Молекулярно откриване на етапите на съзряване в развиващия се бъбрек

edmund.chen@wecistanche.com

РЕЗЮМЕПоследните постижения в биологията на стволовите клетки позволиха генерирането на бъбрекорганоиди in vitro и по-нататъшно узряване на тези органоиди се наблюдава след експериментална трансплантация. Въпреки това, настоящите органоиди остават незрели и техните точни етапи на съзряване са трудни за определяне поради ограничената информация за зависими от стадия на развитие генни експресии вбъбрекin vivo. За да установим съответните молекулярни координати, извършихме едноклетъчно РНК секвениране (scRNA-seq) при развиванебъбрецина различни етапи в мишката. Чрез избиране на гени, които показват повишена регулация при раждането в сравнение с ембрионален ден 15.5, както и специфична за клетъчната линия експресия, ние генерирахме генни списъци, свързани с етапите на развитие в отделните клетъчни линии. Прилагане на тези списъци към трансплантирани ембрионибъбреци разкрива, че повечето типове клетки, различни от събирателните канали, показват сходно съзряване катобъбрецив неонаталния стадий in vivo, разкривайки несинхронно съзряване в клетъчните линии. По този начин нашите scRNA-seq данни могат да служат като полезни молекулярни координати за оценка на съзряването на развитиетобъбреции в крайна сметка набъбрекорганоиди.

Ключови думи:Бъбречно развитие, секвениране на едноклетъчна РНК, съзряване, in situ хибридизация, бъбрек

ВъведениеTheбъбрекпроизлиза от най-малко два вида прекурсори: нефронни прогенитори и уретерна пъпка (Costantini and Kopan, 2010). Нефронните прогенитори дават сетонефрони, включително гломеруларни подоцити, проксимални тубули, бримки на Хенле (LOH) и дистални тубули, докато уретерната пъпка се разклонява широко, за да образува събирателните канали и уретера (Kobayashietal., 2008) (Maroseetal., 2008). поток. Нефронните прогенитори и уретерната пъпка инициират своите взаимодействия около ембрионален ден (E)11.5 при мишки. При E15.5 общите нефронни сегменти са определени, но нови нефрони продължават да се генерират от нефронните прогенитори. След гломерулна васкуларизация, урината започва да тече при E16.5–E17.5 (Rasouly and Lu, 2013). Междувременно вътрешната (медуларна) област набъбрексе удължава, отразявайки удължаването на LOH и събирателните канали. Това развитие на медуларния регион продължава след деня на раждането (P0), докато нефронните прогенитори престават да се самообновяват и изчезват в рамките на няколко дни след раждането (Hartmanet al., 2007) (Rumballe et al., 2011) ( Volovelsky et al., 2018).

Последните постижения в биологията на стволовите клетки позволиха генерирането набъбрекорганоиди in vitro (Morizane et al., 2015; Taguchi et al., 2014; Takasato et al., 2015). Преди това създадохмебъбрекорганоиди от плурипотентни стволови клетки: миши ембрионални стволови клетки (ESCs) и човешки индуцирани плурипотентни стволови клетки (iPSCs) (Taguchietal., 2014). Все пак става ясно, че органоидите in vitro остават в незрели стадии, еквивалентни набъбреципри приблизително E14.5–E15.5 при мишки и 10–14 седмици от бременността при хора (Taguchi and Nishinakamura, 2017; Takasato et al., 2015; Wu et al., 2018). Ние и други също разработихме методи за експериментална трансплантациябъбрекорганоиди в имунодефицитни мишки, което позволява органоидна васкуларизация и връзка с кръвообращението на гостоприемника (Bantounas et al., 2018; Sharmin et al., 2016; Subramanian et al., 2019; Tanigawa et al., 2018; van den Berg et al., 2018). При трансплантация гломерулните подоцити в рамките на органоидите придобиват по-зрели морфологични характеристики, свързани с филтрационната функция, вероятно причинени от доставка на кислород и/или взаимодействие с васкуларни ендотелни клетки. Въпреки че точните механизми остават неразгадани, трансплантацията често се използва за предизвикване на узряване на органоиди в изследователската област на биологията на стволовите клетки.

Въпреки този напредък, точното определяне на етапите на съзряване е трудно поради липсата на молекулярни координати, т.е. изчерпателна информация за зависимата от етапа генна експресия в развитиетобъбрек.Понастоящем тези координати дори не са налични за миши ембрионибъбрециin vivo. Тази ситуация до голяма степен възниква поради нарастващия брой типове клетки по време набъбрекразвитие, като всеки клетъчен тип съдържа малки количества клетки. Конвенционалните анализи на генната експресия, които изискват голям брой хомогенни клетки, не са подходящи за хетерогенно узряванебъбреци.Базата данни GUDMAP (www.gudmap.org) е натрупала голям брой анализи на генна експресия в развиващите себъбрек, включително някои общобъбреции някои в сортирани или микродисектирани клетки (McMahon et al., 2008). Въпреки това, дори и

Последните анализи често съдържат клетки от множество етапи и по този начин данните не могат да се използват директно за анализи на узряване. Анализът на секвениране на едноклетъчна РНК (scRNA-seq) даде възможност за изследване на генните експресии в сложни и хетерогенни органи, включителнобъбреки някои от тези данни са депозирани в базата данни GUDMAP (Adam et al., 2017a; Combes et al., 2019a, 2019b; Lindstr€om et al., 2018; Magella et al., 2017; Ransick et al. , 2019; Wanget al., 2018; Wu et al., 2018). Повечето от тези предишни проучвания обаче анализират ембрионални или възрастнибъбрецив една времева точка или в сравнение

vivoбъбрецис инвитробъбрекорганоиди. По този начин малко проучвания са разгледалибъбрексъзряване от средата на бременността до раждането за ограничен клетъчен тип (Chen et al., 2015). За установяване на молекулни координати забъбрексъзряване в настоящото изследване, ние извършихме scRNA-seq върху развиваща се мишкабъбрецина различни етапи и избрани зависими от съзряването гени. Допълнително оценихме статуса на съзряване на трансплантирани ембрионални бъбреци чрез сравняване на данните за RNA-seq и експресиите на зависими от съзряването гени. Нашите данни за RNA-seq и избраните генни списъци ще служат като референтни инструменти за съзряване на развитиетобъбреции в крайна сметка набъбрекорганоиди.

Резултати

scRNA-seq анализ на развиващи се бъбрециИзвършихме scRNA-seq върху развиваща се мишкабъбрецина три различни етапа: E15.5, E17.5 и P0. Бяха получени висококачествени данни със средни показания от съответно 4493, 2,360 и 2467 гена на клетка. След анализ на данните с помощта на Seurat v3.1.1 (Butler et al., 2018; Stuart et al., 2019a), клетките бяха класифицирани в 45 клъстера, с по-голям брой твърди клъстери при P0 от при E15.5 (фиг. 1A). Идентифицирахме клетъчни типове за повечето от клъстерите, използвайки специфични за клетъчния тип маркери: нефронни прогенитори (Six2þ, клъстери 0, 1 и 10), гломерулни подоцити (Nphs1þ, клъстери 8 и 11), гломерулни париетални епителни клетки (Claudin 1 (Cldn1) )þ, клъстер 20), проксимални тубули (S1 сегмент: семейство носители на разтворени вещества (Slc) 5a2þ, клъстери 15 и 31; S2 сегмент: Slc5a2?/Slc34a1þ, клъстери 13 и 6; S3 сегмент: Aquaporin 1 (Aqp1)þ/Slc7a13þ (Lee et al., 2015; Ransick et al., 2019), клъстер 37), LOH (тънък низходящ крайник: Aqp1þ/Slc39a8þ (Lee et al., 2015; Ransick et al., 2019), клъстер 27; дебел възходящ крайник: Uromodulin (Umod)þ/Slc12a1þ, клъстери 28 и 17), дистални тубули (Slc12a3þ, клъстер 5), върхове на уретерни пъпки (Retþ, клъстери 22 и 35) и стъбла на събирателния канал (Aqp2þ, клъстери 16, 21 и 41) (Фиг. 1B, Фиг. S1A). Интеркалираните клетки образуват клъстер, който е отделен от клъстерите на събирателния канал (Atp6v1g3þ, клъстер 39) (Фиг. 1B). Интерстициалните клетки бяха класифицирани в множество клъстери (7, 9, 12, 14, 23, 29, 30, 33 и 34), сред които клъстери 9/33, 12 и 34 могат да представляват стромални прогенитори (Foxd1þ (Kobayashi et al. , 2014)), съответно мезангиални клетки (Nt5eþ) и ренин-продуциращи клетки (Ren1þ) (фиг. S1B). Клъстерите на ендотелни клетки (Pecam1þ, клъстери 3, 19, 24, 25 и 32) съдържат Ehd3þ клетки (клъстер 32, Фиг. S1C), които вероятно представляват гломерулни ендотелни клетки (Patrakka et al., 2007). По този начин Seurat v3.1.1, който използва интеграционни котви за клъстериране на най-близките съседи (Stuartet al., 2019b), успешно категоризира множество типове клетки отбъбрецина различни етапи на развитие.

Времеви промени в експресията на транскрипционния фактор и сигналните дейности за развитие по време набъбрексъзряване

Нефроновите прогенитори бяха класифицирани в три клъстера (фиг. S1D): клъстер 0, съдържащ Six2þ/Cited1þ наивни клетки, клъстер 10, съдържащ Six2þ/Cited1þ/Top2a þ пролифериращи наивни клетки, и клъстер 1, съдържащ Six2þ/Cited{{10} }/Wnt4þ първични клетки (Boyle et al., 2008; Kobayashiet al., 2008; Self et al., 2006). По време на спецификацията на нефронния сегмент, популацията на нефронните прогенитори първо формира Mafb þ подоцитен клон,

които в крайна сметка се диференцират в Nphs1þ подоцити (фиг. 1B и 2A). Разклоненията за проксималните тубули и LOH/дисталните тубули се образуват отделно от клона на подоцитите. Прекурсорни клетки за проксималните тубули

експресира гените на транскрипционния фактор Osr2 и след това Hnf4a (фиг. 2B), последният от които регулира зависими от съзряването гени в проксималните тубули (Deacon et al., 2019; Marable et al, 2018, 2020; Martovetsky

и др., 2013). Общи прекурсорни клетки за LOH/дистални тубули експресират Pou3f3 (Nakai et al., 2003) и Sim1, с последваща експресия на Sim2 и Gata3 след спецификация съответно на LOH и дистални тубули (Фиг. 2C). Tfap2b, за който наскоро беше съобщено, че е важен за развитието на дисталния нефрон (Marneros, 2020), също беше открит в LOH и дисталните тубули (фиг. S1E). По този начин, времеви промени в експресията на транскрипционния фактор възникват в отделните сегменти на нефрона по време набъбрексъзряване, а клъстерите в периферните краища на клоните (клъстери 5, 6, 8, 17, 31 и 37) представляват най-зрелия стадий във всяка линия.

От гледна точка на сигналите за развитие, индикатор за активността на сигналния път на WNT, Axin2, беше открит главно в развиващите се дистални тубули, както беше съобщено по-рано (Jho et al., 2002). Fgf8 и Etv4, an

индикатор за FGF сигнална активност (Maoetal., 2009), също са били изразени в развиващите се дистални тубули, но ограничени до незрял стадий. За разлика от това, Bmp7 (Oxburgh et al., 2005) се експресира в дисталните тубули както в незрели, така и в зрели стадии, както и в подоцити, докато Bmp4 (Miyazaki et al., 2000) се открива главно в проксималните тубули. Отбелязахме също, че дейностите на основните сигнални пътища са намалели-

регулирани в зрели клетки в повечето сегменти на нефрона. Например, Axin2 (WNT сигнализиращ индикатор) и Etv4 (FGF сигнализиращ индикатор) отсъстваха в зрели подоцити и проксимални и дистални тубули (фиг. 2D). Същата тенденция се наблюдава за Hey1 (Notch сигнализиращ индикатор), докато Hes1 се регулира само надолу в подоцитите и проксималните тубули (фиг. 2E). Индикатор за сигнализиране на BMP, Id1 (Korchynskyi and Ten Dijke, 2002; L? opez-Rovira et al., 2002), е намален в зрелите подоцити и дисталните тубули (Фиг. 2F). По този начин се наблюдава активиране на сигнализиране за развитие, специфично за сегмента на нефрона, последвано от регулиране надолубъбрексъзряване.

Списъци с гени, зависими от етапа на развитие, за отделни клетъчни линии

Нашият scRNA-seq анализ показа, че UMAP клъстери, експресиращи някои установени маркери за диференциация, ограничени от линията, вече присъстват при E15.5 (Фиг. 1B). За да идентифицираме стадийно зависими гени за отделни нефронни сегменти, първо сравнихме генните експресии между E15.5 и P0 в най-зрелите клъстери от всяка линия и избрахме гени, които са значително повишени или понижени при P0 в сравнение с E15. 5. Ние обаче открихме, че тези списъци включват гени, свързани с клетъчния стрес, като гени на протеини от топлинен шок, гени от семейство Jun/Fos и гени Gadd45 (Adam et al., 2017a), които могат да бъдат предизвикани от по-суровите процеси на клетъчна дисоциация, използвани за P0бъбреци. Because these genes were ubiquitously expressed, it was difficult to discriminate them from maturation-dependent genes that were ubiquitously expressed. Thus, we decided to select cell-type specific genes and picked up the upregulated or downregulated genes in the corresponding clusters between the two stages. Most of the upregulated genes at P0 showed consistent results in UMAP plots, while the downregulated genes showed less prominent differences between the two stages. In addition, the downregulated genes were detected in more immature cell clusters at P0, reflecting the repetitive differentiation processes from nephron progenitors. Therefore, we decided to focus on the upregulated genes (fold change, >2.5) и курира всеки кандидат-ген за неговата пространствено-времева експресия въз основа на UMAP графиките. Графиките на цигулката на окончателно избраните гени показват техните зависещи от етапа експресии в отделни възрасти на клетъчни линии (Фигура 3A, Фигури S2, S3, S4A, Таблица S1). Точковите графики потвърждават техните специфични за клетъчния тип експресии (фиг. 3B), въпреки че много гени, избрани за S2 сегмента на проксималните тубули, също са експресирани в S1 и S3 сегментите. Тези избрани генни списъци включват колаген тип 4 алфа3 верига (Col4a3) и семафорин (Sema) 3g за подоцити, Slc5a12 (лактатен транспортер) и семейство цитохром P450 (Cyp) 27b1 (алфа хидроксилаза на витамин D) за проксималните тубули, Umod и простагландин E рецептор 3 (Ptger3) за LOH, Aqp2 и Aqp3 за събирателни канали и липокалин2 (Lcn2) за върховете на пъпките на уретера. Повечето от гените вече са били регулирани нагоре при E17.5

и показаха сравними нива на експресия с тези при P0, което предполага, че може да настъпи значително съзряване между E15.5 и E17.5. Открихме само няколко гена за дисталните тубули (Таблица S1), тъй като повечето от регулираните гени в тази клетъчна линия също бяха експресирани в събирателни канали. Взети заедно, scRNA-seq анализът на развиващите себъбрецина множество етапи на съзряване позволи идентифицирането на зависими от стадия и специфични за линията гени в повечето сегменти на нефрона.

Хистологично валидиране на стадийно зависими генни експресии на представителни гени

За да потвърдим валидността на генните списъци чрез хистологично изследване, ние определихме експресиите на избрани гени в E15.5 и P0бъбрецичрез конвенционална базирана на дигоксигенин in situ хибридизация или високочувствителна RNAscope технология (Wang et al., 2012). Тъй като in situ хибридизацията, и особено технологията RNAscope, включва екстензивно усилване на сигнала, е малко вероятно да се открият фини разлики в нивата на генна експресия. По този начин ние избрахме гени, които показаха минимална експресия при E15.5 и бяха ограничени до една линия при P 0 в UMAP графиките. Такива гени също биха били полезни за рентабилна оценка на етапите на съзряване, като се използват хистологични срезове. В подоцитите и четирите изследвани гена (Col4a3, Sema3g, Htra1, Clic3) бяха лесно открити при P0 и техните нива на експресия при E15.5 бяха по-ниски от тези при P0 (фиг. 4A ). Обратно, Nphs1 показа сравнима експресия на двата етапа (фиг. 4А). В проксималните тубули три гена (Slc5a12, Cyp27b1, Kap) показват слаби или минимални сигнали при E15.5 и силна експресия при P0 (Фиг. 4B), докато Slc34a1 показва сравнима експресия и на двата етапа (Фиг. 4B). Зависещите от етапа експресии на три гена бяха валидирани в LOH (Umod, Ptger3, Car15), за разлика от относително постоянната експресия на Slc12a1 (Фиг. 5А). Ние също така извършихме in situ хибридизация за три гена (Aqp2, Cdkn2b, Lcn2) в събирателните канали и потвърдихме техните експресии, зависими от етапа (Фиг. 5B). Сред тях, Aqp2 и Cdkn2b се експресират в стъбла на събирателния канал, докато Lcn2 се открива във върховете на уретерите. За разлика от тях, Retand Wnt7b показва относително постоянни нива на експресия (фиг. 5B). Данните за in situ хибридизация бяха в съответствие с графиките на UMAP, подкрепяйки надеждността на нашите scRNA-seq данни.

Хистологично валидиране на стадийно зависими генни експресии на представителни гени

За да потвърдим валидността на генните списъци чрез хистологично изследване, ние определихме експресиите на избрани гени в E15.5 и P0бъбрецичрез конвенционална базирана на дигоксигенин in situ хибридизация или високочувствителна RNAscope технология (Wang et al., 2012). Тъй като in situ хибридизацията, и особено технологията RNAscope, включва екстензивно усилване на сигнала, е малко вероятно да се открият фини разлики в нивата на генна експресия. По този начин ние избрахме гени, които показаха минимална експресия при E15.5 и бяха ограничени до една линия при P 0 в UMAP графиките. Такива гени също биха били полезни за рентабилна оценка на етапите на съзряване, като се използват хистологични срезове. В подоцитите и четирите изследвани гена (Col4a3, Sema3g, Htra1, Clic3) бяха лесно открити при P0 и техните нива на експресия при E15.5 бяха по-ниски от тези при P0 (фиг. 4A ). Обратно, Nphs1 показа сравнима експресия на двата етапа (фиг. 4А). В проксималните тубули три гена (Slc5a12, Cyp27b1, Kap) показват слаби или минимални сигнали при E15.5 и силна експресия при P0 (Фиг. 4B), докато Slc34a1 показва сравнима експресия и на двата етапа (Фиг. 4B). Зависещите от етапа експресии на три гена бяха валидирани в LOH (Umod, Ptger3, Car15), за разлика от относително постоянната експресия на Slc12a1 (Фиг. 5А). Ние също така извършихме in situ хибридизация за три гена (Aqp2, Cdkn2b, Lcn2) в събирателните канали и потвърдихме техните експресии, зависими от етапа (Фиг. 5B). Сред тях, Aqp2 и Cdkn2b се експресират в стъбла на събирателния канал, докато Lcn2 се открива във върховете на уретерите. За разлика от тях, Retand Wnt7b показва относително постоянни нива на експресия (фиг. 5B). Данните за in situ хибридизация бяха в съответствие с графиките на UMAP, подкрепяйки надеждността на нашите scRNA-seq данни.

Трансплантираните ембрионални бъбреци показват съзряване, близко до неонаталния стадий

За да се определи дали трансплантиранбъбреципроследихме процеса на физиологично съзряване, проведохме експерименти с трансплантация с помощта на ембрионална мишкабъбрецикато донорски тъкани. Тъй като трансплантацията на

изолиран ембрионаленбъбреципричинена хидронефроза, вероятно в резултат на неправилно свързване на пикочните пътища (фиг. S5A), ние използвахме докладван по-рано протокол, който потенциално запазва непокътнатия поток на урината (Yokote et al., 2015). За това трансплантирахме E12.5бъбрецисвързан с клоаката, предшественик на пикочния мехур, в мазнината на епидидима на възрастни мишки гостоприемници (фиг. 6А). При прибиране на 12 дни след трансплантацията,бъбрециса се увеличили по размер (3,29 ? 0.35 mm 2 спрямо 0.23 ? 0.02 mm 2 , n=3, p < 0,05), и урината е открита в пикочния мехур (фиг. 6A), което предполага, че уринарният поток презбъбрек-връзката с пикочния мехур се запази. Хистологичният анализ показа, че бъбречната медула е образувана с кортикомедуларен модел (фиг. 6А). Оцветяването на специфични за клетъчния тип маркери показва, че общото разпределение на LTL þ проксималните тубули, SLC12A1 þ LOH и KRT8 þ уретерните пъпки е запазено (Фиг. 6B) и че гломерулите с NPHS1 þ подоцити са васкуларизирани с PECAM1 þ ендотелни клетки (Фиг. S5B) , което рядко се наблюдава по време на in vitro култура на ембрионални бъбреци (Halt et al., 2016). След това извършихме scRNA-seq анализ на трансплантиран ембрионбъбреции сравнява данните с тези, получени от ембрионални бъбреци in vivo. Графиките на UMAP на трансплантираните бъбреци показват сходни клъстерни модели с тези на неонатални бъбреци in vivo (фиг. 6C), но клъстерите, представляващи прогениторите на нефрона и върховете на уретерните пъпки, липсват в трансплантираните бъбреци (фиг. 6C, фиг. S5C и Д). Въпреки че причината за това неочаквано изчерпване на нефрогенната ниша остава неизвестна, това може да обясни по-малкия размер на трансплантираните бъбреци в сравнение с бъбреците in vivo, както обсъждаме в по-късен раздел. Независимо от това, другите клетъчни популации са групирани в подобни модели на тези в бъбреците в неонаталния стадий (фиг. 6C). Нивата на експресия на повечето зависими от узряването гени в подоцитите и проксималните тубули в трансплантираните бъбреци са сравними с тези в P0 бъбреците (Фиг. 6D, Фиг. S6, Таблица S2). Въпреки това, много гени в събирателните канали се експресират на по-ниски нива от тези в P{{10}} бъбреците, включително Cdkn2b (Фиг. 6D, Фиг. S6, Таблица S2). Обратно, експресиите на Aqp2 и Aqp3 са относително поддържани на сравними нива с тези в P0 бъбреците (фиг. 6D). В допълнение, Wnt9b и Hoxd3, които са регулирани надолу при P0 in vivo, остават високи в трансплантираните бъбреци (Фиг. S4A). По този начин, събирателните канали в трансплантираните бъбреци е вероятно да бъдат по-незрели от бъбреците при P0. Подобна тенденция, макар и в по-малка степен, се наблюдава при LOH (фиг. 6D, фиг. S6). Тези резултати предполагат, че съзряването не се случва непременно синхронно във всички клетъчни линии.

ДискусияСъзряването на органите е един от най-важните аспекти в менталната биология на развитието. В биологията на стволовите клетки трансплантацията често се използва за предизвикване на узряване на плурипотентни органоиди, получени от стволови клетки, включителнобъбрекорганоиди. Въпреки това, точното определяне на етапите на съзряване е трудно поради липсата на молекулни координати за съзряване. По този начин, ние извършихме scRNA-seq анализ на миши ембрионбъбрецина различни етапи на развитие, което позволи идентифицирането на гени, които показват стадийно зависима експресия в зреещия ембрионбъбреци. Чрез прилагането на тази информация към scRNA-seq данни в трансплантирани ембрионални бъбреци, освен това открихме, че процесът на съзряване след трансплантацията е протекъл близо до неонаталния стадий, но несинхронно в клетъчните линии. За разлика от масовото секвениране, scRNA-seq успя да оцени генните експресии в най-зрелите фракции на всяка клетъчна линия, като по този начин позволи прецизни сравнения със съответните субпопулации в развиващи се бъбреци, както и в трансплантиранибъбрекс. Доказано е, че избраните генни списъци за експресии, зависими от етапа, функционират като молекулярни координати за оценка на етапите на зреене на отделните линии. Добавянето на данни за scRNA seq в постнатални бъбреци на различни етапи и бъбреци на възрастни би създало допълнителни полезни ресурси за оценка на съзряването.

За да определим дали подобни резултати могат да бъдат постигнати с помощта на предварително съществуващите набори от данни, ние анализирахме повторно публикуваните данни за scRNA-seq в E14.5 и P1бъбреци(Adam et al., 2017a; Magella et al., 2017). Графиките на UMAP обаче показаха, че клъстерите, представляващи зрелите популации на повечето типове клетки при P1, отсъстват в данните за E14.5 (фигури S7A и B), като по този начин ни възпрепятстват да сравняваме генната експресия в

съответни клъстери между двата етапа. Единственото изключение бяха върховете на уретерните пъпки. Ret þ клъстери бяха открити и на двата етапа, а Lcn2 беше регулиран нагоре при P1 (фиг. S7C), в съответствие с нашите резултати. По този начин, съществуващите данни са с ограничена употреба, подчертавайки важността на данните за scRNA-seq и генните списъци в настоящото изследване. Ние показахме, че подоцитите и проксималните тубули в трансплантиранитебъбрециузряват близо до неонаталния стадий, докато събирателните канали остават относително незрели. Основните причини за увреждането на съзряването на събирателните канали остават да бъдат изяснени. Намаляването на физическата сила, предизвикана от потока на урината, може да бъде една възможна причина, тъй като събирателните канали са разположени най-надолу по течението на пикочните пътища. Трансплантирахме ембрионбъбрецис клоаката, с цел по-добро запазване на уринарния поток в сравнение с конвенционалната трансплантация на изолирани бъбреци (фиг. S5). Въпреки това остава възможно потокът на урина да е бил недостатъчен, за да насърчи съзряването на долната част на сегментите на нефрона. Алтернативно, събирателните канали може вече да са претърпели механични увреждания, причинени от обратен поток от пикочния мехур, въпреки че видим хидроуретер или хидроефроза не са наблюдавани по време на анализа. Последващото свързване на пикочния мехур, получен от донора, с уретера гостоприемник беше

Фиг. 6. Узряване на трансплантиранитебъбрециблизо до неонаталния стадий. (A) Изглед от цял ​​монтаж на E12.5бъбрекс клоаката преди трансплантацията (ден 0). Цял изглед и хистологичен анализ с оцветяване с хематоксилин и еозин на трансплантирания бъбрек с пикочния мехур, събран на 12-ия ден след трансплантацията. Червена стрелка: наличие на урина в пикочния мехур. Скала: 500 μm. (B) Имунооцветяване набъбрекна 12-ия ден след трансплантация с маркери за проксимални тубули (LTL: зелено), бримки на Henle (SLC12A1: червено) и събирателни канали (KRT8: сиво). Скала: 200 μ m. (C) UMAP графики на ембрионални бъбреци in vivo (E15.5 и P0) и трансплантирани ембрионални бъбреци (ден 12 след трансплантацията). Стрелка: нефронов прогенитор (NP); връх на стрелка: връх на пъпка на уретера (UB). POD: подоцит; PEC: гломерулни париетални епителни клетки; DN: диференциращ нефрон; PT: проксимален тубул; LOH: примка на Хенле; DT: дистален тубул; CD: събирателен канал; CD-IC: интеркалирана клетка на събирателния канал; ИНТЕГРАЛНА СХЕМА; интерстициална клетка; EC: ендотелна клетка; UT: уретер; BC: кръвна клетка. (D) Графики на цигулка на стадийно зависими гени при трансплантациябъбрецив сравнение с ембрионални бъбреци in vivo (E15.5 и P0).

съобщава, че инхибира хидронефроза и подпомага по-нататъшното развитие (Yokote et al., 2015), поради което би било информативно да се анализират експресиите на нашите маркерни гени за съзряване в такива трансплантации. Въпреки че са необходими допълнителни проучвания, нашите генни списъци се оказаха полезни за оценка на състоянието на съзряване на отделните линии в процес на развитиебъбрецикакто и при трансплантиранибъбреци. Нашите данни за RNA-seq също ще служат като полезни координати за оценка на състоянието на съзряване набъбрекорганоиди, получени от плурипотентни стволови клетки. Настоящите бъбречни органоиди представляват тези в ембрионални стадии (Taguchi и Nishinakamura, 2017; Takasato et al., 2015; Wu et al., 2018) и е необходимо по-нататъшно съзряване за моделиране на заболяването и евентуално за генериране на трансплантируеми бъбреци. Понастоящем има малко методи за измерване на етапите на зреене на органоидите, с изключение на морфологични анализи. По този начин нашите резултати ще послужат като основа за молекулярно откриване на органоидно съзряване. Докато конвенционалнитебъбрекорганоидите се състоят главно от нефрони (гломерули ибъбречнатубули), наскоро докладвахме за генерирането на бъбречни структури от по-висок ред, включващи разклонени уретерни пъпки с нефрони, разпределени около върховете на уретерните пъпки (Taguchi и Nishinakamura, 2017). Ние постигнахме това чрез комбиниране на миши ESC-получени нефронни прогенитори и уретерни пъпки с ембрионални стромални прогенитори и би трябвало да е теоретично възможно в близко бъдеще да се генерират органотипнибъбрекструктури единствено от миши ESC и евентуално от човешки iPSC. Следователно следващата стъпка ще бъде трансплантация на органоиди за по-нататъшно узряване. Нашите данни за scRNA-seq ще служат като полезни референтни инструменти за оценка на етапите на зреене на трансплантираните органоиди.

Изчерпването на нефрогенната ниша в трансплантиранитебъбрецибеше неочаквано. Въпреки че не е основният обхват на настоящото изследване, фокусирано върху съзряването, това изчерпване може да обясни по-малкия размер на трансплантираните бъбреци в сравнение с бъбреците in vivo. Нефроновите прогенитори при мишки продължават да пораждат зараждащи се нефрони до няколко дни след раждането (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky

et al., 2018) и преждевременното изчерпване на нефронните прогенитори води до бъбреци с по-малък размер (Kanda et al., 2014; Self et al., 2006). Остава да се определи кои поддържащи фактори липсват при трансплантациятабъбреции дали загубата на нефронни прогенитори или върхове на уретерни пъпки е основната причина за това явление. Разрешаването на тези енигми в крайна сметка ще доведе до растеж на трансплантиранитебъбрекорганоиди към a

сравним размер сбъбрециin vivo. Взети заедно, ние демонстрирахме, че нашите scRNA-seq данни и списъци с гени могат да служат като молекулярни бази за оценка на етапите на съзряване на ембрионални и трансплантирани бъбреци и биха били приложими за бъбречни органоиди, получени от iPSCs. Въпреки че се съсредоточихме върху развитието и съзряването на нефрони в настоящото изследване, подробните анализи на други линии, като стромални и ендотелни клетки, използвайки нашите scRNA-seq данни ще осигурят повече представа забъбрексъзряване.

Материали и методи

scRNA-seq анализиБъбреците се дисоциират чрез протокол, модифициран от описан по-рано метод (Tanigawa et al., 2016) и се използват за scRNA-seq анализи. C57BL/6N мишки (CLEA Japan Inc.) бяха използвани за E15.5 и E17.5 анализи и Foxd1GFPCreER; tdTomato и Tbx18MerCreMer: tdTomato мишки на смесен генетичен фон на C57BL/6N и ICR бяха използвани за P0 анализи (Grisanti et al., 2013; Kobayashi et al., 2014). шестбъбреципри E15.5 се усвояват за 10 мин в 0.25 процента трипсин/EDTA. E17.5 и P0 женскибъбреци were minced roughly with forceps, digested with dissociation buffer comprising 2 mg/ml collagenase (Sigma; Cat# 9407), 2.4 U/ml dispase (Gibco; Cat# 17105-041), 2 mM CaCl 2 (Wako; Cat# 031–00435), 50 μ g/ml DNase I (Sigma; Cat# 11284932001), and 10% fetal calf serum (FCS) (Sigma; Cat# 172012) in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Sigma; Cat# D5796) for 15 min at 37? C, washed with phosphate-buffered saline (PBS), and treated with 0.25% trypsin/EDTA for 10 min. Trypsin was inactivated by addition of DMEM/10%FCS containing50 μ g/mlDNaseI,andthecells werewashed with HEPES-buffered saline solution (Thermo; Cat# 14185-052) containing 2% FCS, 50 μ g/ml DNase I, 1 mM CaCl 2 , and 0.035% NaHCO 3 (Wako; Cat# 191–01305). Cells were resuspended in 0.04% BSA/PBS, filtered through a 40- μ m-pore strainer (Falcon; Cat# 352340), and evaluated for their cell number and viability (>90 процента ) с помощта на автоматичен брояч на клетки на Countess (Thermo; Cat# C10227). Общо 5000 дисоциирани клетки всяка от E15.5 и E17.5 и две проби (5000 клетки на проба) от P0 бяха приложени към Chromium Controller (10x Genomics) . Chromium Single Cell 3 0 Library & Gel Beads Kit v2 (10x Genomics) беше използван за генериране на олиго-dT-праймирани cDNA библиотеки, които след това бяха секвенирани от Illumina HiSeq 3000 (14 000 четения за E15.5; 7000 четения за E17.5; 14 000 четения за P0). Отчитанията на базовата РНК Q30 (Q-резултати, показващи качеството на секвениране) на пробите бяха 86.2 процента за E15.5, 63.8 процента за E17.5 и 93.6 процента за P0.

Суровите данни за последователности бяха обработени с помощта на командата за преброяване на клетки рейнджър на Cell Ranger (версия 3.0.2; 10x Genomics), за да се генерират таблици за преброяване на уникални молекулни идентификатори (UMI) за всеки ген на клетка. Първо интегрирахме двете P0 проби, използвайки командата cell ranger aggr на Cell Ranger, за да генерираме единична комбинирана P0 извадка. В този момент получихме 4 158, 5 551 и 10 810 клетки за пробите E15.5, E17.5 и P0 със средни стойности съответно на 4 493, 2 360 и 2 467 гена на клетка. Тези три индивидуално генерирани набора от данни бяха интегрирани с помощта на командата cell ranger aggr. Всички последващи анализи бяха извършени на езика за статистически програмиране R (R Core Team, 2018). Пакетът Seurat (версия 3.1.1) беше използван за анализи, включително контрол на качеството, нормализиране на данни, мащабиране на данни и визуализация (Butler et al., 2018) (Stuart et al., 2019a). За контрол на качеството клетките, които експресират<200 genes,="">8000 genes (possibly representing doublets), or >20 процента от митохондриалните гени бяха филтрирани. Окончателният набор от данни съдържаше съответно 20 672 гена и 3 441, 4 592 и 8161 клетки в пробите E15.5, E17.5 и P0 (общо: 16 194 клетки). Анализът на главните компоненти беше използван за намаляване на размерите със стойност на размерите 74, определена от функцията JackStrawPlot (Chung and Storey, 2015). Най-добрите 2000 силно променливи гена бяха избрани от функцията FindVariableFeatures и използвани заедно с информация за размерите за групиране. Сегментирането на клъстера беше извършено с помощта на стойност на разделителна способност 2,4. Командата FindClusters генерира общо 45 клъстера, които бяха лесно разграничени с клъстер-специфични маркерни гени, получени с функцията FindMarkers на Seuratpackage. Cluster26 вероятно се е състоял от умиращи клетки, които са избягали от параметрите на филтриране, тъй като не показва специфични маркерни гени, ниски митохондриални гени и сравнително малък брой функции. Графиките на Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction (UMAP) бяха генерирани с помощта на пакета uwot (Becht et al., 2019). Получените UMAP координати, клъстерни координати на Seurat и специфични за клъстера маркери бяха експортирани като csv файлове за анализ на потвърждение с помощта на софтуера Loupe Cell Browser (10x Genomics). Данните за scRNA-seq бяха депозирани в Националния център за биотехнологична информация Gene Expression Omnibus (GSE149134).

Избор на кандидати за гени, зависими от етапа на развитие

За да изберем кандидати за гени, зависими от етапа на развитие във всеки клъстер, използвахме функцията FindMarkers, за да вземем гени, които са били регулирани нагоре при P0 в сравнение с E15.5 (напр. сравнение между клъстер

8 at P0 and cluster 8 at E15.5 for podocytes). Subsequently, we utilized the AverageExpression function to add the average gene expression data for each cluster at each stage for stage-dependent comparisons (log-fold change >1 и p-стойност<0.05). to="" determine="" segment-specific="" genes,="" we="" compared="" the="" target="" cluster="" with="" all="" other="" clusters="" at="" p0="" and="" selected="" the="" genes="" with="" low="" p-values="" (p="" <="" 0.05)="" and="" low="" expression="" rates="" in="" other="" clusters="" (pct2=""><0.11). after="" selecting="" the="" overlapping="" genes,="" we="" verified="" them="" in="" umap="" plots="" to="" finalize="" the="" lineage-specific="" stage-dependent="">

Имунохистохимичен анализПарафиновите срезове се подлагат на извличане на антиген в цитратен буфер, промиват се три пъти с PBS и се блокират чрез инкубиране с 1% BSA в PBS в продължение на 1 час при стайна температура. След това срезовете се инкубират за една нощ с първични антитела при 4 °С. C, последвано от инкубиране с вторични антитела, конюгирани с бои Alexa Fluor за 90 минути при стайна температура. Ядрата бяха оцветени с 4,6-диамидино-2-фенил-индол (Roche; Cat # 10236276001). Използвани са следните първични антитела: биотинилиран LTL (Vector Laboratories; B-1325), заешки анти-SLC12A1 (StressMarq Bioscience; SPC-401D), плъши анти-KRT8 (Develop-mental Studies Hybridoma Bank, Университет на Айова; Troma-I), анти-NPHS1 на морско свинче (Progen; GP-N2); и заешко анти-CD31 (Abcam; ab28364). Флуоресцентните изображения бяха заснети от LSM780 конфокален микроскоп (Carl Zeiss) или FV3000 конфокален микроскоп (Olympus).

In situ хибридизацияRNAscope анализ на 10 процента фиксирани с формалин парафинови срезове се извършва с помощта на RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 (ADC; Cat # 323100). Усилването на сигнала се извършва с TSA плюс флуорофори (Thermo Fisher Scientific). Подробности за сондите на RNAscope са дадени в Таблица S3. Базираната на дигоксигенин in situ хибридизация на Kap се извършва, както е описано (Kaku et al., 2013), като се използва автоматизирана система за откриване (Roche), съгласно протоколите на производителя. Кап сондата беше клонирана чрез PCR, използвайки специфични праймери (Таблица S3), и белязана с дигоксигенин, използвайки РНК полимераза. Две до три проби на всеки ембрионален етап бяха изследвани за всяка сонда и показаха последователни резултати.

Трансплантация на ембрионални бъбреци на мишкаC57BL/6N бременни женски мишки (E12.5) и възрастни мъжки мишки (8–12 седмици) бяха закупени от CLEA Japan Inc. и настанени в специфично свободно от патогени съоръжение за животни. Възрастни мишки гостоприемници бяха анестезирани чрез перитонеално приложение на нормален физиологичен разтвор, съдържащ 0.75 mg/kg медетомидин, 4.{{10}} mg/kg мидазолам и 5.0 mg /kg буторфанол. Миши ембрионални бъбреци с клоака при E12.5 бяха трансплантирани в епидидимната мазнина на мишки гостоприемници (Yokote et al., 2015). След операцията като анестетичен антагонист се прилага атипамезол. Трансплантираните ембрионални бъбреци се събират на 12-ия ден след трансплантацията. За scRNA-seq анализ, бъбреците се дисоциират подобно на P0 бъбреците. Всички експерименти с животни бяха проведени в съответствие с нашите институционални указания и бяха одобрени от Комитета по етика на университета Кумамото (#A2019-113).

Повторен анализ на публично достъпните данни за scRNA-seqДанните за scRNA-seq за E14.5 миши ембрионбъбреки P1бъбрек(Adam et al., 2017b; Magella et al., 2017) бяха изтеглени от Gene Expression Omnibus (номера за достъп, съответно GSE94333 и GSE104396). Всички последващи анализи на тези данни бяха извършени на езика за статистически програмиране R (R Core Team, 2018), а пакетът Seurat (версия 3.2.2) беше използван за анализи, включително контрол на качеството, нормализиране на данни, мащабиране на данни и визуализация, както е описано в раздел 4.1.