Морфологични анализи на експресията на нефрин при прогресивна гломерулонефропатия

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Резюме:

В това проучване ние се съсредоточихме върху нефрина, една от ключовите молекули в прорезната диафрагма на подоцитите, тъй като въпреки че има съобщения за неговата експресия при хора и плъхове, тяхното присъствие в обикновените мармозетки не е докладвано. Изследвахме експресията на нефрин и промените в гломерулите, в зависимост от развитието на спонтанна прогресивна гломерулонефропатия при обикновените мармозетки. Бяха оценени деветнадесет обикновени мармозетки на възраст от две до десет години. Бъбрекът е изследван чрез микроскопия с хематоксилин и еозин и имунохистохимично оцветяване за нефрин. Лезиите бяха класифицирани в три степени според система за класифициране на бъбречни лезии, докладвана по-рано. Нефрин-позитивната зона се измерва чрез морфометричен анализ и се изчислява нефрин-позитивното съотношение. Експресията на нефрин се наблюдава по протежение на гломерулната капилярна бримка в непрекъснат линеен модел при степен на бъбречна лезия 0 до 2 и или прекъснат линеен, или груб гранулиран модел в степен 3. Експресията на нефрин има тенденция да намалява значително в зависимост от степента на бъбречните лезии . Предполага се, че промяната в експресията на нефрин играе важна роля в прогресията на бъбречните лезии.

Ключови думи:нефрин, мармозетка,гломерулонефропатия, бъбрек, патология

ползи от пустинята cistancheиРастение цистанчее добър забъбрек

Въведение

Известно е, че спонтанната прогресивна гломерулонефропатия при обикновените мармозетки (Callithrix jacchus) се появява често, започвайки на две години, като тежестта на лезията прогресира с възрастта. По-рано докладвахме за първични и прогресивни лезии на нефропатия при обикновени мармозетки1. Първичните гломерулни промени на нефропатия в ранен стадий се характеризират с изтриване на израстъците на подоцитните крака и частично удебеляване на гломерулната базална мембрана, за което се предполага, че причинява изтичане на протеин от гломерулите и може да се наблюдава чрез ултрамикроскопия, но не и чрез светлинна микроскопия1-3. Освен това, имуноглобулинът играе важна роля в прогресирането на нефропатия1, 2. IgM се отлага върху мезангиума в ранния стадий на гломерулонефропатия и след първото отлагане на IgM, зоната на отлагане се разширява до целия гломерул, а IgA и IgG се отлагат депозиран с прогресия2. Хиалиновите отливки, предполагащи изтичане на протеин от гломерулите, могат да се наблюдават чрез светлинна микроскопия с прогресия на гломерулонефропатия4. Протеинурията изостря прогресията на тубулоинтерстициалните лезии при обикновените мармозетки4, както при хората5, 6, и в скорошно проучване на гломерулите, протеинурията може да бъде предизвикана от нарушения на прорезната диафрагма, като по този начин се свързват съседни израстъци на крака (педикели) на подоцита. Прорезната диафрагма е междуклетъчен съединителен комплекс, присъстващ между съседни израстъци на краката, и някои молекули, свързани с нейното образуване, са идентифицирани3. Счита се, че намаляването на експресията на тези молекули или дисфункцията на процепната диафрагма са свързани с прогресията на протеинурията3. Нефринът, една от ключовите молекули, експресирани в процепната диафрагма на подоцитите, е гликопротеин, състоящ се от 1241 аминокиселини и е добре известен биомаркер, използван за наблюдение на разстройството на прорезната диафрагма7–10. Молекулите, свързани с прорезните диафрагми, не са изследвани при нефропатията на обикновените мармозетки, въпреки че е известно, че при тях се наблюдава промяна в процесите на подоцитните крака и прогресия на протеинурията. Освен това има съобщения за експресия на нефрин при хора и плъхове7–12, но не и при мармозетки. Следователно, ние изследвахме експресията на нефрин в гломерулите и промените в експресията на нефрин, в зависимост от прогресията на лезията, чрез имунохистохимични анализи.

cistanche tcm

Материали и методи

Животни

Това проучване е одобрено от Институционалния комитет за грижа и използване на животни към Централния институт за експериментални животни (CIEA; Кавазаки, Япония) и е извършено в строго съответствие с Наредбите за опити с животни на CIEA въз основа на Указанията за правилно поведение на Експерименти с животни (Научен съвет на Япония, 2006 г.). Бяха оценени деветнадесет обикновени мармозетки (11 мъжки и 8 женски) от CLEA Japan Inc. (Токио, Япония). Тяхната възраст варира от 2 до 10 години по време на аутопсията. Животните бяха настанени в клетки в стая за животни, поддържана при температура от 26 ± 3 градуса и влажност от 55 ± 20 процента. Те бяха хранени с LCMS-1M (CLEA Japan Inc., Токио, Япония) и чешмяна вода. Животните бяха хуманно умъртвени под анестезия с натриев пентобарбитал поради различни причини за умиране (като синтексис, изкривяване на лумбалните прешлени, дислокация на мандибуларната става и др.). Анализ на урината не е извършен, тъй като не може да се вземе проба от урина.

Хистопатология

Theбъбрецибяха перфузирани с физиологичен разтвор, последван от 4% параформалдехид и след това фиксирани в 10% неутрален буфериран формалин за микроскопско изследване. Образците бяха вградени в парафин, нарязани на 5 μm дебелина и оцветени с хематоксилин и еозин (HE). Лезиите бяха класифицирани като гломерулни, тубулни и интерстициални лезии въз основа на публикувани критерии1. Степените на нефропатията бяха разделени на четири групи: степен 1 ​​(3 мъже и 1 жена), степен 2 (3 мъже и 5 жени), степен 3 (1 мъж и 3 жени) и степен 4 (3 мъже) (Таблица 1).

За имунохистохимия, моноклонално антитяло срещу извънклетъчния домен от човешки произходнефрин(1:1,000, Нефринg{{0}}, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Далас, Тексас, САЩ) се използва като първично антитяло. 5-μm срезовете се депарафинизират, рехидратират, третират се с 3 процента водороден прекис при стайна температура за 5 минути и след това се нагряват в автоклав при 121 градуса за 20 минути в целеви разтвор за извличане (рН 6,0, Dako, Glostrup, Дания). След охлаждане срезовете се инкубират с първичното антитяло при 4 градуса за една нощ. Пероксидаза-конюгиран анти-миши и анти-заешки IgG полимер (Histofine Simple Stain Rat MAX-PO(MULTI), Nichirei Bioscience Inc., Токио, Япония) бяха използвани като вторично антитяло за базирания на полимер метод13. Срезовете се инкубират с вторичното полимерно антитяло при стайна температура в продължение на 30 минути и реакционните продукти се визуализират с помощта на 3,3'-диаминобензидин като хромоген. Контраоцветяването се извършва с хематоксилин. За отрицателната контрола първичното антитяло беше пропуснато.

Морфологичен анализ

За морфологичен анализ гломерулите с гломерулния хилус бяха представени за изследване и 16 до 28 гломерули бяха заснети на всеки слайд (Таблица 1) с помощта на скенер за цял слайд (Aperio AT2, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL, USA) и съответен софтуер за разглеждане на патологични слайдове (Aperio ImageScope, Leica Microsystems Inc.) при същата резолюция и размер на изображението.Нефрин-положителните и целите гломерулни области бяха изчислени със софтуер за анализ на изображения (Image-Pro V10, Mediacybenetics Inc., Rockville MD, САЩ) чрез начертаване на област от интерес около гломерула, съгласно предишен доклад14. Цялата гломерулна област се определя като зоната, която може да се различи от белия фон. Цветните прагове за изчисляваненефрин-положителните зони се определят според всяко условие на оцветяване. Праговете за червено, зелено и синьо бяха съответно 37–67, 31–77 и 32–88. Нефрин-положителното съотношение се изчислява чрез разделяне на измерванията нанефрин-положителна зона над гломерулната област. Беше извършен статистически анализ с помощта на теста на Jonckheere (ниво на значимост: 5 процента, едностранен тест), за да се оцени тенденцията между степента на нефропатия и изразяването нанефрин.

костанче

Резултати

Патологичните резултати и степени на отделните бъбречни лезии са показани в таблица 1. Както беше докладвано в първия ни доклад1, степента на лезията имаше тенденция да се увеличава с възрастта и нямаше очевидна разлика в пола. Резултатите от имунохистохимичното оцветяване нанефринса показани на фиг. 1, инефрин-положителното съотношение е показано на Фиг. 2 и Таблица 1. Сред резултатите и степените в Таблица 1, степента на бъбречната лезия, получена от общия резултат на всяка бъбречна лезия, и резултатът от хиалинов отливка бяха използвани за сравнение снефрин-положителен коефициент (фиг. 2 и 3). Индивидуалните случаи в Таблица 1 са показани във възходящ ред на степен на бъбречна лезия. Експресията на нефрин се наблюдава заедно с гломерулната капилярна бримка в непрекъснат линеен модел в степени 0 до 2 (Фиг. 1A–C) и прекъснат линеен или груб гранулиран модел в степени 3 (Фиг. 1D). В отрицателната контролна проба няма положителна реакция занефринсе наблюдава във всеки сайт.

Сравнението нанефрин-положителното съотношение към степента на бъбречната лезия е показано на Фиг. 2. В случаите на степен на бъбречна лезия 0, средното ± стандартно отклонение (SD) нанефрин-положителното съотношение беше 5,66 ± 1,18 процента, а максималната, минималната и средната стойност бяха съответно 6,84 процента, 4,27 процента и 5,76 процента. В случаите от степен 1 ​​средното ± SD е 3,99 ± 1,61 процента, а максималните, минималните и средните стойности са съответно 5,69 процента, 1,19 процента и 4,35 процента. В случаите от степен 2 средното ± SD е 3,82 ± 2,25 процента, а максималните, минималните и средните стойности са съответно 6,71 процента, 1,58 процента и 3,49 процента. В случаите от степен 3 средната стойност ± SD беше 2,52 ± 1.02 процента, а максималните, минималните и средните стойности бяха съответно 3,67 процента, 2,17 процента и 2,17 процента. Взети заедно, индивидуалните разлики в експресията на нефрин са малки в случаи на степен 0, но големи в случаи на степен 1 ​​или по-висока и спорадично се открива ниска положителна експресия.Нефринекспресията има тенденция да намалява в зависимост от степента на бъбречните лезии (фиг. 2). Имаше значително по-ниска тенденция между степента на бъбречна лезия инефрин-положителен коефициент според теста на Jonckheere (p=0.0166). Резултатът за хиалинна отливка в сравнение със степента на бъбречна лезия е показан на Фиг. 3. В случаи с скор от хиалинова отливка 0, средното ± SD на положителното съотношение на нефрин е 5,40 ± 1,32 процента, в случаите с резултат 1 е 4,10 ± 1,70 процента, а в случаите с резултат 2 беше 3,37 ± 1,98 процента. Съществува значително по-ниска тенденция между резултата на хиалинния кастинг и положителното съотношение на нефрин според теста на Jonckheere (p=0.0654).

Дискусия

Намаляването на нефрина е свързано с прогресията на бъбречните лезии по време на развитието на гломерулонефропатия на мармозета. Антитялото срещу нефрин, използвано в това изследване, разпознава извънклетъчния домен от страната на N-края. Този извънклетъчен домен взаимодейства с молекулите NEPH1 и образува структура, подобна на цип, в диафрагмата с прорез15. Локализацията на нефрин в нормалните гломерули е по гломерулната капилярна бримка и моделът на оцветяване е линеен модел от непрекъснати фини гранули както при плъхове, така и при хора 11, 12, 16–18. Оцветяването, извършено в това изследване, е подходящо; което се потвърждава от наблюдението, че капилярните стени в контакт с мезангиалната област не са оцветени, докато тези в контакт с подоцитите са. При необичайни състояния, като нефротичен синдром при хора или пуромицин аминонуклеозидна нефроза при плъхове, моделът на оцветяване с нефрин в гломерулите е прекъснат и едрозърнест, а интензитетът на имунохистохимичното оцветяване е по-слаб, отколкото в нормалните гломерули11, 16, 17. В настоящото изследване , моделът на експресия на нефрин в степени 0 до 2 е нормален; въпреки това моделът на оцветяване в степен 3 е сравним с този при анормални условия. При предишно изследване на експресията на гломерулен нефрин в Crl: CD(SD) плъхове с болест на минимална промяна, експресията на нефрин е непокътната, въпреки че процесите на краката на подоцитите показват изтриване при електронна микроскопия без видими морфологични промени, наблюдавани при светлинна микроскопия18. При честото бъбречно заболяване на плъхове, хронична прогресивна нефропатия (CPN), е доказано, че албуминурията, придружена от ранен стадий на CPN, може да доведе до по-малко промени в гломерулния пермеабилитет поради неуспеха да се реабсорбира албумин от проксималните тубули19. При хора има някои изследвания за намаляване на експресията на нефрин при незначителни промени10 или при други бъбречни заболявания14, 16. От друга страна, има доклад за интактна експресия на нефрин при нефроза с минимални промени20. Наличието или липсата на промяна в експресията на нефрин при нефротично заболяване с минимална промяна все още се обсъжда. В действителност беше трудно да се потвърди увеличаването или намаляването на реакцията на антитела на нефрин чрез визуално наблюдение при нефропатия на мармозета, но беше възможно да се открие промяната в целия бъбрек чрез анализ на изображението. Нашето изследване предполага, че аномалиите на прорезните диафрагми на гломерула могат да бъдат включени в прогресирането на нефропатия при обикновените мармозетки поради намаляване на нефрина. Трансформацията на положителния модел на оцветяване на нефрин, от линеен в гранулиран модел, е докладвана в животински модел на плъх на нефротично заболяване по време на развитието на лезията 11, 16, 21. Връзката между аномалиите на прорезната мембрана и протеинурията е често се съобщава22, 23; следователно се предполага, че протеинурията може да бъде причинена от дисфункция на диафрагмата. В нашето изследване на нефропатия на мармозета може да е настъпило прогресиране на пропускливостта на гломерулния протеин поради дисфункция на диафрагмата, тъй като морфологичните характеристики на хиалиновите отливки са наблюдавани само в случаите без тубулоинтерстициални промени. В това проучване не е наблюдавана статистически значима разлика между оценката на морфологичните промени на хиалиновите отливки и намаляването на експресията на нефрин. Експресията на нефрин обаче има тенденция да намалява в зависимост от резултата на хиалинния кастинг, който е индикатор за изтичане на протеин от гломерула.

В нашето предишно изследване се наблюдава изтриване на процесите на краката в ранния стадий на нефропатия на мармозетка и засегнатата област на процесите на краката се разширява в зависимост от степента на бъбречната лезия1. Таблица 2 показва връзката между скоростта на редукция на нефрин в това проучване и резултатите от електронната микроскопия за всяка степен на бъбречна лезия от предишно проучване. Смята се, че изтриването се дължи на срив в актиновия цитоскелет на процесите на стъпалото24. Нефринът се дефосфорилира, когато мембраната на процепа е конструирана, и се свързва с актин чрез CD2AP и подоцин 25, 26. Когато диафрагмата на прорез е наранена, молекулите на нефрин се струпват, предизвиквайки фосфорилиране на нефрин, полимеризация на актин и изтриване на процесите на стъпалото 26. Фосфорилирането на нефрин също се случва бързо след индуцирането на изтриване на процеса на крака в модела на протамин сулфат при мишки 27. Нефринът е гломеруларен адхезивен протеин, свързан с узряването на подоцитите, диференциацията, образуването на процеси и сигнализирането24. Нашето изследване показа, че има връзка между намаляването на експресията на нефрин, както е определено чрез имунохистохимия, и степента на прогресия на бъбречната лезия, което предполага разширяване на изтриването на процесите на крака на подоцитите. Въпреки това, не е ясно дали аномалиите в протеиновия комплекс на процепната диафрагма причиняват увреждане на процесите на краката на подоцитите или ако увреждането на подоцитите причинява промени в прорезните диафрагми и намаляване на нефрина. Тъй като нефринът също участва в диференциацията на подоцитите, се смята, че тази връзка ще бъде допълнително изяснена от данни за регенерация и диференциация на подоцити.

В заключение, нашите резултати предоставят информация занефринекспресия при прогресивна гломерулонефропатия при обикновени мармозетки. Морфологичният анализ разкрива по-ниска тенденция нанефринекспресия в подоцитите при прогресивна гломерулонефропатия на обикновени мармозетки и промяната нанефринпредполага се, че експресията играе важна роля в прогресията на бъбречните лезии.

Разкриване на потенциални конфликти на интереси:

Авторите декларират, че нямат конфликт на интереси.

Признание:

Авторите биха искали да благодарят на г-н Takayoshi Ito за отличната техническа помощ, която предоставиха. Авторите също благодарят на г-жа Канае Тамацукури и г-н Джеймс Харада за езиковата редакция на ръкописа.

систанч

Препратки
1. Yamada N, Sato J, Kanno T, Wako Y и Tsuchitani M. Морфологично изследване на прогресивна гломерулонефропатия при обикновени мармозетки (Callithrix jacchus). Toxicol Pathol. 41: 1106–1115. 2013.
2. Yamada N, Hashimoto N, Kamiie J, Doi T, Sato J, Inoue T, Shirota K и Tsuchitani M. Връзка между отлагането на имуноглобулин и ранните лезии на прогресивна гломерулонефропатия при млади обикновени мармозетки. Ветеринар Патол. 55: 173–176. 2018 г.
3. Cara-Fuentes G, Clapp WL, Johnson RJ и Garin EH. Патогенеза на протеинурията при идиопатична болест с минимални промени: молекулярни механизми. Педиатр Нефрол. 31: 2179–2189. 2016 г.
4. Isobe K, Adachi K, Hayashi S, Ito T, Miyoshi A, Kato A и Suzuki M. Спонтанни гломерулни и тубулоинтерстициални лезии при обикновени мармозетки (Callithrix jacchus). Ветеринар Патол. 49: 839–845. 2012 г.
5. Еди АА. Протеинурия и интерстициално увреждане. Трансплантация на Nephrol Dial. 19: 277–281. 2004 г.
6. Hingorani S, Gooley T, Pao E, Sandmaier B и McDonald G. Цитокини в урината след HCT: доказателства за бъбречно възпаление в патогенезата на протеинурията ибъбрекзаболяване. Трансплантация на костен мозък. 49: 403–409. 2014 г.
7. Kestilä M, Lenkkeri U, Männikkö M, Lamerdin J, McCready P, Putaala H, Ruotsalainen V, Morita T, Nissinen M, Herva R, Kashtan CE, Peltonen L, Holmberg C, Olsen
A и Tryggvason K. Позиционно клониран ген за нов гломерулен протеин--нефрин--е мутиран при вроден нефротичен синдром. Mol Cell. 1: 575–582. 1998 г.
8. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ, Thomson NM, Holthöfer H, Zaoui P, Pinel N, Cordonnier DJ и Gilbert RE. Протеинурия и експресията на протеина на подоцитната диафрагма, нефрин, при диабетна нефропатия: ефекти от инхибирането на ангиотензин-конвертиращия ензим. Диабетология. 45: 572–1576. 2002 г.
9. Welsh GI и Saleem MA. Характерна за нефрин молекула на гломерулния подоцит? J Pathol. 220: 328–337. 2010 г.
10. van de Lest NA, Zandbergen M, IJpelaar DHT, Wolterbeek R, Bruijn JA, Bajema IM и Scharpfenecker M. Загубата на нефрин може да се използва за прогнозиране на ремисия и дългосрочен бъбречен изход при пациенти с минимална промяна на заболяването.БъбрекInt Rep. 3: 168–177. 2017 г.
11. Kawachi H, Koike H, Kurihara H, Yaoita E, Orikasa M, Shia MA, Sakai T, Yamamoto T, Salant DJ и Shimizu F. Клониране на нефрин на плъх: експресия в развиващите се гломерули и в протеинурични състояния.БъбрекВътр. 57: 1949–1961. 2000 г.
12. Luimula P, Ahola H, Wang SX, Solin ML, Aaltonen P, Tikkanen I, Kerjaschki D и Holthöfer H. Nephrin при експериментална гломерулна болест.БъбрекВътр. 58: 1461–1468. 2000 г.
13. Janardhan KS, Jensen H, Clayton NP и Herbert RA. Имунохистохимия в изследователската и токсикологична патология. Toxicol Pathol. 46: 488–510. 2018 г.
14. Koop K, Eikmans M, Baelde HJ, Kawachi H, De Heer E, Paul LC и Bruijn JA. Експресия на свързани с подоцити молекули в придобит човешкибъбрекзаболявания. J Am Soc Nephrol. 14: 2063–2071. 2003 г.
15. Gerke P, Huber TB, Sellin L, Benzing T и Walz G. Хомодимеризация и хетеродимеризация на гломерулните подоцитни протеини нефрин и NEPH1. J Am Soc Nephrol. 14: 918–926. 2003 г.
16. Doublier S, Ruotsalainen V, Salvidio G, Lupia E, Biancone L, Conaldi PG, Reponen P, Tryggvason K и Camussi G. Преразпределението на нефрин върху подоцитите е потенциален механизъм за протеинурия при пациенти с първично придобит нефротичен синдром. Am J Pathol. 158: 1723–1731. 2001 г.
17. Kawakami H, Kamiie J, Yasuno K, Kobayashi R, Aihara N и Shirota K. Динамика на абсолютното количество нефрин в един подоцит при плъхове с пуромицин аминонуклеозидна нефроза, изчислено чрез подход на количествена гломерулна протеомика с избран режим на наблюдение на реакцията. Трансплантация на Nephrol Dial. 27: 1324–1330. 2012 г.
18. Yasuno K, Honda K, Hakamata S, Kai K и Mori K. Болест на минималната промяна набъбрекв млад плъх Sprague Dawley. J Toxicol Pathol. 31: 55–59. 2018 г.
19. Obert LA и Frazier KS. Участието на интрареналната ренин-ангиотензин система в патогенезата на хроничната прогресивна нефропатия - преодоляване на информационната празнина между дисциплините. Toxicol Pathol. 47: 799–816. 2019 г.
20. Patrakka J, Ruotsalainen V, Ketola I, Holmberg C, Heikinheimo M, Tryggvason K и Jalanko H. Експресия на нефрин в педиатриятабъбрекзаболявания. J Am Soc Nephrol. 12: 289–296. 2001 г.
21. Saran AM, Yuan H, Takeuchi E, McLaughlin M и Salant DJ. Комплементът медиира преразпределението на нефрин и дисоциацията на актин при експериментална мембранна нефропатия.БъбрекВътр. 64: 2072-2078. 2003 г.
22. Gagliardini E, Benigni A, Tomasoni S, Abbate M, Kalluri R и Remuzzi G. Целева регулация на извънклетъчния нефрин при човешка IgA нефропатия. Am J Nephrol. 23: 277–286. 2003 г.
23. Wakamatsu A, Fukusumi Y, Hasegawa E, Tomita M, Watanabe T, Narita I и Kawachi H. Роля на калциневрин (CN) вбъбрекгломеруларен подоцит: инхибиторът на CN подобрява протеинурията чрез инхибиране на преразпределението на CN в прорезната диафрагма. Physiol Rep. 4: e12679. 2016 г.
24. Гарг П. Преглед на биологията на подоцитите. Am J Nephrol. 47 (Допълнение 1): 3–13. 2018 г.
25. Ichimura K, Kurihara H и Sakai T. Организация на актиновите нишки на процесите на краката в подоцитите на плъхове. J Histochem Cytochem. 51: 1589–1600. 2003 г.
26. Ronco P. Протеинурия: всичко ли е в стъпалото? J Clin Invest. 117: 2079–2082. 2007 г.
27. Verma R, Kovari I, Soofi A, Nihalani D, Patrie K и Holzman LB. Ангажирането на нефриновия ектодомейн води до активиране на Src киназа, фосфорилиране на нефрин, набиране на Nck и полимеризация на актин. J Clin Invest. 116: 1346–1359. 2006 г.