Мирицетинът подобрява индуцираната от Ox LDL HUVEC апоптоза и възпаление чрез LncRNA GAS5 Регулиране на експресията на MiR 29a 3p

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Атеросклерозата (AS) е значителна причина за заболеваемост и смъртност сред сърдечно-съдовите заболявания, която първоначално се задейства от ендотелна дисфункция и се характеризира с приток на атерогенни липопротеинови компоненти. Това е основният потенциален фактор за повечето фатални заболявания, като миокарден инфаркт, нестабилна стенокардия, внезапна сърдечна смърт и инсулт. Въпреки че етиологията е включена, теорията за отговора на увреждането, че увреждането на васкуларните ендотелни клетки (ЕС) е иницииращият механизъм на AS, все още е широко възприета3,4.ОкислителноДоказано е, че липопротеинът с ниска плътност (ox-LDL) участва в образуването на атеросклероза и индуцираното от него съдово ендотелно увреждане е една от ранните патогенези на атеросклерозата. Досега контролирането на развитието на AS остава голямо предизвикателство, тъй като молекулярните механизми на AS не са напълно разбрани. Следователно, намаляването на индуцираното от вол-LDL увреждане на ЕК и допълнителното обяснение на неговия механизъм може да бъде потенциална стратегия за превенция и лечение на AS. Мирицетин (Myr) е често срещан естествен флавоноид, намиращ се в много плодове, зеленчуци и билки. Myr играе съществена роля при лечението и профилактиката на някои заболявания, включително диабетна остеопороза, хепатоцелуларен карцином8, алкохолен черен дроб³,и рак на кожата9, due to its powerful iron-chelating capability,антиоксидантни и дейности по отстраняване на свободните радикали. Наскоро,кардиопротективенролята на Myr привлече вниманието на изследователската общност. Myr показва защитен ефект върху индуцираните липополизахариди (LPS).възпалителен миокарденнараняване, сърдечнохипертрофияи миокардно увреждане, предизвикано от исхемия/реперфузия (I/R)3. Ефектът на Myr върху липидния метаболизъм и атеросклерозата обаче не е напълно разбран.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Материали и методи

Клетъчна култура, модел на увреждане, индуциран от ox-LDL, и пролиферация.

Човешки ендотелни клетки от пъпна вена (HUVEC) от клетъчната банка на Китайската академия на науките (Шанхай, Китай) бяха култивирани в DMEM, допълнен с 10 процента FBS поднормоксиченусловия при 37 градуса. HUVEC бяха третирани с различни концентрации（50,100,200 ug/ml）на волски LDL（Union-Bio Technology,Китай）и бяха събрани на 24 часа за по-нататъшни измервания. Съгласно инструкциите на производителя, скоростите на пролиферация на клетките се измерват с CCK8 анализ (Solarbio, Китай).

Cistanche може да подобри имунитета

Поточен цитометричен анализ на апоптоза с двойно оцветяване с PI и анексин V.

Клетъчната апоптоза беше оценена чрез поточна цитометрия, използвайки PI и анексин V комплект за двойно оцветяване на апоптоза (Solarbio, Китай), следвайки инструкциите на производителя.

Измерване на реактивни кислородни видове (ROS). Вътреклетъчната ROS се определя с помощта на ROS Assay Kit（Beyotime,Китай）. Накратко,клетките се инкубират с 10 μM DCHF-DA в продължение на 20 минути и след това интензитетът на флуоресценция се оценява под четец на микроплаки.

РНК имунопреципитационен (RIP) анализ.

RIP беше извършен с помощта на Magna RIP Kit (Millipore, САЩ), следвайки протокола на производителя18. Накратко, HUVEC клетките бяха събрани и лизирани в пълен RIP лизисен буфер. След това протеиновият екстракт от цяла клетка се инкубира с RIP буфер, съдържащ магнитни перли, конюгирани с човешко анти-AGO2 антитяло или отрицателна контрола с нормален миши IgG. След това извлечената РНК се открива чрез qRT-PCR.

Анализ на РНК флуоресцентна in situ хибридизация (FISH). Специфични сонди за GAS5 последователността и miR-29a-3p са проектирани и синтезирани от RiboBio. FISH Kit (RiboBio) е използван за откриване на сигнали на сонди съгласно инструкциите на производителя. Ядрата се оцветяват с DAPI.

Репортерен анализ с двойна луцифераза. Двойно-луциферазен репортерен анализ беше използван за откриване на взаимодействието между GAS5 и miR-29a-3p промоторната област.

Дивият тип и мутационните последователности на местата на свързване (WT-GAS5 и MUT-GAS5) бяха проектирани и синтезирани. HUVEC клетките бяха трансфектирани в комбинация с WT(Mut)GAS5 вектор и miR-NC или miR-29a-3p с помощта на Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen). След 48 часа трансфекция се използва репортерна система за анализ с двойна луцифераза (Promega) за провеждане на луциферазния анализ.

Определяне на VCAM-1, IL-6 и MCP-1.

Нивата на супернатантен моноцит хемо-привличащ протеин-1(MCP-1), интерлевкин-6 (IL-6) и адхезионна молекула 1 на съдови клетки (VCAM{{6} }) са определени с комплекти ELISA. IL-6 ELISA комплект (ab178013), MCP-1 ELISA комплект (ab179886) и VCAM-1 ELISA комплект (ab223591) са използвани в съответствие с инструкциите на производителя инструкции.

Количествена PCR в реално време (gRT-PCR).

Общата РНК се изолира с помощта на реагент Trizol (Takara Bio Inc., Япония）според протокола на производителя. cDNA се генерира от общата RNA（2 ug）с комплект за обратна транскрипция на cDNA (Applied Biosystems, САЩ) и SYBR-базирана PCR в реално време беше извършена за откриване на общите mRNA транскрипти на Applied Biosystems (ABI) 7300 бърза PCR система в реално време. Праймерните последователности са изброени по-долу.

Western blot анализ.

Протеинова експресия на Bax, Bcl-2, каспаза3, CD31, SM22a, p-p65, p65, p-IkBa, IkBa и TLR4, беше измерена чрез Western blotting. Протеинови проби, изолирани от HUVEC клетки (25 ug)) се разделят с помощта на SDS-PAGE и след това се преместват в мембрана от поливинилиден флуорид (PVDF) (Millipore, САЩ), като се изследват с GAPDH (#2118, 1:5000, клетъчно сигнализиране), Bax (#2772S,1:1000, клетъчно сигнализиране), Bcl-2 (#15071S,1:1000, клетъчно сигнализиране),caspase3(#9662S,1:1000, клетъчно сигнализиране), CD31 (ab9498,1:1000 , Abcam), SM22a (ab14106,1:1000,Abcam),p-p65 (10745-1-AP 1:1000, Proteintech), p65 (66535-1-Ig,1:1000,Protein-tech), p-IkBa(10268-1-AP,1:1000, Proteintech),IkBa(66418-1-Ig,1:1000, Proteintech) и TLR4(66350-1-Ig, 1:1000, Proteintech) антитяло последвано от подходящо вторично антитяло. Всички Western blots се повтарят поне три пъти. Накрая, протеиновата експресия се визуализира с подобрена хемилуминесцентна (ECL) система.

Имунофлуоресцентен анализ.

Клетките, отгледани върху слайдове, бяха фиксирани, пермеабилизирани, блокирани и имунооцветени за една нощ с антитела на CD31 (ab9498, 1:200, Abcam) и SM22a (ab14106, 1:200, Abcam). След промиване, специфични втори FITC-белязани IgG антитела се инкубират с клетки непрекъснато. Накрая изображенията бяха получени под микроскоп (Olympus, Япония) с подходящо увеличение.

Статистически анализ. Всички резултати са показани като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Статистически значимите резултати бяха определени с помощта на еднопосочен ANOVA, последван от теста Student-Newman-Keuls(SNK)q. p-стойност<0.05 was="" considered="" to="" be="">

Резултати

Мирицетинът намалява индуцираната от вол-LDL апоптоза и ROS в HUVECs.

На първо място, 100 ug/ml ox-LDL инкубация за 24 часа доведе до значително дозозависимо намаляване на клетъчната жизнеспособност. Предварителното третиране с l uM Myr за 2 часа няма значително влияние върху клетъчната жизнеспособност. въпреки това,2,5 и 5 μM Myr причиняват значително намаляване на жизнеспособността на клетките (фиг. 1A и B). В допълнение, ние забелязахме, че усилването на ROS, индуцирано от ox-LDL в HUVECs, беше намалено от Myr (фиг. 1C). Ние също така изследвахме ефекта на Myr върху апоптозата. Освен това, проточната цитометрия и свързаният с апоптозата протеинов резултат също разкриват, че индуцираната от 100 ug/ml ox-LDL HUVEC апоптоза е драстично дозозависимо обърната предварително третирани с MYR клетки (фиг. 1D и E).

Мирицетинът инхибира възпалителния отговор и EndMT в HUVEC клетки, индуцирани от ox-LDL. Имунофлуоресцентното оцветяване показва, че инкубирането на HUVECs с ox-LDL намалява експресията на ендотелния маркер CD31 и повишава експресията на мезенхимния маркер SM22a, което показва, че състоянието ox-LDL задейства EndMT. Но тези ефекти се смекчават от MYR. Последователно Western blot показа, че Myr отслабва повишеното ниво на SM22a протеин в HUVECs, индуцирани от ox-LDL (Фигура, 2A и B). В присъствието на ox-LDL нивата на mRNA на IL-6, MCP{{ 11}}, VCAM-1 очевидно бяха регулирани нагоре в HUVECs, докато лечението с Myr обърна тези анормални промени (Фигура 2C). По същия начин, подобни резултати бяха допълнително потвърдени от ELISA (фиг. 2D).

Свръхекспресията на GAS5 отслабва защитните ефекти на мирицетин срещу HUVEC iniur, медииран от ox-LDL.

Освен това открихме експресията на GAS5 в HUVEC с gRT-PCR. Както е показано на Фигура 3A, значително по-високо ниво на GAS5 се наблюдава в групата на ox-LDL, отколкото в контролата. Обратно, нивото на mRNA на GAS5 беше намалено в групата, лекувана с Myr, по дозозависим начин. Тези данни показват, че GAS5 може да участва в ефекта на Myr върху ендотелните клетки. За да разберем механизмите, чрез които GAS5 може да се включи в защитния ефект на Myr, ние използвахме pcDNA-GAS5 за свръхекспресия на експресията на GAS5 в HUVECs. Експресията на GAS5 беше повишена от pcDNA-GAS5, която първоначално беше намалена от Myr в HUVECs, индуцирани от вол-LDL (фиг. 3B). По-нататъшни експерименти разкриват, че жизнеспособността на HUVEC клетките със свръхекспресия на GAS5 е значително намалена и апоптозата е значително повишена при лечението с Myr (Фиг. 3C и D). Освен това, свръхекспресията на GAS5 в HUVECs, третирани с ox-LDL, показва по-високо съдържание на ROS в сравнение със съответстващата контрола (Фиг. 3E). Тези данни предполагат, че регулирането на експресията на GAS5 отслабва защитните ефекти на Myr срещу HUVEC, медиирано от ox-LDL.

miR-29a-3p е цел на GAS5 в HUVEC.

Целевият GAS5 беше идентифициран чрез RegRNA 2.0 и star-Base, резултатите от търсенето бяха показани на Фиг. 4A. Сред тези miPHK, miR-29a-3p е най-значимото намаление в окс-LDL-медиирано HUVEC увреждане (фиг. 4B). Бяха проведени биоинформатични анализи, за да се предскажат регионите на свързване между GAS5 и miR-29a-3p (фиг.4C). За да се потвърди тази биоинформатична прогноза, анализите на двоен луциферазен репортерен ген показват, че GAS5-WI представя по-ниска луциферазна активност от съответната MUT група, потвърждавайки връзката на свързване на GAS5 и miR-29a-3p (Фиг. 4D). Междувременно, нивото на GAS5, обогатено с Ago2 RIP, беше по-високо в клетките, трансфектирани с miR-29a-3p, отколкото това в miR-NC групата (Фиг.4E). Междувременно анализът на FISH в клетките HUVEC показа, че GAS5 е локализиран съвместно с miR-29a-3p главно в ядрото (фиг. 4F). Тези открития предполагат, че GAS5, насочен към miR-29a-3p.

miR-29a-3p мимиките спасиха ефектите на GAS5 в HUVEC, индуциран от ox-LDL, лекуван с мирицетин.

Както е показано на Фиг. 5A, експресията на miR-29a-3p е значително повишена в ox-LDL плюс Myr плюс pcDNA-GAS5 плюс miR-29a-3 p мимическа група в сравнение с ox-LDL плюс Myr плюс pcDNA-GAS5 плюс мимическа контролна група (Фиг. 5А). Освен това, регулираният нагоре GAS5 значително повишава жизнеспособността на HUVECs, индуцирани от ox-LDL, третирани с Myr, докато котрансфекцията pcDNA-GAS5andmiR-29a-3p имитира в HUVECs премахва тези ефекти (фиг. 5B). В допълнение, производството на ROS и апоптозата в ox-LDL индуцира HUVECs, третирани с Myr след свръхекспресия на GAS5, докато miR-29a-3p имитира тези ефекти (фиг. 5C и D).

sh-GAS5 или miR-29a-3p мимиките могат да ускорят защитната роля на мирицетин в индуцираната от волски LDL HUVECs клетка.

За да се изследва дали GAS5 и miR-29a-3p са включени в Myr-медииран регулаторен механизъм, HUVECs бяха трансфектирани с NC, sh-GAS5 имитиращ контрол, miR-29a{{7} }p имитира. Експресията на GAS5 беше значително намалена в sh-GAS5 групата в сравнение с NC групата (Фигура 6А). След трансфекцията, ox-LDL плюс Myr повишава жизнеспособността в сравнение с групата на ox-LDL, а инхибирането на GAS5 или повишен miR-29a-3p повишава жизнеспособността на индуцирани от ox-LDL HUVECs, третирани от Myr (фиг.6B). В допълнение, Myr възпрепятства клетъчната апоптоза, причинена от ox-LDL, която впоследствие е променена от sh-GAS5 и miR-29a-3p мимики (Фигура 6C). Освен това нивото на протеин на CD31 и SM22a беше повишено

Мирицетин инактивира сигналния път на TLR4/NF-KB в HUVEC, третиран с ox-LDL, чрез понижаване на GAS5 или повишаване на miR-29a-3p. TLR4/NF-KB сигнализиращият път е тясно включен в процеса на AS. За да се изследва дали Myr потиска сигналния път на TLR4/NF-B, TLR4 и няколко основни протеини надолу по веригата, напр. p-p65, p65, p-IkBa, IkBa и TLR4, бяха идентифицирани в HUVEC клетки чрез Western blot анализ. Фигура 6 показва, че Myr регулира надолу експресията на p-p65, p-IkBa и TLR4 в сравнение с групата на ox-LDL, докато нивото на протеина на p-p65, p-IkBa. и TLR4 бяха намалени в групите, които имитират ox-LDL плюс Myr плюс sh-GAS5 и ox-LDL плюс Myr плюс miR-29a-3p в сравнение с групата ox-LDL плюс Myr (фиг.7) . Взети заедно, тези резултати предполагат, че GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB пътят може да бъде един от основните механизми, чрез които Myr намалява HUVEC клетъчното възпаление и EndMT. Дискусия

AS е персистиращо възпалително състояние, което започва от отлагането, както и от натрупването на липопротеини с ниска плътност в стената на артерията19. Въпреки огромния напредък както в основните, така и в научните изследвания, все още е сред водещите причини за смърт в света2. В това проучване изследвахме молекулярния механизъм на Myr върху индуцирано от ox-LDL увреждане на HUVECs, разкривайки решаващата роля на lncRNA GAS5 в това събитие. Нашите резултати предполагат, че Myr регулира жизнеспособността на клетките на HUVEC, ROS, апоптозата, възпалението и EndMT чрез пътя GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB, изяснявайки нов механизъм на Myr върху защита срещу AS.

Доказано е, че Ox-LDL индуцира повишено генериране на ROS, което играе критична роля в прогресирането на AS. Съществени доказателства сочат, че повишеният оксидативен стрес играе важна роля в патогенезата на васкуларната ендотелна дисфункция заедно с EndMT на ендотелните клетки, възпалението и апоптозата. Използвахме HUVECs, стимулирани от ox-LDL, за да симулираме появата на ранна атеросклероза и възпалителният отговор и EndMT на HUVECs бяха повишени, а Myr значително инхибира възпалителния отговор и EndMT към HUVECs, стимулирани с ox-LDL. Известно е, че Myr упражнява антиоксидантни цитопротективни ефекти в различни клетки, включително клетъчна линия HUVEC21. Предишно проучване установи, че Myr проявява про-пролиферативни и анти-апоптотични ефекти при LPS-индуцирано увреждане на кардиомиоцити H9c2 клетки2. В това изследователско проучване проверихме резултата от Myr върху версия на атеросклеротични клетки, индуцирани от волски LDL. Нашите резултати предполагат, че предварителната обработка с 5 μM Myr може значително да промени индуцираното от вол-LDL понижаване на клетъчната жизнеспособност в HUVEC. Нашите резултати показват, че терапията с ox-LDL може да рекламира възпалението и EndMT на HUVEC чрез регулиране на CD31, SM22a и възпалителни цитокини (IL-6, MCP-1, VCAM-1), които може да бъде обърнато чрез предварително третиране с Myr. Няколко елемента установяват, че възпалението и EndMT придружават атеросклерозата23. Предишно проучване установи, че инхибирането на експресията на VCAM-1 и ICAM-1 е признато за основна стратегия срещу атеросклероза24. Освен това, ваксината потиска индуцирания от вол-LDL ендотелен EndMT чрез регулиране надолу на ендотелния маркер CD31 и регулиране нагоре на мезенхимния маркер SM22a25. Нашите открития са в съществено съгласие с тези изследвания.

Експресията на GAS5 беше силно експресирана както в човешки, така и в животински модели 26, 27. В това проучване открихме, че GAS5 е регулиран нагоре, а miR-29a-3p е регулиран надолу при HUVEC увреждане, предизвикано от ox-LDL . Моето лечение може да обърне тези ефекти. Предишно проучване показа, че Mvr инхибира експресиите на HMGB1, TLR4 и MyD88 в невроните и възстановява увреждането на невроните и възпалението, причинени от активирането на NF-KB и MAPK сигналните пътища*8. В това проучване, повишена регулация на lncRNA GAS5 и понижаването на miR-29a-3p доведе до намаляване на клетъчната апоптоза, възпаление и EndMT, както и намаляване на активността на TLR4/NF-KB сигналния път. Според нашите открития, Myr намалява p-p65, p-IkBa и TLR4 в HUVECs чрез регулиране на GAS5/miR-29a-3p, намалявайки възпалителния отговор и EndMT при HUVECinjury, предизвикано от ox-LDL. И накрая, нашето изследователско проучване разкри, че Myr е в състояние да подобри клетъчната апоптоза, клетъчното възпаление и EndMT чрез пътя GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB (фиг.8), което предполага Myr като потенциален терапевтичен агент за AS. В допълнение, GAS5 беше предложено да бъде обещаваща целева молекула, включваща патофизиологичните процеси на AS.

Препратки

1. Kondapalli, L., Bottinor, W. & Lenneman, C. Като отпуснем спирачките с имунотерапия, ускоряваме ли атеросклерозата?.

Тираж 142 (24), 2312-2315(2020).

2. Libby, P.Ridker, PM& Hansson, GK Прогрес и предизвикателства при превода на биологията на атеросклерозата. Природа 473 (7347),

317-325 (2011).

3. Couto, NFet al. Промените на OxLDL в динамиката на мембраната на ендотелните клетки водят до промени в трафика на везикули и увеличават

чувствителност на клетките към увреждане.Biochim.Biophys.Acta Biomembranes 1862,183139 (2019).

4. Ямагата, К. Защитен ефект на епигалокатехин галат върху ендотелни нарушения при атеросклероза. J. Cardiovasc. Pharmacol.75,

292-298(2019).

5. Gao, S. & Liu, J. Асоциация между циркулиращия окислен липопротеин с ниска плътност и атеросклеротичното сърдечно-съдово заболяване.

Хронична дис. Превод Med. 3(2), 89-94 (2017).

6. Торису,К. et al. Необходима е интактна ендотелна аутофагия за поддържане на васкуларната липидна хомеостаза. Старееща клетка 15 (1), 187-191 (2016).

7. Пан, X. et al. Активиране на Nrf2/HO-1 сигнал с мирицетин за отслабване на разграждането на ЕСМ в човешки хондроцити и мелиориране на мишия остеоартрит. Вътр. Имунофармакол. 75,105742 (2019).

8.Li,M.et al. Мирицетинът потиска размножаването на хепатоцелуларен карцином чрез понижаваща експресия на YAP. Клетки 8(4),

358(2019).

9. Guo, C. et al. Мирицетинът подобрява предизвиканото от етанол натрупване на липиди в чернодробните клетки чрез намаляване на биосинтезата на мастни киселини. Mol

Nutr. Food Res. 63 (14), e1801393 (2019).