Многокомпонентните режими на ваксиниране срещу Chlamydia Trachomatis с основно усилване индуцират реакции на антитела и Т клетки и ускоряват изчистването на инфекцията в модел на примат, различен от човека

От международен приоритет е разработването на ваксина срещу болести, предавани по полов пътИнфекции с Chlamydia trachomatisза борба с продължаващото глобално разпространение на инфекцията. Theоптимална имунизациястратегията все още предстои да бъде напълно изяснена. Целта на това проучване беше да се оцениимунизационни стратегиив модел на нечовекоподобни примати (NHP). Макаците Cynomolgus (Macaqua fascicularis) бяха имунизирани след различни многокомпонентниосновна имунизацияграфици и впоследствие провокирани с C. trachomatis SvD в долния генитален тракт. Имунизационните антигени включват рекомбинантния протеинов антиген CTH522 с адювант с CAF01 или алуминиев хидроксид, MOMP ДНК антиген и MOMP векторни антигени (HuAd5 MOMP и MVA MOMP).

Щракнете тук, за да получите билкова цистанче за профилактикаИнфекции с Chlamydia trachomatis

Всички антигенни конструкции са силно имуногенни, повишавайки значителни системни C. trachomatis-специфични IgG отговори. По-специално, групите, ваксинирани с протеин CTH522, повишават бърз и силен специфичен IgG в серума. Картографирането на специфични В клетъчни епитопи в рамките на MOMP показа, че всички ваксинирани групи разпознават епитопи близо до или в рамките на променливите домени (VD) на MOMP, с последователен VD4 отговор при всички животни. Освен това серумът от всички ваксинирани групи може in vitro да неутрализира както SvD, SvE, така и SvF. Отговорите на антитела бяха отразени върху вагиналната и очната лигавица, които показаха откриваеми нива на IgG. Ваксините също индуцират C. trachomatis-специфични клетъчно-медиирани отговори, както е показано чрез in vitro стимулация и вътреклетъчно цитокинно оцветяване на мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMCs). Като цяло, групите, ваксинирани с протеин (CTH522), установяват мултифункционален CD4 Т клетъчен отговор, докато групите, ваксинирани с ДНК и вектор, също установяват CD8 Т клетъчен отговор. След вагинално заразяване с C. trachomatis SvD, няколко от ваксинираните групи показахаускорено изчистване на инфекцията, но особено ДНК групата, подсилена с CTH522 с адювант CAF01 за постигане набалансиран CD4/CD8Т-клетъчен отговор, комбиниран с anIgG отговор, показанускорено изчистване на инфекцията.

КЛЮЧОВИ ДУМИ ваксина, инфекция,имунология, бактерии, CD4/CD8 лимфоцити,Хламидия трахоматис

Въведение

Гениталните инфекции с Chlamydia trachomatis годишно причиняват приблизително 131 милиона нови случая по света (1) и представляват основен глобален здравен проблем, като потенциално предизвикваттежки усложнениякато тазоватавъзпалително заболяване, извънматочна бременност, ибезплодие(2, 3). Антибиотиците все още предлагат ефективно лечение на инфекции с C. trachomatis. Въпреки това, тъй като инфекцията е безсимптомна в до 75 процента от случаите,повечето от инфекциите остават нелекувании предаването не се прекъсва (3). Общоприето е, че най-ефективното оръжие срещу продължаващото разпространение на хламидиалните инфекции е профилактичната ваксина (4).

Въпреки няколко години изследвания, ваксина все още не е на пазара. Това отчасти се дължи на сложния двуфазен начин на живот на C. trachomatis. Уникалният двуфазен жизнен цикъл на C. trachomatis, с вътреклетъчен и извънклетъчен стадий, предизвиква имунната система. Смята се, че защитният имунитет трябва да се състои от клетъчно-медиирани имунни (CMI) отговори, в допълнение към серотип специфични антитела (5-13). Освен това генерирането на лигавичен имунитет в гениталния тракт представлява допълнително предизвикателство за ваксината.

В настоящото проучване тествахме различни стратегии за ваксина в модел на инфекция с NHP хламидия. Стратегиите имат за цел да индуцират антитела, CD4 Т клетки и/или CD8 Т клетъчен отговор. В допълнение, някои от ваксините са насочени към генериране на мукозен отговор. Антигените, избрани за това изследване, са базирани на основния протеин на външната мембрана. Първо, беше генериран консенсусен MOMP антиген (Con E), базиран на приблизително 1500 последователности на серовар E ompA, за да се осигури високо епитопно покритие срещу най-разпространените щамове на C. trachomatis (14). Второ, използван е синтетичен слят протеин, CTH522. CTH522 е рекомбинантна, проектирана версия на MOMP, включваща хетероложни имуноповторения на VD4 области от четири генитални Ct серовара (D, E, F и G) (11). Стратегията зад рекомбинантния слят протеин е да индуцира усилени отговори към защитните епитопи и да индуцира кръстосана сероварна защита (11).

Друга ключова характеристика на настоящия експеримент беше паралелна оценка на CTH522 в две подчертано различни адювантни системи (AlOH и CAF01), комбинирани с интраназален бустер. Тази комбинация е тествана при мишки и малки прасета, където е доказано, че е силно имуногенна чрез индуциране на високи титри на неутрализиращи антитела, IFN-g-продуциращи CD4 плюс Т клетки и ускорен клирънс на генитална C. trachomatis инфекция (11-13 , 15). Освен това, това сравнение отразява скорошно първо клинично изпитване при хора, при което и двете формулировки са доказали, че са имуногенни и където CAF01 е по-добър в индуцирането на неутрализиращи серумни антитела и медиирани от Th1 клетки имунни отговори (16). За да се индуцират силни клетъчни имунни отговори и по-специално CD8 Т клетъчни отговори, комбинирани с CD4 Т клетъчни отговори, част от животните бяха подсилени с имуноген CT522/CAF01 след първично зареждане с адено вектор pAL1112 (HuAd5-MOMP), MVA pox вектор или плазмидна ДНК pcDNA3.1, доставяща MOMP Con E антиген (14, 17). И трите вектора са доказали имуногенност в NHPs и наскоро беше показано, че стратегия за имунизация, комбинираща тези три ваксини и крайна бустер ваксинация с адювантен протеинов антиген-индуциран превъзходен имунен отговор и последователно повишава клирънса на интравагинален C. trachomatis в миши C. модел на инфекция с трахоматис (14).

В настоящото изследване ние демонстрираме, че различни комбинации от многокомпонентни имунизационни стратегии с протеинови ваксини, ДНК ваксини и рекомбинантни вирусни векторни ваксини в модел на нечовешки примати (NHP) водят до различни имунни отговори. Освен това наблюдаваме, че режим, използващ праймиране на ДНК и протеин (CTH522/CAF01), повишава ускореното бактериално изчистване след генитално предизвикателство с Chlamydia trachomatis.

Резултати

Всички режими на ваксиниране се оказаха безопасни и предизвикаха значителни системни отговори на антитела

Общо 30 cynomolgus макаци бяха ваксинирани след различни режими на ваксиниране с първично усилване, включително протеинови, ДНК и векторни ваксини и различни пътища на приложение, както е показано на фигура 1 и допълнителни фигури 6-10). Всички животни остават здрави по време на изследването и не развиват измерими неблагоприятни ефекти от имунизациите. В допълнение, не наблюдавахме значителни колебания в теглото или температурата на животните (допълнителни фигури 1, 2).

Във фиксирани времеви точки след имунизациите се събира серум и нивата на CTH522 специфичен IgG в серума се оценяват чрез ELISA. Всички 5 ваксинирани групи установиха значителен серумен CTH522 IgG отговор (Фигура 2). Въпреки това, кинетиката е леко различна в 5-те ваксинирани групи. Всички животни в групите CTH522/AlOH плюс IN, CTH522/CAF01 и CTH522/CAF01 плюс IN повишават значителен IgG титър след само 1 интрамускулна (IM) имунизация и IgG титърът остава значителен до последната точка на вземане на проби (Фигури 2A- ° С). Серумните нива на IgG нарастват малко по-бавно в групите ДНК плюс CTH522 и вектори плюс CTH522, където всички животни са сероконвертирани съответно на седмица 8 и седмица 4 (Фигури 2D, E).

Групите CTH522/AlOH плюс IN, CTH522/CAF01 плюс IN и CTH522/CAF01 значително повишават серумния IgG след 3-та IM бустер ваксина през седмица 16 (Фигури 2A C). Групите ДНК плюс CTH522 и вектори плюс CTH522 повишават серумните нива на IgG значително след протеин/CTH522/CAF01 IM бустер през седмица 20 (Фигури 2D, E). Не са наблюдавани значителни разлики в отговорите на серумните антитела след трикратни IM ваксинации с CTH522, формулиран или с CAF01, или с AlOH адювант (Фигури 2A, B), и интраназалните (IN) бустерни имунизации без адювант в CTH522/AlOH плюс IN и CTH522/CAF01 плюс IN групите не индуцират никакво значително повишаване на титрите на серумните IgG антитела (Фигури 2A, B).

Кинетиката на серумния IgG отговор отразява кинетиката/нивата във вагиналните течности, което показва, че антителата, открити на вагиналната повърхност, вероятно са получени от кръвообращението. По подобен начин, очните нива на IgG също следват серумните нива на IgG и, както се наблюдава в серума, показва, че IM бустерът в ДНК/векторните групи повишава очния титър на IgG (допълнителна фигура 3).

Отговорите на серумните антитела са насочени срещу вариабилни домени 1, 3 и 4 в MOMP последователността

След това беше оценено по-нататъшно изясняване на разпознаването на специфичния епитоп от серумните антитела, следвайки различните режими на ваксинация. Серумът беше анализиран на седмица 24, т.е. след интраназалните бустер ваксини в групи 1 и 2 и след IM бустер ваксините в ДНК и векторните групи (групи 4 и 5). Тези анализи бяха извършени с пептиден масив, покриващ CTH522, състоящ се от 15 mer пептиди с 14 аминокиселинно припокриване

ФИГУРА 1 Дизайн на изследването. Фигурата показва използваните групи, ваксини и начини на приложение (интрамускулно, IM или интраназално, IN).

ФИГУРА 2 (A–F) Серумни отговори на CTH522 IgG антитела. Макаците Cynomolgus бяха имунизирани след различни режими на основно усилване (n=5 на група) и серумът беше събиран всяка втора седмица. Специфичните CTH522 IgG антитела в серума бяха оценени чрез ELISA и изразени тук като титър по скала log10. Сивите стрелки показват ваксинации. Всеки ред представлява едно животно. Статистическата значимост е обозначена със звездички *p < 0.05 и **p < 0.01.

Като цяло, разпознатите пептиди са разположени близо до и в рамките на променливите домени (VDs 1,3,4) на MOMP. Групата CTH522/AlOH дори показа известно разпознаване на VD2 региона. Всички животни са установили силен отговор срещу VD4 региона, който съдържа запазения неутрализиращ VD4 епитоп (11). ДНК групата показа най-тясното разпознаване в рамките на VD (Фигура 3), докато векторната група показа малко по-широк модел на разпознаване. Групите CTH522/CAF01 и CTH522/AlOH показаха най-широко признание, особено срещу SvF и SvG.

Серумните антитела успяха да неутрализират SvD, SvE, SvF in vitro

За да се оцени капацитетът на индуцираните от ваксината антитела да инхибират инфекцията от C. trachomatis на неговите целеви клетки, беше извършен in vitro неутрализационен анализ. Използвайки този анализ, ние изследвахме неутрализирането както на SvD, SvE, така и на SvF. За анализа е използван серум от 24-та седмица, а серумът от наивната група е използван като контрола. И петте ваксинирани групи показват способност да неутрализират и трите серовара (Фигура 4). Срещу SvD групата CTH522/AlOH плюс IN показа най-високия 50 процента неутрализиращ титър, докато срещу SvE групата DNA/CTH522, следвана плътно от групата CTH522/AlOH плюс IN, показа най-високи неутрализиращи титри. Въпреки че всички групи успяха да неутрализират SvF, 50-те процента неутрализационни титри бяха малко по-ниски за всички групи срещу този серовар, в сравнение със SvD и SvE. Групата с вектори плюс CTH522 показа най-ниските 50 процента неутрализационни титри от всички ваксинирани групи.

Различните режими на ваксиниране предизвикват различни Т-клетъчни профили

За да се оценят индуцираните от ваксинация Т-клетъчни отговори, PBMCs бяха събрани по време на периода на изследването и криоконсервирани. PBMCs от седмица 0/базова линия и седмица 22 бяха повторно стимулирани с пептидни пулове (MOMP) и оценени за вътреклетъчни цитокини чрез оцветяване с вътреклетъчни цитокини (ICS) и друга цитометрия. PBMC бяха оцветени за следните клетъчни маркери: CD3, CD4, CD8, CD154, CD137 и цитокини: IFN-g, IL-2, TNF-a, IL-22, IL{{14} }А. Стратегията на стробиране е показана на допълнителни фигури 4, 5. Стимулирането на PBMCs с MOMP пептидния пул индуцира значителен отговор. Процентът на антиген-специфични CD154 плюс CD4 плюс Т клетки, експресиращи комбинации от IL2, IFN-g и TNF-a, се повишава 2 седмици след последната имунизация (W22) във всички ваксинирани групи (Фигура 5). По-голямата част от тези Т клетки са многофункционални в смисъл, че експресират няколко цитокини. Процентът на антиген-специфичните CD137 плюс CD8 Т клетки, продуциращи цитокини, е увеличен само в ДНК и векторната група (W22), (Фигура 6, показваща мултифункционалността на CD137 плюс CD8 плюс Т клетки). в

ФИГУРА 3 Картографиране на серумен епитоп на седмица 24. Макаците Cynomolgus бяха имунизирани след различни режими на основно усилване (n=5 на група) и серумът беше събран на седмица 24. Пептиден масив IgG отговори на CTH522 15mer припокриване пептидите са представени като среден сигнал за всяка група с VD1 пептиди (оранжев), VD2 (зелен), VD3 (син) и VD4 от SvD, E, F и G (червен), подчертани в цветове.

ФИГУРА 4 In Vitro серумна неутрализация на C. trachomatis SvD, SvE и SvF. Макаците Cynomolgus бяха имунизирани след различни режими на основно усилване (n=5 на група) и серумът беше събран след приключване на имунизационния график (седмица 24). C. trachomatis SvD, SvE и SvF се инкубират със серум от всяко животно и капацитетът на серумните антитела да инхибират инфекцията се оценява чрез инкубиране на сместа антитяло-бактерия върху HaK клетки и оцветяване за включвания. Черната линия показва SvD, сивата линия показва SvE, а тъмносивата пунктирана линия показва SvF. Пунктираната червена линия показва реципрочния 50 процента неутрализационен титър на всеки серовар.

ФИГУРА 5 Отговори на CD4 Т клетки. Мултифункционални анализи, седмица 22. Производство на цитокини от CD4 плюс Т клетки, анализирано чрез ICS. Представени са многофункционални отговори след стимулация с групи от припокриващи се пептиди от MOMP. Размерът на всеки пай е пропорционален на процента CD154 плюс CD4 плюс Т клетки, експресиращи поне един цитокин, включително IFN-g, TNF-a и IL-2, и пропорциите на клетките, експресиращи IFN-g и /или цитокините TNF-a и/или IL-2 са показани във всеки пай.

Индуцирано от ваксинация ускорено изчистване на вагинална C. trachomatis SvD инфекция

За да се оцени защитната ефикасност на индуцираните от ваксината имунни отговори, животните бяха заразени с вагинална инфекция с 5x107 IFUs C. trachomatis SvD. След инокулацията, вагиналното хламидиално натоварване се определя чрез PCR откриване на хламидиална ДНК във вагинални тампони (Фигура 7). Инфекцията беше изчистена при всички животни до седмица 5 в групата с ДНК плюс CTH522/CAF01 и групата с вектор плюс CTH522, до седмица 6 в групата CAF01/CTH522 и до седмица 8 в групата с CTH522/Alum плюс IN група (Фигура 7). В контролната група, на седмица 8, 80 процента от животните са изчистили инфекцията и 1 животно остава PCR положително на седмица 9. IN бустерът в групата CTH522/CAF01 плюс IN не повишава защитата (Фигура 7). Тест за логаритмичен ранг (Mantel-Cox), сравняващ всички групи, показва стойност на P от 0,0994 и чрез сравняване на всяка от групите поотделно с контролните групи, само групата DNA-CTH522 показва стойност на P под 0,05 (P стойност =0.0257).

Дискусия

Настоящото проучване е предназначено да индуцира клетъчен имунитет (CD4 и CD8), комбиниран с хуморален имунитет и да приспособи фенотипа на адаптивния имунитет с MOMP-базирани Chlamydia ваксини. Ние оценяваме имуногенността и защитната ефикасност на комбинираните многокомпонентни имунизационни стратегии с протеинови ваксини (CTH522, Con E), ДНК ваксина и рекомбинантен вирусен вектор (MVA MOMP) и ваксини, базирани на аденовектор, в нечовекоподобен примат ( NHP) модел.

Данните показват, че всички режими на имунизация са имуногенни и индуцират както клетъчен, така и хуморален отговор, състоящ се от неутрализиращи антитела (фигури 2-4). Протеиновата ваксина CTH522, формулирана с CAF01 или AlOH, показва бърза индукция на системен антиген-специфичен IgG (Фигура 2). Не наблюдавахме никакви значителни разлики между отговорите, предизвикани от ваксини с адювант AlOH и CAF01, което е в съгласие с отговорите, наблюдавани при хора с тези адюванти (16). Режимите на ДНК и векторна ваксинация също индуцират значителни титри на антиген-специфични системни антитела, които значително се повишават след имунизацията с протеинов бустер (Фигура 2). В съгласие с нашите резултати, предишно проучване при мишки също показа, че режимите на протеинова ваксинация индуцират по-високи нива на антиген-специфични антитела в сравнение с ДНК и антигените на векторната ваксина и също така ефективно повишават титрите за тези групи (15).

MOMP съдържа четири VD, които са изложени на повърхността на инфекциозната форма на Ct. Тези области са основна цел на антитяло-зависимия имунитет, както чрез неутрализиращи антитела, така и чрез Fc рецептор-медииран имунитет (18). Предишни проучвания показват, че адаптивният трансфер на индуциран от ваксина неутрализиращ серум значително намалява ранното бактериално отделяне след инфекция с C. trachomatis (6, 11, 19–21). По този начин изглежда, че антителата играят роля в неутрализирането/контролирането на първоначалния инокулум, вероятно в сътрудничество с клетъчния имунитет. Чрез подробно картографиране на В-клетъчен епитоп ние открихме разпознаване на VD региони 1, 3, 4 във всички групи ваксини. ДНК и векторните групи също разпознаха VD1, 3 и 4 регионите. Въпреки това, тези групи показаха малко по-тясно разпознаване в рамките на тези VD в сравнение с групите CAF01 и AlOH, вероятно отразявайки, че Con E антигенът във векторните групи не съдържа VD4 областта на SvF и G (Фигура 3). Разпознаването на VD4 региона корелира със способността на всички стратегии за ваксина да индуцират неутрализиращи антитела срещу SvD, SvE и SvF.

Парентералната имунизация с CTH522 в CAF01 и AlOH индуцира значителни нива на мукозни антитела (IgG) в гениталния тракт и окото и нивата корелират със серумните титри (допълнителна фигура 3, седмица 18). ДНК и векторните ваксини сами по себе си не индуцират мукозен IgG, което отразява по-ниските серумни титри в сравнение със самостоятелния протеин. Въпреки това, след CTH522/CAF01 IM бустер, тези групи значително повишават серумните Ab. нива и на вагинален и очен IgG, наравно с протеина самостоятелно (допълнителна фигура 3, седмица 18). Паралелната оценка на CTH522 в различните първични адювантни системи (AlOH и CAF01), последвани от двукратно интраназално усилване с антиген, няма усилващ ефект върху нивата на мукозните антитела (допълнителна фигура 3, седмица 22). Така общите серумни нива на IgG се отразяват върху лигавицата за всички групи. Скорошно изпитване фаза I при хора също оценява паралелната оценка на CTH522 в AlOH и CAF01, последвано от двукратно интраназално усилване. Тук мукозните IgG титри също корелират добре със серумните IgG концентрации (16). Обаче, за разлика от констатациите в модела NHP, изпитването при хора показа ефект от усилване на IN в групата CAF01, което води до повишени нива както на IgG, така и на IgA. За съжаление, оценката на IgA не беше възможна в настоящото проучване, поради ограничен материал и фалшиво положителни сигнали в резултат на кръстосано реагиращо вторично антитяло, използвано в анализа. И двете проучвания използват устройството VaxINator, което е предназначено да пулверизира назални лекарства за мукозна адсорбция. Въпреки това, носната кухина на хората е много по-просторна, отколкото при NHP и може да се предположи, че това може да повлияе на равномерното разпределение и усвояване на антигена.

Няколко проучвания както при хора, така и при гризачи демонстрират важността на Th1 Т клетъчния имунитет и ефекторния цитокин IFN-g (8, 22–27). Обратно, по-малко се знае за защитната роля на CD8 Т клетките (28–33). Всички групи с ваксина индуцират CD4 Т клетки, но само ДНК и векторните групи показват CD8 Т клетъчен отговор (Фигури 6 и 7). Въз основа на измерените цитокини, CD8 Т клетките са съставени от ограничен брой подгрупи в сравнение с CD4 Т клетките, които могат да бъдат разделени на 6 или повече подгрупи, повечето от които произвеждат няколко цитокини (Фигура 7). CD4 Т клетките показват повече IL-2-експресиращи подгрупи, отколкото CD8 Т клетки, които основно включват само една IL-2-експресираща подгрупа, тази, която експресира IL-2 заедно с IFN-g и TNF- a (Фигура 6). CD8 Т клетките бяха доминирани от голяма популация, произвеждаща само IFN-g, докато другата доминантна CD8 Т клетъчна подгрупа продуцира както IFN-g, така и TNF-a. Този модел на цитокини сред CD4 Т клетките и CD8 Т клетките не е различен от наблюдавания при мишки при тестване на стратегии за ваксина, способни да индуцират както CD4, така и CD8 Т клетки (34).

Подобна стратегия, включваща ДНК ваксинация, последвана от подсилване с имуностимулиращи комплекси (ISCOM) на MOMP протеин (35), предизвиква силна защита срещу белодробна инфекция с Chlamydia muridarum. В това проучване ДНК MOMP (или MOMP/ISCOMS) индуцира значително по-слаба защита (35). Друго проучване показа, че ваксинирането на мишки с ДНК MOMP плазмиди, без субединица ваксина, не успява да защити срещу генитално заразяване с C. trachomatis (36), което показва, че ДНК стратегията има полза от допълването с субединица ваксина, индуцираща CD4 Т клетки и антитела . Трябва да се отбележи, че ДНК ваксините са показали относително ниски профили на имуногенност при клинични изпитвания при хора, което може да се наложи да бъде разгледано в бъдещи проучвания (37).

Въпреки че дозата на Ct инфекция, използвана в това проучване, е по-висока от дозата, получена от естествена инфекция при хора, тя е избрана, за да се гарантира, че всички животни са заразени, което е важно предвид малкия брой животни във всяка група. Дозата е в съответствие с дозата, използвана в предишни проучвания, която варира от 106 до 108 (38, 39). Намаляването на дозата в нашия модел доведе до повишена вариация по отношение на приема на инфекция (данните не са показани). Използвани са и по-ниски дози, прилагани многократно (40, 41). Това обаче не е оптимален протокол, когато целта е да се тества защитната ефективност на ваксините, особено ако естественият имунитет медиира защитата преди протоколът за инфекция да е завършен. Може да се спекулира, че използването на висока доза може да изисква имунен отговор, който включва всички части на имунната система, като антиген специфични CD4 Т клетки, CD8 Т клетки, както и неутрализиращи антитела, за да може да се намали бактериалната нива. Това също би обяснило защо неутрализиращите антитела, индуцирани във всички групи, не са довели до значителна защита във всички групи [въпреки че забелязахме тенденция към ранна защита в повечето групи, където се смята, че антителата играят роля (Фигура 7)] . В момента се опитваме да разработим физически по-подходящ модел.

Взети заедно, нашите данни показват, че антигенът CTH522, формулиран в адюванта CAF01 или AlOH, може да индуцира както мултифункционални Т клетки, така и неутрализиращи антитела в NHPs. Нещо повече, нашите резултати предполагат, че стратегия за хетероложна ваксина, състояща се от ДНК ваксина и CTH522/CAF01 субединица ваксина, представлява обещаваща стратегия за ваксина за индуциране на многостранен имунен отговор с високо ниво на неутрализиращи Abs, комбинирани със силни CD4 и CD8 Т клетъчни отговори, които може значително да ускори изчистването на инфекция с C. trachomatis.

Питай за още:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/телефон: плюс 86 15292862950

Магазин Wecistanche

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop