Nanozyme Hydrogel за подобрено генериране на алкилови радикали и мощна антитуморна терапия†

Алкилови радикали (Rc), които не разчитат на генерирането на кислород за причиняванеклетъчен стрес, са приложени влечение на тумори, но голямо количество глутатион (GSH) в туморните клетки реагира с алкилови радикали, като по този начиннамаляване на антитуморния им ефект. В това изследване, подобрена система за генериране на алкилови радикали, реагираща наблизка инфрачервена светлинае проектиран. Алкиловият радикал задейства 2,20 -азобис[2-(2-имидазолин-2-ил) пропан]-дихидрохлорид (AIPH) и ензимът пирит (FeS2) бяха капсулирани в агарозен хидрогел за получаване на AIPH–ФеС2–хидрогелна (AFH) система. FeS2 може да се използва като фототермичен агент за преобразуване на близката инфрачервена светлинна енергия в топлинна енергия, което води до разтваряне на хидрогела. AIPH едновременно се индуцира да произвежда алкилови радикали. FeS2 може да се използва и катоусилвател на оксидативен стресза намаляване на вътреклетъчното съдържание на GSH, като по този начин повишава терапевтичния ефект на алкиловите радикали. В крайна сметка независимите от кислорода свободни радикали, генерирани от системата AFH при близко инфрачервено лазерно облъчване и фототермично третиране, могатубиват раковите клеткичрез синергичнотоокисление/фототермичен ефект. Системата AFH, разработена тук, предоставя нови прозрения за подобряване на терапевтичния ефект на алкиловите радикали.

НАТИСНЕТЕ ТУК, ЗА ДА РАЗУМЕТЕ КАК CISTANCHE ПРОТИВОРАКОВИ

Въведение

През последните години базираните на свободни радикали лечения като фотодинамична терапия, така че нединамичната терапия и електродинамичната терапия се превърнаха в популярен избор за лечение на рак на гърдата.1-3 Външни стимули (лазер, ултразвук, електрически полета) насърчават производството на на реактивни кислородни видове (ROS), които индуцират клетъчна смърт чрез причиняване на тежко оксидативно увреждане или дисфункция на клетъчния метаболизъм.4-6 За съжаление, хипоксичната туморна среда и бързата пролиферация на туморни клетки намаляват терапевтичните резултати от такива лечения, които разчитат на производството на ROS, особено при лечението на солидни тумори.7–10 Алкилните радикали са нов тип свободни радикали, които не зависят от генерирането на кислород, за да убиват клетките и са показали, че са ефективни при лечението на тумори в нормоксична и хипоксична среда.11 Освободеният алкил радикалите могат да индуцират апоптоза на ракови клетки чрез увеличаване на оксидативния стрес, което води до увреждане на клетъчните липиди и ДНК. Като типичен инициатор на свободни радикали, 2,20 -азобис[2-(2-имидазолин-2-ил)пропан]-дихидрохлорид (AIPH) може да генерира алкилови радикали при високи температури. 12 Прави го дори при липса на кислород. Генерираните свободни радикали са токсични за клетките и незабавно ще окислят клетъчните елементи или ще взаимодействат с кислорода, за да произведат вторични токсични вещества.13 Дори в хипоксична туморна микросреда, AIPH може да произведе алкилови радикали, за да увеличи вътреклетъчния липиден хидропероксид и допълнително да предизвика апоптоза на туморни клетки.14 Всичко това показва, че Rc е обещаващо лекарство за лечение на рак.

Светлината или топлината се използват като външен стимул при фототермалната терапия.15–17 Фототермалната терапия (PTT), базирана на близко инфрачервено (NIR) лазерно облъчване, се използва за предотвратяване на агрегацията на туморни клетки; той разчита на локални топлинни ефекти за отстраняване на туморите. Няколко фототермични агента (PTAs), като златни нанокристали и молибденов дисулфид, се използват в комбинация с AIPH за освобождаване на алкилови радикали в отговор на инфрачервено лазерно облъчване.19,21-23 Въпреки това , туморната микросреда (TME) обикновено има високо ниво на експресия на глутатион (GSH) в солидни тумори, тъй като GSH играе важна роля в устойчивостта на лъчетерапията чрез спонтанна реакция или реакция, катализирана от GSH S трансфераза с ксеногенни.24,25 В допълнение, като редуциращ агент, GSH може директно да отстрани алкиловите радикали.21,26 Това намалява ефективността на терапиите, базирани на алкилови радикали. Наноензимът пирит (FeS2), като нов фототермичен наноматериал, не само има добър фототермичен ефект при NIR светлина, но също така има наноензимна активност.27 FeS2 наназата демонстрира подобна активност на глутатион оксидазата (GSH OXD), окислявайки GSH до окислен глутатион (GSSG).28 В TME беше установено, че изчерпването на GSH нарушава REDOX баланса на клетките и причинява оксидативен стрес.29 Следователно се очаква FeS2 да постигне добър синергичен ефект с AIPH.

Минимално инвазивните фоточувствителни хидрогелове напоследък станаха популярни като платформа за контролирано освобождаване на лекарства.30-32 Хидрогеловете коагулират, когато се инжектират в туморната тъкан и служат като дългосрочно депо.33 Тази локална форма на приложение може да се повтори след еднократно инжекция. В допълнение, параметри като лазерна мощност и време на облъчване могат да бъдат модифицирани, за да се промени скоростта на освобождаване на лекарството, като по този начин се разшири приложимостта на този метод на лечение.34,35 Като се имат предвид тези предимства, се предполага, че използването на хидрогелове за доставяне на FeS2 и AIPH към TME биха подобрили ефикасността на базираните на свободни радикали терапии.

В това проучване е проектиран метод, използващ интратуморно доставяне на инжекционен хидрогел, съдържащ FeS2 ензим и инициатора на свободните радикали AIPH. Първо се приготвя хибридна система от AIPH-FeS2-хидрогел (AFH) чрез зареждане на наночастици FeS2 и AIPH в агарозен хидрогел. Хидрогелът е твърд при стайна температура и FeS2 и AIPH са капсулирани в неговата матрица. Веднъж облъчен от близка инфрачервена (NIR) светлина, FeS2 преобразува NIR светлинната енергия в топлинна енергия, което кара системата AFH да се нагрява и след това хидрогелът се топи и освобождава FeS2 и AIPH. При високи температури AIPH се разлага, за да се получат алкилови радикали. Впоследствие ензимът FeS2, който имитира активността на GSH-OXD, намалява вътреклетъчното съдържание на GSH. Разрушаването на GSH ще насърчи убиващия ефект на алкиловите радикали. Тъй като AFH може да остане на мястото на тумора за дълго време, системата AFH може да позволи прецизен контрол върху освобождаването на алкилови радикали чрез промяна на интензитета на лазера и времето на излъчване. И накрая, свободните радикали, независими от кислорода, генерирани от системата AFH при NIR облъчване и фототермално третиране, могат синергично да убиват раковите клетки чрез синергичния окислителен/фототермален ефект и туморният растеж по време на цикъла на лечение е добре обитаван. Накратко, системата AFH, проектирана тук, допълнително усилва терапевтичния ефект на AIPH чрез промяна на редокс хомеостазата (Схема 1).

Резултати и дискусия

Използва се агарозен хидрогел с ниска точка на топене за получаване на композитен хидрогел, съдържащ FeS2 и AIPH. FeS2 се смесва с воден разтвор на агароза при 60 C и след това се зарежда с тригера на алкиловия радикал AIPH, последвано от бързо охлаждане до стайна температура. Така се формира матрицата на хидрогела AFH. Трансмисионна електронна микроскопия беше използвана за характеризиране на морфологията на FeS2 (фиг. 1A). Нанозимът FeS2 показа сферична морфология със среден размер на частиците около 148 nm (фиг. S1†). UV-vis абсорбционните спектри на FeS2 (фиг. 1B) показват, че FeS2 е силно абсорбиран в NIR обхвата при 808 nm. Това свойство прави FeS2 добър PTA. Фототермичната производителност на ензима FeS2 при различни концентрации (0, 25, 50 и 100 mg mL 1 ) беше изследвана чрез облъчване на разтвора с 0,5 W cm 2 808 nm лазерна система (фиг. 1C). Нагряващият ефект на разтвора е право пропорционален на концентрацията на FeS2. Температурата на 100 mg mL 1 FeS2 разтвор се повишава с около 17,5 C само за 5 минути лазерно облъчване, демонстрирайки добрата фототермична производителност на FeS2. Сканиращата електронна микроскопия също показа, че AFH хидрогелът има сложна мрежа от структура на порите и разпределение на размера на порите (фиг. 1D), което прави хидрогела подходящ за зареждане с лекарство за доставка. Фототермичната стабилност също е важен критерий за оценка на качеството на PTA.36 Разтвор от 200 mg mL 1 FeS2 се нагрява с 808 nm NIR лазер за 5 минути, след което лазерът се изключва и разтворът на FeS2 се оставя да се охлади естествено до стайна температура. Този процес се повтаря няколко пъти, за да се оцени фототермичната стабилност на FeS2 (фиг. 1E). Няма очевидна промяна в кривата на нагряване на всеки фототермичен цикъл и се наблюдава само лека разлика в пиковата температура, постигната след 5 минути облъчване, потвърждавайки фототермичната стабилност на FeS2. Реологичният анализ също разкри висок модул на съхранение на приготвения хидрогел в твърдо състояние при стайна температура (фиг. 1F). С повишаването на температурата хидрогелът постепенно се разгражда и разтваря, а модулът за съхранение постепенно намалява. След това беше проведен експеримент с фототермично разтваряне на FeS2 хидрогел. Втвърденият AFH (FeS2, съдържащ се в хидрогела) се поставя в стъклен съд, съдържащ дейонизирана вода. При стайна температура приготвеният AFH хидрогел поддържа втвърдената си форма, но след 10 минути облъчване с 808 nm лазер, хидрогелът почти напълно се разтваря и наноматериалът FeS2 се освобождава и се разтваря във водата в стъклената чиния (фиг. 1G). Термичен инфрачервен фотоапарат също потвърди значителното повишаване на температурата на AFH по време на облъчването (фиг. 1H). Спектърът на рентгенова фотоелектронна спектроскопия (XPS) на FeS2 след реакция с хидрогел показа, че FeS2 съдържа Fe и S елементи (фиг. S2†). Както е показано на Фиг. S3,† съдържанието на GSH е значително намалено след съвместната инкубация на FeS2 и GSH, то има положителна корелационна крива с времето и концентрацията. Освен това POD-подобната активност на FeS2 зависи от размера. Нанозимите с размер 150 nm показват по-висока активност от тези с размери 280 и 687 nm (фиг. S4†).

Въз основа на високоефективните характеристики на AFH бяха оценени неговите антитуморни ефекти. Първоначално комплектът за оцветяване на живи/мъртви клетки с флуоресцеин диацетат/пропидиев йодид беше използван за изследване на убиващия ефект на подготвения AFH хидрогел, комбиниран с NIR облъчване. PBS плюс NIR групата и групата само с AFH показаха силна зелена флуоресценция, докато AIPH почти не показа никакъв убиващ ефект (фиг. 2A). Приготвихме хидрогел, съдържащ само FeS2 (FH), за да проверим резултатите от относителните експерименти. Приготвеният хидрогел, съдържащ само FeS2 (FH), комбиниран с NIR, има умерен ефект на убиване. Трябва да се отбележи, че лечението с AFH плюс NIR има най-добър цитотоксичен ефект.

Пробата дихлорофлуоресцеин диацетат се използва за откриване на способността на AIPH да произвежда ROS. AIPH показа по-слаба способност да индуцира ROS в отсъствието на лазерно облъчване, докато FH, зареден с FeS2, показа умерена степен на производство на ROS след NIR облъчване (фиг. 2B). Яркозелената флуоресценция, наблюдавана в групата за лечение с AFH плюс NIR, може да се дължи на освобождаването на FeS2 и AIPH след лазерно облъчване (фиг. 2C). Освен това, групите от AIPH и AIPH плюс NIR показват много малко зелена флуоресценция (фиг. S5†). Анализът CCK-8 също показа същите резултати. Клетъчната жизнеспособност на групата AFH плюс NIR беше около 8,5 процента, което беше значително различно от това на другите групи (фиг. 2D). Високата температура ще насърчи разлагането на AIPH за получаване на алкилови радикали. В същото време FeS2 може да упражнява GSH-OXD активност за намаляване на вътреклетъчния GSH. GSH, като повсеместен тиол-съдържащ трипептид, се синтезира от съставните му аминокиселини (глутаминова киселина, цистеин и глицин) в много клетки. GSH се произвежда изобилно в различни видове ракови клетки. GSH в клетките обикновено съществува в редуцирана форма, която може да реагира с окисляващи вещества като алкилови групи, докато се окислява до своята окислена форма глутатион дисулд (GSSG), като по този начин намалява антитуморния ефект, базиран на свободните радикали.37 Изчерпването на GSH ще наруши редокс баланса на клетките, ще причини оксидативен стрес и в крайна сметка ще доведе до клетъчна апоптоза.38 Реагентът на Ellman е използван за тестване на способността на всяка група да изчерпва GSH. AFH комбинираната NIR група показа най-добрата способност за изчерпване на GSH (фиг. 2E).

Схема 1 Нанозимен хидрогел за повишено генериране на алкилови радикали и мощна антитуморна терапия

Фигура 1 (A) TEM изображение на FeS2. (B) UV-Vis-NIR абсорбционен спектър на разтвор на FeS2. (C) Криви на нагряване за различните концентрации на разтвори на наночастици FeS2 при лазерно облъчване при 808 nm (0.5 W cm 2 ) за 5 минути. (D) SEM изображение на хидрогела. (E) Температурна промяна на разтвор на FeS2 при циклично лазерно облъчване. (F) Реологични и температурни криви (съответно червени и черни) за подготвения AFH в отговор на 0.5 W cm 2 808 nm лазерно облъчване. (G) Морфологията на подготвения AFH преди и след 0,5 W cm 2 808 nm лазерно облъчване за 10 минути и (H) инфрачервени топлинни изображения на приготвения AFH след облъчване.

С оглед на доброто му in vitro представяне като PTA и GSH OXD-мимитиращ ензим, ефектът на AFH върху преобразуването на NIR светлина към топлина е изследван in vivo. BALB/c мишки бяха инжектирани подкожно с 4T1 клетки за образуване на тумори. Фиг. 3A показва кривата на промяна на температурата на PBS групата и AFH групата след 808 nm NIR лазер 0,5 W cm 2 облъчване за 10 минути. Температурата на AFH групата се повиши с около 17,6 C след облъчването, докато температурата на PBS групата почти не се повиши. Високата температура може да промени влажността на мембраната на туморната клетка, като по този начин увеличи пропускливостта на клетъчната мембрана, което от своя страна причинява термично увреждане на протеините.39,40 В крайна сметка раковите клетки губят способността си да пролиферират. След това, AFH-медиираната антитуморна активност беше оценена в 4T1 мишки, носещи тумор. Мишките, носещи тумор, бяха разделени на случаен принцип в пет групи. Обемът на тумора на мишки в групата PBS плюс NIR и групата AIPH нараства бързо по време на двуседмичния период на лечение, а групата AFH показва лек ефект на туморно потискане (фиг. 3C). Това е така, защото агарозата се метаболизира бавно и някои лекарства се освобождават бавно. Групата AFH плюс NIR има най-силен ефект върху туморния растеж. По време на лечението обемът на тумора на мишките беше значително потиснат. След периода на лечение, мишките бяха умъртвени и туморите бяха изолирани и претеглени. Резултатите за теглото на тумора съответстват на резултатите за обема на тумора (фиг. 3D).

Важно е, че по време на цялото проучване не са наблюдавани промени в телесното тегло в групата на лечение, което показва, че лечението не е причинило значителна системна токсичност за мишките (фиг. S6†). Този резултат е много обнадеждаващ, тъй като въпреки че много материали показват добри експериментални резултати, те също причиняват сериозни странични ефекти, които сериозно възпрепятстват клиничните им перспективи.41,42 20,70 - Дихлороресцин диацетат е използван за измерване на интра -туморно генериране на ROS в третираните мишки. Оцветяването беше значително подобрено в туморите, подложени на комбинирана терапия на AFH плюс NIR (фиг. 3E). Повишеното производство на свободни радикали води до засилен терапевтичен ефект при животинския модел. Анализите на оцветяване с TUNEL и Ki-67 бяха използвани за проверка на клетъчната апоптоза и пролиферация (фиг. 3E). Туморните тъкани в групата AFH плюс NIR бяха масово некротични без значителна пролиферация.

Фиг. 3 (A) Инфрачервени топлинни изображения на тумори след облъчване с 808 nm лазер (0.5 W cm 2 ) за 10 min в посочените групи за лечение. (B) Повишаване на температурата при мишки, имплантирани с 4T1 тумори след 808 nm лазерно облъчване (0,5 W cm 2 ) за 10 минути в посочените групи за лечение. (C) Обемът на тумора се променя с течение на времето в групите, третирани както е посочено. (D) Средни стойности на теглото на тумора, свързани с посочените лечения. (E) ROS, Ki-67 и TUNEL оцветени туморни срезове от посочените групи за лечение. **P <0,01, ***P <0,005; t-тест на Стюдънт.

След лечението жизненоважните органи (сърце, черен дроб, далак, бял дроб и бъбрек) нямат възпаление или увреждане. Индексите на черния дроб и бъбреците са нормални (фиг. 4A–D и S7†). Изчерпателни in vivo експериментални данни показват, че синергичната терапия с AFH и PTT има добри терапевтични ефекти и биосъвместимост. Той има добри перспективи за клинични медицински приложения в бъдеще.

Фиг. 4 Резултат от in vivo експерименти за безопасност. Данни за биохимия на кръвта, включително маркери за бъбречна функция: (A) маркери за чернодробна функция: CRE, (B) BUN и (C) ALT след различни лечения. (D) Резултати от хистопатологичен анализ (H&E-оцветени изображения) на основните органи, сърце, бял дроб, черен дроб, бъбреци и далак, на мишки, които са били изложени на различни лечения 16 дни след инжектирането. Скала: 100 мм.

Заключение

Проектирахме инжекционен фото-реагиращ хидрогел, който може едновременно да постигне терапия със свободни радикали и PTT чрез капсулиране на ензима FeS2 и източника на алкилни радикали AIPH в агарозен хидрогел. При 808 nm лазерно облъчване, PTA FeS2 насърчава нагряването на AFH системата и води до освобождаване на AIPH и неговото разлагане за получаване на алкилови радикали. В същото време FeS2 може да намали вътреклетъчното съдържание на GSH, като по този начин допълнително разрушава редокс хомеостазата. Скоростта на разтваряне на хидрогела може да се променя чрез параметри като плътност на лазерната мощност и размер на петното. Както in vivo, така и in vitro проучванията показват, че комбинацията от AFH с NIR облъчване може да постигне мощни ефекти за убиване на тумори с незначителни неблагоприятни ефекти. Хидрогелната система, проектирана в това проучване, осигурява стратегия за подобряване на терапевтичните системи, базирани на алкилови радикали.

Препратки

1 D. Zhu, J. Zhang, G. Luo, Y. Duo и BZ Tang,адв. Sci., 2021, e2004769.

2 C. Huang, S. Ding, W. Jiang и F.-B. Уанг,Наномащаб, 2021, 13, 4512–4518.

3 J. Wu, Y. Qu, K. Shi, B. Chu, Y. Jia, X. Xiao, Q. He и Z. Qian,Брадичка. Chem. Lett., 2018, 29, 1819–1823.

4 S. Ning, Y. Zheng, K. Qiao, G. Li, Q. Bai и S. Xu,J. Нанобиотехнол., 2021, 19, 344. 

5 D. Zhu, T. Zhang, Y. Li, C. Huang, M. Suo, L. Xia, Y. Xu, G. Li и BZ Tang,Биоматериали, 2022, 283, 121462. 

6 D. Zhu, R. Ling, H. Chen, M. Lyu, H. Qian, K. Wu, G. Li и X. Wang,Нано Рез., 2022, DOI:10.1007/s12274-022-4359-6. 

7 D. Zhu, M. Lyu, W. Jiang, M. Suo, Q. Huang и K. Li,J. Mater. Chem. б, 2020, 

8, 5312–5319. 8 H. Ranji-Burachaloo, PA Gurr, DE Dunstan и GG Qiao,ACS Нано, 2018, 12, 11819–11837. 

9 D. Zhu, Z. Liu, Y. Li, Q. Huang, L. Xia и K. Li,Биоматериали, 2021, 274, 120894. 

10 X. Li, R. Luo, X. Liang, Q. Wu и C. Gong,Брадичка. Chem. Lett., 2021 г., DOI:10.1016/j.cclet.2021.11.048.