от ключовите характеристики на възрастните риби зебра е способността им да регенерират нови нефрони чрез процеса на неонефрогенеза в отговор на бъбречно увреждане (Chambers and Wingert, 2016). Таблица 3 описва сравненията между рибата зебра и други общи модели организми като мишки и Xenopus. Генетичните манипулации при рибките зебра показват, че новите генетични компоненти на развитието и функцията на бъбреците могат да бъдат идентифицирани с помощта на този модел на организъм (Poureetezadi и Wingert, 2016). Има няколко метода за генериране на модели на риба зебра на човешки бъбречни заболявания.

Генетика напред

Предният генетичен екран се използва за идентифициране на гени, които са свързани с интересуващи се фенотипове (Lawson and Wolfe, 2011). Както химическата, така и инсерционната мутагенеза се използват при предварителни генетични екрани (Patton and Zon, 2001). Химическата мутагенеза е базиран на три поколения скрининг, при който възрастните мъже се третират с химически мутагени като етил метан сулфонат (EMS), етил нитрозоурея (ENU) или физически мутагени като гама радиация за генериране на няколко мутации в зародишните клетки (Варшни и Бърджис, 2014). След това рибите, носещи мутации, се кръстосват с женски от див тип, за да се генерират F1 риби, които съдържат уникални алели на генерирана мутация. F1 рибите се кръстосват, за да се генерират F2 носители, които след това се кръстосват, за да се получат техните хомозиготни мутанти в F3 поколение. След това потомството, което има желаните фенотипове, се изолира и използва за генетично картографиране и секвениране за идентифициране на мутиралия ген (Patton and Zon, 2001). Други варианти на този екран, като използването на хаплоиден и хомозиготен диплоид, могат да помогнат за намаляване на времето и усилията, необходими за идентифициране на фенотипа и причинната генетична мутация (обсъдено подробно от Patton and Zon, 2001). Трансгенни репортерни линии, експресиращи флуоресцентни протеини в представляващия интерес орган, могат да се комбинират с конвенционален преден генетичен скрининг за лесно скриниране на мутанти, представляващи интерес. Екран за мутагенеза, базиран на ENU, доведе до идентифицирането на мутантната рибка зебра с електрическа крушка (lib), която показва морфологични и сегментационни дефекти на нефрона, подобни на ембрионите на рибка зебра с дефицит на ретиноева киселина (RA). Беше установено, че lib мутанти имат преход С към А при нуклеотид 174 на aldh1a2, за който се предвижда да синтезира пресечен протеин с дължина 58 аминокиселини, като по този начин отменя функцията на aldh1a2 и засяга синтеза на RA от ретиналдехид. Анализът на lib, neckless (nls) мутант с точкова мутация в каталитичния домейн на aldh1a2 и DEAB (инхибитор на синтеза на ретиноева киселина) третирани ембриони разкри, че нивата на RA модулират сегментацията на нефрона чрез промяна на пространствената експресия на специфични за сегменти транскрипционни фактори (Wingert и Davidson, 2011; Begemann et al., 2001; Mullins et al., 1994). Друг мутант, наречен Zeppelin, помогна да се идентифицира brac2 като регулатор на развитието на подоцитите (Kroeger et al., 2017).

Инсерционната мутагенеза е транспозонен или антивирусен метод, който се използва за произволно вмъкване на ДНК в различни геномни локуси и тази чужда ДНК след това помага за идентифицирането на мутиралия ген (Amsterdam et al., 1999). Лабораторията Хопкинс в Масачузетския технологичен институт извърши инсерционен мутагенезен скрининг в ембриони на риба зебра, използвайки ретровирусен вектор. Те идентифицираха 12 гена, които бяха свързани с дефектни бъбречни фенотипове, показващи кисти в гломерулната тубулна област, сред които четири бяха свързани с образуването на реснички (Sun et al., 2004). Недостатъците на предния генетичен подход са, че процесът на скрининг е тромав и отнема много време. Въпреки това, напредъкът в новата технология за секвениране направи предходния генетичен подход много по-ефективен.

Нокаут на ген с помощта на програмируеми нуклеази

Едно от основните предимства на използването на риба зебра като модел на организъм е наличието на ефективни техники за редактиране на генома като CRISPR/Cas, TALEN и ZFN (Sertori et al., 2016). CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/ Cas9 е най-универсалната и често използвана технология за редактиране на генома при рибките зебра. Химера на CRISPR РНК (crRNA) и транс-активираща crRNA (tracrRNA) е проектирана като единична направляваща РНК (sgRNA), която заедно с Cas9 протеин/mRNA се инжектира в ембриони на риба зебра в едноклетъчен стадий (Varshney et al. , 2016). SgRNA се свързва с 20bp таргетната ДНК последователност в съседство с протоспейсър съседен мотив (PAM) NGG последователност в генома, Cas9 след това генерира двойноверижно разрязване в таргетната ДНК последователност. След това за предпочитане това се поправя чрез свързване на нехомоложни краища, което е податлив на грешки механизъм за поправка, който води до генериране на произволно вмъкване/изтриване (indel), водещо до промени в рамката за четене на кодиращата последователност, и следователно отменя функции на интересуващия ни ген. През последните години бяха разработени усъвършенствани методологии за повишаване на ефикасността на базираната на CRISPR техника за редактиране на геном (Liu et al., 2019). Възможно е да се изтрие голям фрагмент от ДНК, като се използват две или повече sgRNA наведнъж (Kim and Zhang, 2020). Възможно е също така да се насочат едновременно множество гени ефективно в един ембрион на риба зебра (Shah et al., 2016). Проведени са много проучвания за генериране на мутанти на зебра за рекапитулация на човешки бъбречни заболявания чрез използване на технологията CRISPR/Cas9. CRISPR-медииран нокаут на протеина на цилиарната мембрана Arl13b доведе до генерирането на мутанти, които имитират "синдрома на Жубер" (Cantagrel et al., 2008). Съобщава се, че мутациите в човешкия ген ELMO1 допринасят за диабетна нефропатия. elmo1 мутантната риба зебра показва фенотипове, наблюдавани в хипергликемични ембриони, генерирани от нокдаун на pdx1 гена, като по-голям гломерул, дефектен подоцит, по-къс врат и хиперфилтрация, като по този начин подчертава запазената функция на този ген (Sharma et al., 2016). Мутантната рибка зебра magi2a проявява резистентен към стероиди нефротичен синдром, който също се наблюдава при хора с мутации в MAGI2 (Jobst-Schwan et al., 2019). Тези наблюдения подчертават пригодността на рибата зебра като организъм за моделиране на човешки бъбречни заболявания.

Друг метод за генериране на мутанти на риба зебра са ефекторни нуклеази, подобни на активатор на транскрипция (TALEN), базирани на редактиране на генома. При тази техника ДНК свързващият домен TALE е изграден от мономери, като всеки мономер се състои от тандемни повторения на 34 аминокиселинни остатъка, които се свързват с определен нуклеотид в ДНК последователността. Тези TALE последователности са получени от патогенната бактерия Xanthomonas, която променя транскрипцията на гени в клетките гостоприемници (Boch и Bonas, 2010). Насочващият конструкт TALEN се състои от сигнал за ядрена локализация, ДНК свързващ домейн и FokI нуклеазен домен в техните карбоксилни краища. TALEN работят по двойки, като техните места на свързване са разположени на противоположни нишки на ДНК, разделени от 12 до 25 bp спейсерна последователност. Конструкциите се свързват с целевото място в ядрото и генерират двуверижно прекъсване, което след това се поправя чрез нехомоложно крайно свързване (Liu et al., 2014). Мутантната риба зебра, генерирана от CRISPR или TALEN, може да активира гени, които компенсират загубата на интересни гени, като по този начин затруднява разкриването на генната функция (Rossi et al., 2015). Въпреки това е възможно да се идентифицират тези компенсаторни гени чрез анализ на транскриптоми, като се използват методи за секвениране от следващо поколение (NGS), които могат да помогнат за идентифициране на функцията на гена, който представлява интерес. Идентифицирането на гени и молекулярни пътища, които компенсират загубата на функция на ген, може да помогне за намирането на нови методи за лечение на генни мутации, които причиняват сериозни заболявания (El-Brolosy и Stainier, 2017).

Генен нокдаун с помощта на морфолино антисенс олиго

Морфолино са неанионни олигонуклеотиди, които са относително стабилни в сравнение с техните ДНК или РНК олигомери (Summerton, 1999). Морфолино антисенс олигонуклеотидите се свързват с иРНК на целевия протеин в неговото място за иницииране на транслацията и блокират транслацията му. Друг тип морфолино антисенс олигонуклеотиди могат да се насочат към сплайсинг връзки и да блокират пре-mRNA сплайсинг (Summerton, 1999). Морфолино-антисенс олиго ефектът е преходен и може да се използва за изследване на ролята на ранното развитие на интересуващите ни гени. Инжектирането на морфолино-антисенс олигонуклеотид се извършва на 1-4 клетъчен етап на ембриони на риба зебра и неговият ефект може да се види до 3-5 дни след оплождането (pdf) (Bill et al., 2009). Морфолино антисенс олигонуклеотидите често проявяват нецелеви ефекти (Robu et al., 2007). Контролни експерименти като спасителен експеримент трябва да се извършват чрез инжектиране на морфолино заедно с иРНК, която не може да бъде насочена от този антисенс олигонуклеотид, за да се провери неговата специфичност (Eisen and Smith, 2008). Разработен е фотоактивиран морфолино, чиято активност може да се контролира пространствено и временно чрез UV експозиция (Tallafuss et al., 2012). Бяха проведени многобройни проучвания, използващи морфолино антисенс олиго-медииран нокдаун на ген, за да се разберат човешките бъбречни заболявания. Например, нокдаунът на гена нефроцистин-3 доведе до образуването на кисти и хидроцефалия в ембриони на риба зебра по начин, подобен на болестта тип нефронофтиза-3 (Zhou et al., 2010).

Аминогликозидните антибиотици, които обикновено се използват за лечение на много животозастрашаващи инфекции, са известни със своя нефротоксичен и ототоксичен ефект (Mingeot-Leclercq и Tulkens, 1999). Гентамицинът е често използван антибиотик, който може да предизвика остро бъбречно увреждане (ОПН) при рибките зебра. Гентамицинът причинява сплескване на епитела на четката, загуба на тубуларен епител, деформация на структурата на гломерула, лизозомна фосфолипидоза и натрупване на левкоцити или клетъчни остатъци в тубулния лумен, което имитира предозирането на гентамицин при хора (Cianciolo Cosentino et al., 2010). Рибката зебра може да регенерира и замени увредените нефрони. Инсултът на гентамицин може да се използва за изследване на бъбречната регенерация при риба зебра (Kamei et al., 2015). Увреждането с гентамицин предизвиква реакция на регенерация, която задейства бъбречните стволови клетки да преминат през етапите на спецификация, пролиферация и диференциация за генериране на нови нефрони. При възрастните риби са необходими около 14 до 21 дни за регенериране на нефрони (Diep et al., 2011; McCampbell et al., 2015). Цисплатинът, който се използва като химиотерапевтично лекарство за лечение на тумори, също има нефротоксични ефекти, както се наблюдава при рибки зебра (Hentschel et al., 2005). Етимицин е друг аминогликозид, който може да се използва, като имитира ниска нефротоксичност и ототоксичност при ембриони на риба зебра (Shao et al., 2020). По този начин AKI и бъбречната регенерация могат да бъдат изследвани при рибки зебра с помощта на тези антибиотици.

Механично увреждане на бъбреците

Пронефросът на зебрата може да бъде физически наранен чрез резекция, пробождане или крионараняване. Хирургично нараняване може да бъде извършено чрез използване на фини пинсети за пробождане на желаната област на пронефроса, за да се създаде модел на AKI. Тази техника е използвана за увреждане на пронефричния канал близо до клоаката, което нарушава потока на течности и води до образуване на кисти в рамките на 30 минути (Kramer-Zucker, 2005). Установено е, че намаляването на скоростта на потока на течността в пронефроса генерира обратно налягане в мястото на влизане на течността, причинявайки разширяване на лумена на тубулите и образуване на кисти. Друга група изследователи са направили обструкция в пронефричния тубул при 50 hpf или в мезонефрични тубули на 12-месечни рибки зебра, като са използвали пинсети, за да отщипят зоната близо до дисталните събирателни тубули (Hellman et al., 2010). Те откриха, че тубулните белези водят до увеличаване на скоростта на биене на ресничките и регулиране на транскрипционния фактор foxj1a, който регулира липогенната генна експресия. Това предполага, че увреждането на пронефричните тубули генерира базиран на ресничките механосензорен сигнал за поддържане на хомеостазата на нефрона.

Лазерно индуцирано увреждане на бъбреците

Лазерно медиираната клетъчна аблация се използва като инструмент за изследване на бъбречно увреждане и имитиране на AKI при риба зебра. Johnson et al., (2011) са описали метод за лазерно медиирана аблация, последвана от проследяване на регенериращи нефрони. Те инжектираха 40 kDa декстран-FITC в сомитите на ствола на ембриони на риба зебра при 48-55 hpf, за да маркират епителните клетки на проксималните тубули, които след това бяха насочени за лазерно медиирана аблация при 72 hpf. След това аблатираните ембриони се инжектират отново с родамин декстран, за да се проследят епителните клетки на проксималните тубули. Те откриха, че напълно развит проксимален тубул се образува на 7-ия ден след лазерно медиирана аблация (Johnson et al., 2011). Друга алтернатива е да се използва специфична за бъбреците трансгенна линия за идентифициране на клетки за лазерно медиирана аблация и наблюдение на поведението на съседни клетки. Виолетова лазерна светлина с дължина на вълната 405 nm беше използвана за насочване към пронефричния тубул на Tg(atp1a1a.4:GFP) зебра (Palmyre et al., 2014). Тъй като спектрите на възбуждане на GFP се намират в диапазона от синя до виолетова светлина, той абсорбира 405 nm лазерна светлина, която действа като енергиен поглътител, за да предизвика потенциално увреждане на целевите епителни клетки. Този експеримент доведе до откритието, че клетъчната миграция е първичната реакция на увредения епител. Колективната клетъчна миграция причинява механично разтягане, което осигурява стимули за клетъчна пролиферация за възстановяване на увредената тубула. За да се определи времето, когато пронефричният тубул на рибката зебра придобива способността за регенерация, Yakulov et al., (2018) използва 2-фотонен лазер за аблация на малка част от пронефричните тубули в Tg(cldn2b:lyn-GFP) ембриони в различни моменти от време и следват процеса на регенерация. Те откриха, че аблацията на пронефричните тубули на 2-еднодневни ембриони се възстановява бързо чрез миграционни реакции, докато 1-еднодневните ембриони нямат тази способност. Те извършиха профилиране на генна експресия на увредени ембриони на риба зебра и установиха, че cxcr4b и слюдата участват в този процес на възстановяване (Yakulov et al., 2018).

Химическа генетика

Малки биоактивни молекули могат да се използват за намеса във функцията на протеините и разбиране на тяхната биологична роля. Голям брой химични библиотеки са достъпни в търговската мрежа или могат да бъдат направени по поръчка за изследване на протеинови функции. Тези малки молекулни библиотеки включват киназни инхибитори, протеазни инхибитори, ядрени рецептори и лиганди, които могат да се използват за идентифициране на ролята на сигналните пътища, участващи в развитието и функционирането на органи (Kawasumi и Nghiem, 2007). През последните няколко десетилетия рибата зебра се очертава като мощен модел на гръбначен организъм за високопроизводителен химичен скрининг и фенотипно оценяване (Kaufman et al., 2009). Cao et al., (2009) използва подхода на химичния скрининг, за да идентифицира съединения, които могат да обърнат фенотипове, причинени от мутации в pkd2 (причинен ген на PKD) и ift172 (ген, отговорен за образуването на реснички). Те откриха, че инхибитор на пан-хистон деацетилаза (pan-HDAC) трихостатин А (TSA) и специфичен за клас I инхибитор на HDAC валпроева киселина (VPA) могат да потиснат образуването на бъбречни кисти в pkd2 нокаут модел (Cao et al., 2009). ). По този начин химическата генетика може да бъде полезен инструмент за идентифициране на нови кандидати за лекарства, които могат или да обърнат, или да потиснат болестните състояния.

Генетично индуцирани модели на увреждане на бъбреците

Модел на генетично предизвикана тъканна аблация може да се използва при рибки зебра, в които бактериалната нитроредуктаза (NTR) се експресира под контрола на промотор по избор, който задвижва експресията на NTR в определен сегмент от пронефроса. NTR превръща метронидазола в цитотоксичен метаболит, който може да причини смърт на NTR-експресиращи клетки (Curado et al., 2008). Zhou и Hildebrandt (2012) използваха тази техника, за да индуцират увреждане на подоцитите чрез експресиране на NTR под контрола на промотора на подоцин в линията на риба зебра Tg(pod: NTR-mCherry). Те също така разработиха двойна трансгенна линия на VDBP-GFP (свързващ протеин на витамин D, маркиран с GFP) като индикатор за протеинурия заедно с линията Tg(pod: NTR-mCherry). Лечението с метронидазол причинява увреждане на подоцита, което води до оток на цялото тяло и натрупване на VDBP-GFP в проксималните тубули, имитирайки фенотипа на човешкия нефротичен синдром (Zhou и Hildebrandt, 2012).

Методи за оценка на развитието и функцията на pronephros при риба зебра

Описахме методите за генериране на модели на човешки бъбречни заболявания с помощта на риба зебра. Създаването на модел на заболяване с помощта на друг организъм е началната стъпка, която трябва да бъде оценена за способността му да рекапитулира вярно различни аспекти на заболяване, наблюдавано при хората. Zebrafish предлага много предимства, които могат да се използват за бърза оценка на способността му да служи като заместител за разбиране на човешките бъбречни заболявания, както е обсъдено по-долу.

Морфологичен скрининг

Най-често мутантните ембриони на риба зебра показват морфологични разлики в сравнение с дивия тип, които могат лесно да бъдат оценени чрез наблюдения под микроскоп. Прозрачността на ембрионите на рибата зебра и способността им да оцелеят до 5 дни дори при тежки дефекти в развитието е основно предимство при екраните, базирани на морфология. Честите морфологични промени, наблюдавани при ембриони на риба зебра с дефектен пронефрос, включват перикарден оток, пронефрични кисти, извита телесна ос и хидроцефалия (Poureetezadi и Wingert, 2016; Outtandy et al., 2019). Отокът е един от честите признаци на дефектен бъбрек, който се наблюдава и при други органни недостатъци, като например сърдечно развитие (Hanke et al., 2013). Мутантите с бъбречни дефекти могат да развият кисти поради друга вер-пролиферация на епителни клетки, както може лесно да се наблюдава под микроскоп (Zhao и Malicki, 2007; Yamaguchi et al., 2006). Извита телесна ос често се наблюдава при мутанти, които имат дефекти на пронефричните реснички. Мутантните риби зебра като Locke (lok), shen yantf214a(shy), garbustm304 (grb) и zatortg238a (zar) са някои други примери, показващи извита ос на тялото (Zhao and Malicki, 2007). Мутантите на зебрата с бъбречни дефекти показват множество морфологични дефекти в един и същи ембрион. Унищожаването на два полицистинови гена pkd1a и pkd1b доведе до орално извита телесна ос, хидроцефалия, хрущялни и краниофациални дефекти с ниска честота на пронефрични кисти (Mangos et al., 2010). Мутантите на интрафлагеларните транспортни протеини ift57, ift88 и ift172, където ресничките са дефектни, имат вентрално извита ос на тялото (Lunt et al., 2009). По този начин мутантите на зебрата с дефектни бъбреци проявяват много морфологични характеристики, които могат лесно да бъдат идентифицирани.

За повече информация: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501