Комплекси нано млечен протеин-клей: Характеризиране и противораков ефект Част 2

За повече информация, свържете се сtina.xiang@wecistanche.com

Кликнете върху връзката, за да научите част 1:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049142.html

3. Материали и методи

3.1. Материали

Обвивката на Plantago ovata (подгол) и зреещият плод на Ziziphus Spina-Christi (Nabeq) са закупени от Гиза, Египет; млечен протеинов концентрат (MP, 81,3 процента протеин) е закупен от компания Fonterra (Окланд, Нова Зеландия). Казеинът и суроватъчните протеини в MPC са до голяма степен в естествената си и подобна мицеларна форма на тези, открити в млякото. Всички използвани химикали са с аналитична чистота.

3.2. Приготвяне на Isabgol Husk Mucilage (IHM) и Nabeg Mucilage (NabM)

Isabgol husk лепест (IHM) и Nabeq лепест (NabM) се приготвят съгласно метода, описан от El-Maksoud et al. [5]. Накратко, суспензия от isabgol husk се приготвя чрез разтваряне на 1,2 g в 100 mL дестилирана вода и се пречиства с ацетонов разтвор. Полученият гел се съхранява в хладилник (4-5 градуса), докато се използва.

За NabM узрелите плодове на Nabeq бяха старателно измити с чешмяна вода, за да се отстрани замърсяването. Пресните плодове се отделят от семената и се смесват с дестилирана вода в съотношение 1:10 (w/v), след като се нарязват на малки парченца. Сместа се смесва с помощта на лабораторен смесител (Toshiba Mixie, Япония) и се оставя да престои 12 часа в хладилник.

След това екстрактът от слуз се центрофугира при 2000 rpm в продължение на 30 минути и се филтрира през муселинова тъкан. Получената вискозна разтворима клей се утаява с ацетон. Получената сурова слуз се съхранява в хладилник до използване.

За аналитични цели лепестото вещество се изсушава във въздушна пещ при 40 градуса и се смила с помощта на топкова мелница MM400 (Retsch, Германия). Измерен е химичният състав на клей на прах от псилиум хуск (PHMP) и клей на прах от Nabeq (NabMP). Съдържанието на влага, протеини, мазнини, пепел, сурови фибри и общо съдържание на въглехидрати е 8,49, 0,34, 0,21, 2,13, 1,53 и 87,44 процента за PHMP и 9,18, 4,72, 2,05, 2,69, 1,70 и 78,26 процента за NabMP , съответно. Полученият прах се съхранява при хладна температура (4-5 градуса) до по-нататъшен анализ.

Кликнете, за да научите повече информация

3.3. Приготвяне на комплекси млечен протеин-клей (MPMC)

Комплексите на млечен протеин (MP) с IHM и NabM бяха получени съгласно Morr et al. с някои модификации [44]. Концентратът на млечен протеин се разтваря в дестилирана вода (10 процента). Полученият колоид на млечен протеин се смесва с IHM и NabM в съотношение 1:3 (o/o). рН на сместа се регулира до 1 0 и се оставя да престои 10 минути. След това рН се понижава до 3.5 с помощта на 0.1 N НС1 и се оставя за още 10 минути. След това рН се коригира до рН 4,6 с помощта на 0,5 М NaOH за събиране на МРМС чрез филтруване върху филтърна хартия: МР, както и получената МРМС, се сушат чрез лиофилизация при -45 градуса С в продължение на 24 часа, като се използва лиофилизатор Novalyphe-NL500 , Savant Instruments, Холбрук, Ню Йорк, САЩ.

3.4. Физикохимични и функционални характеристики

3.4.1. Измерване на pH

рН на получените продукти при 10% разтвор се измерва с помощта на калибриран рН метър (HANNA, HI 902 m, Германия).

3.4.2. Определяне на насипна плътност (BD), плътност при натискане (TD) и индекс на Кар

MPMC прах се изсипва в 50 mL мерителен цилиндър до 25 mL, съответстващ на неизползвания обем, и след това се потупва 5-10 пъти, докато не се забележи по-нататъшна промяна в обема на праха, съответстваща на източения обем.

Обемната плътност, плътността при натискане и индексът на Кар бяха определени чрез прилагане на следните уравнения [45]:

(1)BD=маса/ неизползван обем

(2)TD=маса/отведен обем

(3)Индекс на Кар (проценти)= (TD-BD)/TD×100

3.4.3. Индекс на абсорбция на вода (WAI) и индекс на разтворимост във вода (WSD)

Водоразтворимостта и показателите за водопоглъщане на MP и MPMC бяха изследвани съгласно метода, описан от Yagc и Gogus с някои модификации [46]. Пробите (0.5 g) се диспергират в 10 mL дестилирана вода при 25 градуса в центрофужна епруветка. След престой в продължение на 30 минути, с обръщане на епруветката на всеки 5 минути, пробите се центрофугират при 3500 rpm за 15 минути. Филтратът се прехвърля върху алуминиева плоча и се суши в продължение на 3 часа при 105 градуса. Теглото на останалия гел се записва и WSI и WAI се определят, както следва:

(4)WAI(g/g)= Увеличаване на теглото на гела/сухо тегло на пробата

(5)WSI процент=Тегло на сухите твърди вещества в супернатанта ×100/Сухо тегло на пробата

3.4.4. Смилаемост на млечен протеин

Смилаемостта на протеина се определя съгласно Abd El-Ghany et al. [47]. Накратко, МР и МРМС пробите се диспергират в дестилирана вода при концентрация от 6,38 mg/mL и рН се коригира до 8.0. Един милилитър прясно приготвен изходен разтвор на ензим (1,6 mg/mL трипсин, 3,1 mg/mL химотрипсин и 1,3 mg/mL ER аминопептидаза1

(ERAP1) се смесва с протеинова суспензия при 37 градуса. рН се записва след 10 минути и се определя ензимната активност, като се използва казеин като еталон. Следното уравнение беше използвано за изчисляване на смилаемостта на протеина [47]:

(6) процент смилаемост=210.46-18.10 (pH)

3.5.Фенолни фракции на PHM и NabM

Фенолни съединения на проби от слуз, използвайки HPLC анализ, се провеждат по протокола, описан от Elsayed et al. [48]. Накратко, екстрактът от слуз се анализира с помощта на Agilent 1260 серия HPLC система (Agilent Technologies Inc., Санта Клара, Калифорния, САЩ). Разделянето се извършва с помощта на колона С18 (100 mm × 4.6 mm id, 5 um). Подвижната фаза съдържа (A) вода 0.2 процента H3PO4, (B) метанол и (C) ацетонитрил при скорост на потока от 0.6 mL/min. Градиентното елуиране беше съгласно следната схема: 0-11 min (96 процента A., 2 процента B);11-13 min (50 процента A, 25 процента B);13-17min (40 процент A, 30 процента B);17-20.5 минути (50 процента B, 50 процента C);и 20.5-30 минути (96 процента A, 2 процента B). Дължината на вълната на детекция (UV детектор, 284 nm) беше настроен на 284 nm. Размерът на инжекцията е 20 μL и температурата на колоната се поддържа при 30 градуса. Съединенията са известни чрез сравняване на тяхното време на задържане с тези от автентични стандарти. Калибрационните криви бяха използвани за оценка на количествата на съединението.

3.6. Общо фенолно и флавоноидно съдържание на MP и MPMC

Съдържанието на полифеноли се определя по метода на Folin-Ciocalteu с някои модификации [5]. Накратко, 2,8 mL milli-Qwater, съдържаща 1 0 mg MP или MPMC, се смесват с 2 mL 2 процента натриев карбонат и 0,1 mL 50 процента реагент на Folin-Ciocalteau. След 30 минути инкубиране при стайна температура, абсорбцията на реакционната смес се измерва при 750 nm спрямо дейонизирана вода като празна проба, като се използва спектрофотометър (Hitachi, модел 100-20). Галовата киселина (GA) се използва като стандартно фенолно съединение и се конструира седемточкова стандартна крива (0-200 mg/L). Резултатите бяха изразени като милиграм еквиваленти на галова киселина на грам протеин (GAE/g).

Флавоноидисъдържанието се определя с помощта на метода на алуминиев хлорид, както е описано по-рано от Abedelmaksoud et al. с някои модификации [5]. Накратко, 2,8 mL milli-Q вода, съдържаща 1 0 mg MP или MPMC, се смесва с 0.1 mL 10 процента алуминиев хлорид хексахидрат и 0,1 mL 1 М калиев ацетат. След инкубиране при стайна температура в продължение на 40 минути, абсорбцията на реакционната смес се измерва при 415 nm срещу дейонизирана вода като празна проба. Кверцетинът се използва като стандарт, като се използва стандартна крива със седем точки (0-50 mg/L). Общото съдържание на флавоноиди се изразява като милиграм еквиваленти на кверцетин (QE/g).

3.7. Антиоксидантна активност на MP и MPMC

Общият капацитет за улавяне на свободните радикали на MP и MPMC беше оценен с помощта на три различни антиоксидантни анализа: стабилен 2, 2-дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH), азино-бис(3-етилбензотиазолин{{5 }}сулфонова киселина (ABTS) и хидроксилни радикали (HS) радикали, както е описано по-рано от El-Maksoud et al. [5].

3.8. Аминокиселинен профил на MP и MPMC

Протеиновите проби бяха киселинно хидролизирани при използване на 6 N НС1 съгласно Peksa et al. [49. За определяне на аминокиселините беше използван автоматизиран анализатор на аминокиселини (AAA 400, INGOs Ltd.).

3.9. Реологични свойства

Пробите бяха приготвени, както е описано от Barnes [50] с някои модификации. Вискозитетът на 2,5 процента (w/w) разтвор при pH7 се определя при 25±1 градуса с помощта на вискозиметър Brookfield（DV-II plus Pro, Rheocalc Software, Германия）. Напрежението （σ） и вискозитетът （n） бяха нанесени като функция на скоростта на срязване. Индексът на съгласуваност (K) и индексът на поведение на потока (n) на модела на степенния закон бяха изчислени:

Стойността на n е равна на 1 за нютонови течности и варира от 0 до 1 за течности, които са изтъняващи при срязване, и по-голяма от 1 за течности, които се сгъстяват при срязване [51].

3.10. Диференциална сканираща калориметрия (DSC)

Термичните свойства на MP и MPMC бяха измерени с помощта на диференциален сканиращ калориметър (PerkinElmer, САЩ). Пробите (4-6 mg) бяха поставени в алуминиева плоча и запечатани. След това всяка тава се нагрява до 350 градуса с поток от сух азотен газ при 20 mL min-I при скорост на нагряване от 10 градуса min-1. От ендотермичния пик на DSC термограмата бяха оценени началната температура на денатурация, максималната температура на преход и точката на разграждане [52]. Стойността на енталпията на прехода (AH) от областта под ендотермичния пик в DSC кривата беше определена и празният алуминиев съд беше използван като еталон.

3.11. Инфрачервена спектроскопия с преобразуване на Фурие (FTIR)

Инфрачервените спектри между 600 и 3500 cm-I бяха измерени при 25 градуса с помощта на FTIR спектрофотометър (QFA Flex, САЩ) чрез метода на отслабено пълно отражение, използвайки разделителна способност от 4 cm-I и придобиване на 10 сканирания в секунда.

3.12. Трансмисионна електронна микроскопия

Микроструктурата на MP и MPMC се визуализира с помощта на трансмисионен електронен микроскоп (JEOL, JEM 1400 Flash, Япония) при 80 kV. Приложен е криоетапът в метода на негативно оцветяване [53].

3.13.Биологични изследвания на MP и MPMC

3.13.1. Противоракова активност in vitro

Всички клетъчни линии, използвани в този експеримент, са получени от American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). В този анализ бяха използвани две човешки ракови клетъчни линии: аденокарцином на млечната жлеза (MCF{{0}}, ATCCHTB-22TM) и хепатоцелуларен карцином (HepG2, ATCC4 HB-8065TM). Неракови кожни фибробласти BJ-1(ATCC⑧ CRL-2522TM) и клетъчни линии от епителни гърди MCF-12F(ATCC CRL-10782TM) също бяха тествани за сравнение. Клетъчните линии се отглеждат в модифицирана на Dulbecco среда на Eagle (DMEM/висока глюкоза, HyCloneTM, САЩ), допълнена с 10 процента фетален говежди серум (FBS, Gibco, Бразилия), 100 U/mL пеницилин, 100 ug/mL стрептомицин и 25 ng/ mL амфотерицин B (Sigma, Oakville, ON, Канада) и се култивира при 37 градуса с 5 процента CO в овлажнен инкубатор. Хранителната среда се заменя всеки ден със свежа среда. Когато клетките достигнат 70 процента конфлуентност, те се отделят с помощта на 0,25 процента трипсин-EDTA(1X) Gibco, Канада, и се прехвърлят в нова колба за култура. След втория пасаж, клетките се трипсинизират и се поставят в 96-плака с ямки при концентрация от 2 × 10* клетки/ямка. След 24 часа инкубация, средата се декантира и клетките се промиват два пъти с PBS, след което се третират с 200 μL културална среда, съдържаща различни концентрации на протеинови проби (1, 5, 10 и 20 ug/mL). Доксорубицин НС1 (4 ug/mL) се използва като положителна контрола, докато клетките, третирани със среда без добавки, се вземат като отрицателна контрола. Плаките се инкубират при 37 градуса С в продължение на 24 часа ипротивораковиактивността на пробите се определя с помощта на анализ на поглъщане на неутрално червено съгласно Repetto et al. [54]. Накратко, след инкубационния период, средата се заменя със 150 uL неутрално червено багрило (100 mg/mL), разтворено в среда без серум, и клетките се инкубират при 37 градуса С в продължение на 3 часа. След това клетките се промиват с PBS и се добавят 150 μL елуираща среда （EtOH/AcCOOH, 50∶1）, последвано от леко разклащане в продължение на 10 минути, за да се осигури пълно разтваряне. Абсорбцията се измерва при 540 nm с помощта на четец на микротитърни плаки (BioTek, 96 ямкови плаки, ELX808, САЩ).

където Ac е абсорбцията на контролата и As е абсорбцията на пробата. Процентната клетъчна смърт, представена като цитотоксичност (проценти), и концентрацията, която убива 50 процента от клетките (IC50), се изчисляват за всяка проба.

3.13.2. Определяне на нивото на протеините p53, Bax, Caspase-3 и Bcl-2

Клетъчните нива на ключови протеинови маркери на апоптоза се определят след 24 часа след третиране с ICso на MP и MPMC. Накратко, Hep G-2, MCF-7, Bj-1 и MCF-12F клетки бяха посяти при 5 × 10* клетки/ямка в 6-ямка чинии. След 24 часа инкубиране с пробите при 37 градуса, клетките бяха събрани и лизирани, след което центрофугирани при 10,000rpm за 20 минути при 4 градуса. Концентрацията на протеин се определя количествено в супернатантата чрез анализ на Брадфорд [55]. Активността на каспаза-3 се анализира с помощта на комплект за колориметричен анализ (Abcam, ab39401) в съответствие с инструкциите на производителя [56]. Накратко, 10 mg протеин се добавят към 50 uL субстрат на Caspase и крайният обем се регулира до 200 μL с помощта на реакционния буфер при 37 градуса и сместа се инкубира за 1 час на тъмно, последвано от измерване на Caspase{{24} } концентрация при 405 nm.

Нивото на проапоптотичния маркер p53, свързан с X(Bax) и антиапоптотичния маркер В-клетъчен лимфом-2(Bcl-2) бяха определени в клетъчен лизат с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ Simple Step ELISA съгласно инструкциите на производителя (ab207225, ab119506 и ab199080; Abcam, САЩ), съответно [57,58].

3.13.3. Увреждане на ДНК, предизвикано от защита от оксидативен стрес

Анализът на увреждане на ДНК се провежда, както е описано по-рано от Leba et al. [59] с лека модификация. Накратко, 3 μL рибонуклеазен инхибиторен плазмид RNH1（NM_203387）Human Tagged ORF Clone 10 ug/μL се смесват с реагент на Fenton（5 mM H2O2 и 0.3 mM FeSO4 и 0,6 mM EDTA） и крайният обем се регулира до 25 μL с помощта на фосфатен буфер (H2POA, 8,3 mM, рН 7,4). След това разтворът се инкубира в продължение на 20 минути при 37 градуса. За да се оцени антиоксидантната защитна способност на MP и MPMC срещу увреждане на ДНК, предизвикано от реагента на Fenton, 5 ug/mL MP/NabM, MP/IHM и MP бяха добавени преди инкубацията. RNH1 плазмидна ДНК（3 μL, 10 ug/μL） се използва като контрола за защита на ДНК.

3.13.4. Тест за увреждане на геномна ДНК на базата на PCR

Генът на метилентетрахидрофолат редуктазата (MTHFR) на Homo sapiens беше амплифициран с помощта на PCR от геномна кръв, предварително извлечена от здрави кръвни проби, използвайки стандартен комплект за екстракция на ДНК [60]. ДНК се инкубира в продължение на 10 минути със или без реагент на Fenton, допълнен с MP или MPMC. 198-bp фрагмент беше амплифициран с помощта на предни 5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3' и обратни 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'праймери. Използвайки 50 ng третирана ДНК, PCR амплификацията беше извършена след следващия термоциклер (94 градуса за 5 минути, последван от 25 цикъла на денатурация, 30-те при 94 градуса; отгряване, 30-те при 60 градуса; и удължаване, 30 s при 72 градуса) за 25 цикъла и 1 последен цикъл на удължаване при 72 градуса за 5 минути. Пробите от PCR реакцията се прилагат за електрофореза в агарозен гел (2 процента).

3.13.5. Профилиране на генна експресия чрез RT-qPCR

Анализи на генна експресия на ключови про- и антиапоптотични маркерни гени бяха проведени с HepG-2, MCF-7, Bj-1 и MCF-12F клетки, изложени на получени IC50 данни (Таблица 3) за 72 часа. Накратко, общата РНК се екстрахира с помощта на комплекта за пречистване на обща РНК (QIAGEN., Thorold, ON, Канада) съгласно инструкциите на производителя. cDNA

синтезът се провежда, както е описано по-рано от Aboul-Sound et al. [61]. Програмите за амплификация и специфичността на PCR ампликона бяха извършени и оценени чрез използване на термоциклер Rotor-Gene O 5-Plex HRM (Qiagen, Германия) с Quanti-Tect SYBR-Green PCR Kit (Qiagen, Германия), както е документирано по-рано следвайки стандартните протоколи [61]. Използвани са следните праймери: Hs_P53_1 SG QuantiTect Primer Assay (QT00060235); Hs_CASP3_1_SG Quan-tiTect Primer Assay (QT00023947); В-клетъчен лимфом 2 Hs_BCL2_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00025011);Bcl-2-подобен протеин Hs_BAX_1_SG QuantiTect Primer Assay ( QT00031192); и 18S rDNA house-keeping (HK) ген Hs_RRN18S_1_SGQuantiTect Primer Assay (QT00199367). Програмата за термичен цикъл на PCR и анализът на генната експресия за определяне на промяната на гънките по отношение на 18S гена бяха извършени по същество, както беше докладвано по-рано [61].

3.14. Статистически анализ

Получените резултати бяха изразени като средно ± стандартно отклонение. Статистическите данни бяха получени с помощта на SPSSsoftware 11.5 (SPSS, Inc.Chicago, IL, USA). Тестът на Дънкан с множество обхвати беше използван за определяне на значителните разлики между всички проби и разликите бяха счетени за значими при p<>

4. Изводи

В заключение, това проучване разкрива, че смесването на млечен протеин сполизахаридичрез диференциране на рН на разтвора е подходяща техника за комплексообразуване. Получените слузни комплекси на млечен протеин (MPMC) имат значително по-високи фенолни ифлавоноидисъдържание от млечния протеин (MP). Резултатите от DSC показват, че комплексообразуването на MP с полизахариди значително повишава термичната стабилност с промяна в температурата на денатурация. Извършени са FTIR анализи за идентифициране на функционалните групи и е изследвано поведението на потока на приготвените комплекси. WSI и WAI на млечен протеин бяха увеличени чрез комплексообразуване с NabM или IHM. TEM се използва за визуализиране на микроструктурата на приготвените комплекси. От друга страна, получените млечни протеинови комплекси с isabgol husk mucilage (HM) или Nabeq mucilage (NabM) се очаква да надминат нативните млечни протеини по отношение на антиоксидантния и противораков ефект. В обобщение, MPMC изразява уникални противоракови свойства срещу модел на рак на гърдата и клетъчни линии на чернодробен карцином (съответно MCF7 и HEPG2), както е доказано чрез анализ на неутрално червено поемане.

MPMC подобри и дветеантиоксиданти антипроферативна дейност. Каспазите са ключови регулаторни протеини, които са замесени в индукцията на апоптоза. Повишената регулация на каспаза 3 протеин и иРНК транскрипти (Фигура 9A, B) контролира други протеини в пътя на апоптозата, която се характеризира с колапс на митохондриалната мембрана с Bax-индуцирано освобождаване на цитохром с и активиране на каспаза 9, което води до последващо ангажиране на каспаза 3. Повишаването на Casp3, p53 и Bax, заедно с намаляването на експресията на Bcl-2, разкри, че MPMC индуцира индукция на апоптоза, където регулирането нагоре на p53 ще стимулира експресията на Bax, което от своя страна ще индуцира цитохром c освобождаване, последвано от активиране на caspase-9 и -3. Освен това е известно, че Bcl-2 инхибира освобождаването на цитохром c. В нашето проучване беше показано, че индуцираното от MPMC регулиране надолу на Bcl-2 улеснява безпротиворечивото Bax-индуцирано освобождаване на цитохром c и последваща апоптоза.

Противораковият ефект на протеин-полизахаридните комплекси осигурява допълнително просветление относно приложимостта на тези комплекси за използване при разработването на достъпни и ефективни терапии за рак с минимални странични ефекти.