Стабилизиране на митохондриалната мембрана чрез полизахарид Angelica Sinensis при миша апластична анемия

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Резюме

За да се изследва механизмът на стабилизиране на митохондриалната мембрана от полизахарид на Angelica Sinensis (ASP) в миши с апластична анемия (AA), ICR мишки бяха произволно разделени на контролни. Групи, третирани с АА и ASP Мишките от групата АА бяха третирани с 60Co Y и интраперитонеални инжекции на циклофосфамид и хлорамфеникол. Контролните животни бяха третирани с оловно екраниращо облъчване и инжекция с физиологичен разтвор. Третираните AA мишки бяха хранени с ASP в продължение на 2 седмици. Митохондриалната ултраструктура на костния мозък се наблюдава чрез трансмисионна електронна микроскопия, а трансмембранният потенциал на ядрените клетки на костния мозък (BMNC) се изследва чрез флуоресцентна спектрофотометрия. Съдържанието на Cox и MDH в средата също е изследвано в трите групи. Митохондриалният брой и трансмембранният потенциал на BMNC в костния мозък намаляват в групата на AA в сравнение с контролната група, но се подобряват в групата, лекувана с ASP в сравнение с групата на АА. Пълното митохондриално разцепване в групата, лекувана с ASP, е значително забавено (P< 0.05)="" as="" compared="" to="" the="" aa="" group.="" we="" conclude="" that="" asp="" might="" improve="" mitochondrial="" membrane="" stabilization,="" and="" suppress="" the="" downregulation="" of="" transmembrane="" potential="" and="" apoptosis="" of="" bmnc="" in="">

Ключови думи: апластична анемия, полизахарид Angelica Sinensis, митохондрии, мембранен потенциал, ICR мишки

екстракт от цистанче: засилва образуването на кости и увеличава костната плътност

Заден план

Апластична анемия (АА) е нарушение на кръвта, при което костният мозък и свързаните кръвни стволови клетки са увредени, което води до дефицит на червени кръвни клетки, бели кръвни клетки и тромбоцити. Тези недостатъци са известни поотделно като анемия, левкопения и тромбоцитопения, съответно, и общо известни като панцитопения. Излагане на химикали, лекарства, радиация, радиоактивни материали, устройства, произвеждащи радиация, инфекция. имунно заболяване, наследственост (в 50 процента от случаите) и неизвестна етиология също могат да доведат до развитие на АА.

Митохондриите се считат за „силата на клетката“, тъй като те произвеждат аденозин трифосфат (АТФ) чрез систематично извличане на енергия от хранителни молекули (субстрати) [1]. Освен това, mtDNA се репликира с висока степен на мутация, тъй като й липсват защитни хистони и ефективна система за възстановяване на ДНК. Мутациите в mtDNA са свързани с хематологични заболявания като придобита сидеробластна анемия, миелодиспластични синдроми и придобита АА [2-4]. Нашето предишно проучване 5] показа, че функционалното увреждане на митохондриалната респираторна верига, предизвикано от мутации, може да бъде включено в хемопоетична недостатъчност при пациенти с АА. Независимо от морфологичните характеристики на крайната клетъчна смърт (апоптозна, некротична, автофагична или митотична), пермеабилизацията на митохондриалната мембрана (ММР) често е решаващото събитие между оцеляването и смъртта [6]

Според традиционната китайска медицина Angelica Sinensis помага за обединяването на кръвта и насърчаването на нейната циркулация [7]. Последните проучвания показват, че екстрактите от Angelica Sinensis имат антиоксидантни и невропротективни ефекти [8,9]. Въпреки това, антиоксидантната функция на ASP остава неясна. Това проучване изследва ранното увреждане на клетките, използвайки кривата на времето на митохондриален лизис и стабилизиращия митохондриалната мембрана ефект на ASP при AA.

добавката Cistanche увеличава костната плътност и засилва образуването на кост

Материали и методи

Групиране на животни

Здрави ICR мъжки мишки, с тегло 18-22 g, на възраст 6-8 седмици, бяха предоставени от Центъра за експериментални животни към университета Шандонг (Китай). Животните бяха настанени в топла, тиха среда със свободен достъп до храна и вода. и се аклиматизират за една седмица преди началото на експериментите.

Мишките бяха разделени на случаен принцип в три групи: нормална група, АА група и третирана група, съответно. Моделът на апластична анемия е генериран, както е описано по-горе [10].

Накратко, мишките бяха облъчени с 2.0Gy 60Coy и след това третирани с ежедневни интраперитонеални инжекции от 40 mg/kg/ден циклофосфамид и 50 mg/kg/ден хлорамфеникол за следващите три дни. Третираната група беше хранена интрагастрално с ASP (200 mg/kg/ден, според китайския медицински речник). Контролната група и мишките от групата АА бяха хранени интрагастрално с диета, допълнена с физиологичен разтвор (10 ml/kg/ден). Освен това, всички мишки са получили стандартна диета по време на изследването. След лечение с ASP или физиологичен разтвор за 2 седмици, мишките бяха умъртвени чрез цервикална дислокация.

Хематологично изследване

Кръвните проби от опашката от трите групи бяха събрани съответно на първия и четиринадесетия ден. В пробите от периферна кръв се преброяват левкоцитите и тромбоцитите и се определят нивата на Hb. След завършване на експериментите, мишките бяха умъртвени и бяха приготвени петна от бедрената кост за диференциално преброяване на ядрени клетки от костен мозък (BMNCs) (Фигура 1).

Трансмисионна електронна микроскопия

Бедреният костен мозък се намазва и нарязва на ултратънки срезове. Митохондриите на хемопоетичните клетки в бедрения мозък бяха анализирани и преброени чрез трансмисионна електронна микроскопия (JEM-2000EX, Япония) под 50 зрителни полета.

Времева крива на митохондриален лизис

Митохондриите бяха извлечени от миши BMNCs съгласно протокола на производителя на комплекта за изолиране на митохондрии (Pierce Biotechnology Inc., САЩ). Концентрацията на моноаминооксидаза (МАО) показва концентрацията на митохондриите и се определя с помощта на 200U/ml митохондриални суспензии от 20 серумни култури, в рамките на 12 часа в различни времеви точки (интервали от 30 минути). Определя се и съдържанието на цитохромоксидаза (Cox) и малат дехидрогеназа (MDH) в средата. Анализът на пиковото време на митохондриалната мембрана и кривите концентрация-време на специфичния за матрицата ензим показват степента на лизис на митохондриалната мембрана.

Потенциал на митохондриалната мембрана

След предварителна инкубация с MAO или ASP, изолираните митохондрии от трите групи бяха ресуспендирани в 0.5 ml фосфатно буфериран физиологичен разтвор (Wuhan Boster Biotechnology, Ltd., Китай) и 10 ul работен разтвор на родамин 123 ( Sigma-Aldrich, USA) се добавя и се инкубира при 37 градуса С в 5 процента CO2 за 15 мин. Потенциалът на митохондриалната мембрана се анализира чрез поточна цитометрия, като се използва дължина на вълната на възбуждане от 490 nm и дължина на вълната на излъчване от 520 nm.

Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуер SPSS 19.0. Данните са изразени като средни стойности и стандартни отклонения. Използван е t-тестът на студента за сравняване на различните групи. P < 0.05="" се="" счита="" за="" статистически="">

билка цистанче: за по-добро качество на костите

Резултати

Броят на периферната кръв и BMC

Използвайки напълно автоматичен анализатор на кръвни клетки, беше установено, че броят на периферните кръвни клетки и BMC в AA мишките е значително намален (P<0.05), indicating="" that="" the="" aa="" mouse="" model="" was="" successfully="" established="" (table="">

Митохондриална ултраструктура при мишки с апластична анемия

Трансмисионната електронна микроскопия на костния мозък на AA мишки показа, че митохондриалната ултраструктура значително се подобрява с ASP в третираната група (Таблица 2 и Фигура 1), което показва, че ASP стабилизира митохондриите в AA мишки. Размерът и формата на митохондриите на контролната група са нормални. За разлика. митохондриите на групата АА имаха уголемени глобуларни структури, заедно с разрушаване или изчезване на кристи (Фигура 1A-C).

Потенциал на митохондриалната мембрана (MMP) при мишки с апластична анемия

Тъй като трансмисионната електронна микроскопия разкри увреждане на митохондриите, ние определихме ефекта на ASP върху MMP в AA мишки чрез измерване на относителните разлики във флуоресценцията на Rh 123 между трите групи с помощта на флуоресцентен спектрофотометър.

Резултатите показват, че Rh 123 флуоресценцията на клетки от костен мозък в групата на АА (19,6±3,03) е по-ниска от тази в контролната група (31,7±2,59, P<0.0). however,="" the="" rh="" 123="" fluorescence="" of="" the="" asp-treated="" aa="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" aa="" group=""><0.0i)(table 2="" and="" figure="" 2),="" indicating="" that="" asp="" facilitated="" the="" recovery="" of="" the="" mmp="" in="" aa="">

Крива на времето на митохондриален лизис при ранно клетъчно увреждане

В контролната група съдържанието на митохондриална in vitro култура Cox и MDH отне 3,5 часа, за да достигне пика. Съдържанието на MAO в културата не се променя значително с течение на времето, но съдържанието на COX и MDH постепенно се увеличава с времето, достигайки пик и след това постепенно намалява. По този начин пълното митохондриално съдържание, освободено от клетките, отне около 3,5 часа, за да достигне пика на разцепване.

Пиковете на COX и MDH в групата на AA се появяват съответно на 1,5 часа, 1,375U/, 36,732U/l. Пиковете на COX и MDH в третираната група се появяват съответно на 5,5 часа, 6,5 часа, 1,341U/l, 33,994U/. Два набора от данни във всяка времева точка бяха използвани за статистически анализ. На 1,5 часа нивата на COX и MDH в групата на AA са значително по-високи, отколкото в третираната група (P < 0.05).="" следователно,="" пълното="" митохондриално="" разцепване="" в="" серума="" беше="" значително="" забавено="" след="" добавянето="" на="" asp="" (p=""><0.05), с="" леко="" намаление="" на="" пика="" (фигура="">

Дискусия

Апластична анемия (АА) е синдром на костномозъчна недостатъчност, характеризиращ се с периферна панцитопения и хипоплазия на костния мозък. Мутациите и нестабилността на mtDNA са демонстрирани при няколко заболявания. Митохондриалната дисфункция и намаляването на броя на митохондриите може да доведе до намаляване на mtDNA. Установено е, че придобитите делеции на mtDNA в хематопоетичния компартмент се появяват при тежка панцитопения и ретикулоцитопения [11]. Въз основа на нашите предишни изследвания [5], ние проучихме дали ASP може да стабилизира митохондриалната мембрана на AA мишки.

Полизахаридно-желязният комплекс (APIC) на Angelica Sinensis не само има превъзходен терапевтичен ефект върху IDA, но също така и върху допълването на кръвта и насърчаването на кръвообращението [12]. ASP може да бъде полезен за лечение на заболявания, предизвикани от свръхекспресия на хепцидин чрез предотвратяване на пътищата на Янус-киназата (JAK), син на майките срещу екстрацелуларен декапентаплегичен (SMAD) и 1 сигнално-регулирана киназа (ERK) за понижаване на експресията на хепцидин при IDA плъхове [13] ]. Qin J установи, че ASP може да подобри синтеза на протеогликан (PG) на хондроцити в модел на ОА на плъх in vivo и IL-1B-стимулирани хондроцити in vitro чрез насърчаване на експресията на агрекан и GTs, участващи в синтеза на PG [14].

В нашето изследване моделът на мишка АА беше индуциран от комбинация от ацетил фенилхидразин, рентгенови лъчи и циклофосфамид. АА мишките показват статистически значими намаления на левкоцитите в периферната кръв, Hb и тромбоцитите (Таблица 1) и тежки намаления на клетките на раменния костен мозък и свързаните с костния мозък прогениторни клетки, които са клинични характеристики на АА. АА мишките, третирани с ASP, показват прогресивно увеличение на BM клетките в сравнение с АА групата. Освен това, броят на митохондриите в хематопоетичните клетки също е засегнат. ASP доведе до значително по-голям брой митохондрии в третираната група в сравнение с групата на AA (Фигура 1). Тези резултати показват, че ASP може да насърчи пролиферацията на ядрени клетки в костния мозък, да увеличи броя на митохондриите и да стабилизира митохондриалната мембрана в AA мишки.

Митохондриалното увреждане се отразява чрез увреждане на mtDNA и спад в нивата на mtRNA транскрипти, протеинов синтез и митохондриална функция, което може да доведе до намалена клетъчна енергия, прекъсване на клетъчното сигнализиране и намеса в клетъчната диференциация и апоптоза. Освен това, недостатъчното митохондриално производство на АТФ може да насърчи хромозомна нестабилност [15]. Тъй като mtDNA кодира компоненти на четири от пет митохондриални респираторни комплекса, промените в mtDNA водят до митохондриално заболяване [16-18]. Освен митохондриална болест, мутациите в mtDNA са свързани с рак, диабет. сърдечно-съдови заболявания. невродегенеративни заболявания, хематологични заболявания като левкемия, както и нормалния процес на стареене [19]. Важно е, че мутациите на mtDNA, както и намаляването на броя на копията на mtDNA, могат да бъдат патогенни [20, 21]. Разбирането на клетъчните механизми за поддържане на целостта на mtDNA и броя на копията е от изключително значение, тъй като може да осигури цели за клинични интервенции, насочени към превенция и лечение на хематологични заболявания като AA. Тези фактори могат също да доведат до намален енергиен метаболизъм, което ще повлияе на самообновяването и диференциацията на хемопоетичните стволови клетки.

Резултатите от настоящото проучване показват, че ASP може да подобри митохондриалната ултраструктура и да потисне регулирането надолу на трансмембранния потенциал и апоптозата на миелоидните елементи, за да излекува костно-мозъчната недостатъчност.

Cistanche & екстракт от цистанче: кости на bebefit

Препратки

1 Chinnery PF, Schon EA. Митохондриите. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2003, 74: 1188-1199.

2. Gattermann N. Митохондриални ДНК мутации в хемопоетичната система. Левкемия 2004,18:18-22.

3. Gattermann N, Retzlaff S, Wang YL, et al. Хетероплазмени точкови мутации на митохондриална ДНК, засягащи субединица I на цитохром с оксидаза при двама пациенти с придобита идиопатична сидеробластна анемия. Blood 1997,90:4961-4972.

Kim HR, Shin MG, Kim MJ и др. Митохондриална

4 . ДНК аберации на клетки от костен мозък от пациенти с апластична анемия. Korean Med Sci 2008, 23:1062-1067. X Cui, JO Wang, ZG Cai и др. Пълна последователност

5. анализ на митохондриална ДНК и дължина на теломерите при апластична анемия.Int J Mol Med 2014.34:1309-1314.

6. Chiu TL, Su CC. Таншинон IA индуцира апоптоза в клетки A549 на човешки белодробен рак чрез индуциране на реактивни кислородни видове и намаляване на потенциала на митохондриалната мембрана. Int J Mol Med 2010, 25: 231-236.

7. Liu PJ. Hsieh WT. Huang SH, et al. Хематопоетичен ефект на водоразтворими полизахариди от Angelica Sinensis върху мишки с остра загуба на кръв. Exp Hematol 2010, 38: 437-445.

8. Kuang X, Yao Y, Du JR и др. Невропротективна роля 8F на Z-лигустилид срещу исхемично увреждане на предния мозък при ICR мишки. Brain Res 2006,1102:145-153.

9. Xin J.Zhang J. Yang Y, et al. Radi Angelica Sinensis, който съдържа компонента Z-лигустилид, насърчава неврогенезата при възрастни, за да медиира възстановяването от когнитивно увреждане Curr Neurovasc Res 203, 10:304-315.

10. Chen YF, Wu ZM, Xie C, et al. Ниво на експресия на IL-6, секретиран от стромални клетки на костен мозък при мишки с апластична анемия.ISRN Hematol 2013:986219.

11. Hatfill SJ, LaCock CJ, Laubscher R, et al. Arole за митохондриална ДНК в патогенезата на индуцирана от радиация миелодисплазия и вторична левкемия. Leuk Res 1993, 17: 907-913.

12. Wang PP, Zhang Y, Dai LQ, et al. Ефект на полизахаридно-желязния комплекс Angelica Sinensis върху желязодефицитна анемия при плъхове. Chin J Integr Med 2007, 13: 297-300.

13. Zhang Y, Cheng Y, Wang N, et al. Действието на сигналните пътища JAK, SMAD и ERK върху потискането на хепцидин от полизахариди от Angelica Sinensis при плъхове с желязодефицитна анемия. Хранителна функция 2014.5: 1381-1388.

14. Qin J, Liu YS, Liu J, et al. Ефект на полизахаридите на Angelica Sinensis върху остеоартрит in vivo и in vitro: възможен механизъм за насърчаване на синтеза на протеогликани. Базирано на доказателства допълнение Alternat Med 2013,79476.

15. Gattermann N. Митохондриални ДНК мутации в хемопоетичната система. Левкемия 2004,18:18-22.

16. Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA. Делеции на мускулна митохондриална ДНК при пациенти с митохондриални миопатии. Nature 1988, 331: 717-719.

17. Lestienne P, Ponsot G Kearns-Sayre синдром с делеция на мускулна митохондриална ДНК. Lancet 1988, 1:885.

18. Wallace DC, Singh G, Lott MT, et al. Митохондриална ДНК мутация, свързана с наследствената оптична невропатия на Leber.Science 1988,242:1427-1430.

19. Wallace DC. Митохондриална парадигма на метаболитни и дегенеративни заболявания, стареене и рак: зората за еволюционната медицина. Annu Rev Genet 2005, 39: 359-407.

20. Clay Montier LL, Deng JJ, Bai Y. Броят има значение: контрол на броя копия на митохондриална ДНК на бозайници. J Genet Genomics 2009,36:125-131.

21. Rötig A, Poulton J. Генетични причини за изчерпване на митохондриална ДНК при хора. Biochim Biophys Acta 2009,1792:1103-1108.

екстракт от цистанче: засилва образуването на кости и увеличава костната плътност