Диетите на растителна основа са свързани с по-нисък риск от развитие на хронични заболявания като затлъстяване

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:Предполага се, че метаноловият екстракт от спанак (SME) инхибира образуването на напреднали крайни продукти на гликиране (AGEs), които се увеличават по време на прогресията на диабета, така че е важно да се знае дали SME имат благоприятен ефект върху ретината на диабета. В това проучване in vitro анализите показват, че SME инхибира гликирането, образуването на карбонилни групи и намаляването на редуцираната тиолова група в говежди серумен албумин, инкубиран или с редуциращи захари, или с метилглиоксал. Ефектът на SME в ретината на индуцирани от стрептозотоцин диабетни плъхове (STZ2) също е изследван (n=10) в групата с нормогликемия, STZ, STZ плъхове, третирани с SME, и STZ плъхове, третирани с аминогуанидин (anti-AGEs справка група) в продължение на 12 седмици. Ретината беше нарязана и имунооцветена за Ne-карбоксиметил лизин (CML), рецептор RAGE, NADPH-Nox4, индуцируема азотен оксид синтаза (iNOS), 3-нитротирозин (NT), ядрен NF-kB, съдов ендотелен растежен фактор ( VEGF), глиален фибриларен киселинен протеин (GFAP), S100B протеин и TUNEL анализ. Липидната пероксидация се определя в цялата ретина чрез нивата на малондиалдехид (MDA). Резултатите показват, че в диабетната ретина SME намалява ко-локализацията на CML-RAGE, оксидативния стрес (NOX4, iNOS, NT, MDA), възпалението (NF-B, VEGF, S10B, GFAP) и апоптозата (p<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">

Ключови думи:спанак; диабетна ретинопатия; крайни продукти за усъвършенствано гликиране; оксидативен стрес; възпаление; RAGE; карбоксиметил L-лизин

Моля, щракнете тук, за да научите повече

1. Въведение

Диетите на растителна основа са свързани с по-нисък риск от развитие на хронични заболявания като затлъстяване, диабет тип 2 и коронарна болест на сърцето. Спанакът (Spinacia oleracea L.) е ядлив листен зеленчук, който се консумира по целия свят поради осигуряването на значително количество фибри, витамини и минерали [1,2]. Идентифицирани са няколко от неговите фитохимикали, включително хлорофили, каротеноиди (лутеин и зеаксантин) [3] и фенолни съединения (флавони, флавоноиди, кумарини) [4-8] (вижте допълнение 1). Съобщава се, че спанакът, когато се приема като храна, водоразтворим екстракт или в лиофилизирана форма, и неговите тилакоиди имат противоракови свойства, против затлъстяване и хипогликемични свойства [9]. Противовъзпалителният ефект на спанака е демонстриран при животински ендотоксемични модели, затлъстели животни и здрави хора [9]. Неговият антиоксидантен ефект е изследван в клетки на човешки простатен карцином, животински модели със затлъстяване, UV-облъчени мишки и аденокарцином на трансгенна простата на мишка [9,10]. Антигликационните и противовъзпалителните ефекти на метаноловия екстракт от спанак (SME) са изследвани в модела на индуциран от глюкоза диабет при рибки зебра и съответно индуцирана от изопротеренол миокардна некроза при плъхове [11,12]. SME намалява нивата на гликозилиран хемоглобин и фруктозамин, включително нивата на гликиран протеин, чрез намаляване на алдозоредуктазната активност в окото на лещата [11]. Горните констатации предполагат, че МСП могат да имат превантивен ефект върху прогресирането на усложненията на захарния диабет като диабетна ретинопатия (DR).

DR прогресивно води до загуба на зрителна острота или слепота, което е свързано с възпаление, оксидативен стрес и натрупване на напреднали крайни продукти на гликиране (AGEs)[13,14]. AGE индуцират омрежване на протеини, променяйки структурата/функцията и нейния оборот/изчистване. AGE могат да бъдат произведени чрез неензимна реакция между глюкозата със свободна аминогрупа от протеини, образувайки обратими междинни продукти като бази на Шиф и продукти на Амадори (фруктозамин) [15]. Други механизми за образуване на AGEs включват пътя на "карбонилен стрес", където окисляването на захари и липиди създава дикарбонилни междинни съединения като глиоксал и метилглиоксал (MGO), които водят до образуване на AGEs като N:-карбоксиметил лизин (CML)[ 16]. Повишените нива на CML в серума и стъкловидното тяло могат да бъдат биохимичен маркер както за появата, така и за прогресията на DR [17,18]. В ретината, активирането на рецептора RAGE от AGEs (AGEs-RAGE) индуцира свръхекспресия на глиален фибриларен киселинен протеин (GFAP) и провъзпалителни фактори, регулирани от nu-clear фактор kappa-лека верига-енхансер на активиран B клетки (NF-kB)[19]. NF-kB регулира положително експресията на RAGE, като действа като механизъм за положителна обратна връзка [20].какво е цистанчеОт друга страна, високите концентрации на S100B, калций-свързващ протеин, могат също да активират NF-kB, предизвиквайки невровъзпаление и активиране на глиалните клетки [21]. Свръхекспресията на S100B в астроцитите провокира невротоксични ефекти, проявяващи се чрез астроглиоза на ретината [22].

Cistanche може да спре стареенето

Експериментално са разработени стратегии за предотвратяване на увреждане на ретината. Някои фитохимикали от спанак, изолирани от други растения, са свързани с инхибиране на AGEs и оксидативен стрес [8,23-26]. Лутеинът, астаксантинът и кемпферолът са защитили човешките пигментни епителни клетки на ретината (ARPE-19) от увреждане чрез техните анти-AGEs, антиоксидантни и антиапоптозни свойства [26-28]. Тези резултати предполагат, че фитохимикалите на спанака имат важна роля в превенцията на дегенерация на ретината като DR. Друга стратегия е използването на аминогуанидин (AG) като мощен инхибитор на гликирането и активността на iNOS, намалявайки натрупването на CML и образуването на реактивни дикарбонилни прекурсори при плъхове [29]. Въпреки това, в мултицентрично и рандомизирано клинично изпитване с 690 пациенти с диабет, благоприятният ефект не е установен ясно [30].

Промените в дегенерацията на ретината при хипергликемични условия са слабо проучени. Следователно е интересно да се знае дали SME предпазва слоевете на ретината от увреждане, свързано с неговите анти-AGEs, антиоксидантни и противовъзпалителни свойства в ретината на индуцирани от стрептозотоцин диабетни плъхове.

2. Материали и методи

2.1. Приготвяне на метанолов екстракт от спанак (SME)

Пресните листа от спанак (S.oleracea L.) са събрани през есенно-зимния сезон в земеделско поле в провинция Пуебла, Мексико, и са идентифицирани от ботаник в хербариума на Националния политехнически институт (IPN, Мексико Сити, Мексико). Образец на ваучер номер 4532 е депозиран в хербариума на Националното училище по биологични науки на IPN.

Листата бяха дехидратирани и фино смлени. Изсушените листа се мацерират с метанол при стайна температура, филтрират се през целулозни филтри (Whatman, Maidstone, UK) и се сушат с помощта на ротационен вакуум изпарител (BUCHI Rotavapor R{{0}}, Швейцария) при 45 градуса до добив на зелена гума (95.0g/kg сухи листа).Цистанче против стареенеSME се съхранява на тъмно при 4 градуса до употреба. За всички анализи екстрактът се разтваря в дестилирана вода[11].

2.2. In vitro анализи на SME антигликационна активност

2.2.1. Образуване на напреднали крайни продукти на гликиране, получени от говежди серумен албумин (BSA-AGEs)

Анализът на BSA-AGEs беше извършен, както е описано по-рано [31]. Накратко, 10 mg/mL BSA (фракция V; Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) беше добавен или в D-глюкоза 0.5 M, D-фруктоза {{12 }}.5 М или метилглиоксал 2,5 тМ и се прави в разтвор 0.1 М PBS (pH 7,4) и 0,02 процента натриев азид. Концентрации на SME (5, 10, 25, 50, 100 и 200 mg/mL) се добавят към всяка смес и след това се инкубират при 37 градуса за 4 седмици. След това нереагиралите захари се отстраняват чрез диализа срещу дестилирана вода в продължение на два дни при 4 градуса. Нивата на BSA-AGE се определят чрез флуоресцентна спектрофотометрия (Ex370/Em 440 nm; модел LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, UK)[32]. Гликирането на BSA протеин чрез редуциращи захари и MGO са положителна контрола (BSA гликиран), докато инкубацията на BSA гликиран с аминогуанидин (1 mg/mL) се използва като отрицателна контрола (BSA гликиран-AG). Анализите се извършват в три екземпляра.

2.2.2. Анализ на фруктозамин

Нивото на фруктозамин се определя чрез анализ на нитро син тетразолий (NBT) [33], който се основава на способността на фруктозамин да редуцира NBT, образувайки формазан, оцветен краен продукт при алкални условия. Десет микролитра от контролните или гликирани BSA-инкубирани SME концентрации （BSA-SME） бяха добавени към 90 μL NBT при 2,5 mM, приготвен в карбонатен буфер (0,1 М; рН 10,3); всички бяха инкубирани при 37 градуса С за 30 минути. Измерва се абсорбцията при 530 nm. Концентрациите на фруктозамин (nmol/mg) се изчисляват съгласно стандартна крива на формазан.

2.2.3. Определяне на образуване на карбонилни групи и изчерпване на тиолови групи в BSA-AGEs

Концентрацията на карбонилна група се измерва в BSA-SME и контролни проби, съгласно Levine et al. [34]. Разтвор на 2,4-динитрофенилхидразин (DNPH; 10 mM) в 400 μL 2,5 М HCl се добавя към 100 μL всяка проба и се инкубира на тъмно в продължение на 60 минути при стайна температура.cistanche benefíciosСлед това се добавят 500 μL трихлороцетна киселина （20 процента w/v） и се държат върху лед за 5 минути. Пробите се центрофугират при 4000 rpm за 15 минути и протеиновата пелета се промива три пъти с етилацетат/етанол (1:1 v/v). След това пробите се суспендират в 250 μL гуанидин хидрохлорид до 6 М. Концентрацията на карбонилни групи (nmol/mg протеин) се изчислява чрез спектрофотометрия при 370 nm абсорбция (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA), като се използва коефициент на абсорбция на DNPH (22 000 M-1 cm-1).

Съгласно метода на Ellman беше извършено определянето на изчерпването на тиолните групи в BSA-SME и контролни проби. Накратко, 10 μL от 5,5'-дисулфанедиилбис（2-нитробензоена киселина）） (DNTB;10 mM, приготвен в PBS) с 50 μL гликирани проби беше инкубиран за 15 минути при стайна температура, след това се измерва абсорбцията при 410 nm. Нивото на свободните тиолови групи се изчислява с помощта на стандартна крива на L-цистеин（0.4-11 μM） и се изразява в nmol/mg протеин [34].

2.3. Ефект на SME върху ретината на плъхове с диабет 2.3.1. Индуциране на диабет при плъхове

Използвани са мъжки плъхове Wistar с тегло 250± 10 gr(N=40), гладуващи в продължение на 8 часа. Беше приложена интраперитонеална доза стрептозотоцин (60 mg/kg) в цитратен буфер (10 mM, pH 4,5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) [35]. Три дни по-късно беше измерено нивото на глюкозата (глюкомер; ACCU-CHEK active; Roche Diagnostics, GmbH, Манхайм, Германия) чрез събиране на капка кръвна проба от опашката. Животни с гликемични нива по-високи от 350 mg/dL бяха наети за изследването. Глюкозата в кръвта се измерва всяка седмица в продължение на 12 седмици.

2.3.2. Експериментален дизайн

Индуцираните от стрептозотоцин диабетни плъхове (STZ) бяха разделени на случаен принцип в следните групи (n =10): STZ, третирани интрагастрално с 2 mL питейна вода (STZ); STZ, третиран с SME при 400 mg/kg (STZ-SME); нормогликемични плъхове (NG); и STZ, третиран с 50 mg/kg аминогуанидин (AG; Sigma-Aldrich, Inc.) (STZ-AG). STZ-AG беше използван като анти-AGE референтна група. Предписаните дози се прилагат на всеки 24 часа (9:00 сутринта) в продължение на 12 седмици. Нивото на гликемията във всички групи се проследява ежеседмично. Режимът на дозиране на SME при 400 mg/kg се основава на следното: 7 g SME се получават от 100 g пресен спанак (данните не са показани). Това количество е еквивалентно на дневната консумация на среден човек от 70 kg в американската диета [36], което съответства на 100 mg екстракт/kg телесно тегло.Екстракт от цистанче против радиацияОт друга страна, поради разликата в ускорения метаболизъм на плъховете, се препоръчва да се увеличи консумацията на всеки естествен екстракт до 6,4 пъти за сравнителни проучвания с хора [37]. Дозата от 400 mg/kg, която използвахме, се основаваше основно на резултатите, получени в модел на миокардна некроза, индуцирана при плъхове Wistar, който показа, че противовъзпалителният ефект на SME е по-значим при 300 mg/kg [12].

2.3.3. Хистологични и имунохистохимични оценки

Енуклеираните очи се фиксират в неутрален формалин и след това се дехидратират в сортирани алкохоли и се поставят в парафин. Хистологични срезове от 2 μm бяха монтирани върху електрозаредени предметни стъкла, депарафинизирани и рехидратирани до разтвор за възстановяване на антиген (K035; 10 × цитратен буфер, pH6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, СА, САЩ). Използвана е система за имунооткриване, базирана на полимер (PolyVuemouse/заек DAB система за откриване, Diagnostic BioSystems). Използвани са следните първични антитела: глиален фибриларен кисел протеин (анти-GFAP;MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, СА, САЩ); васкуларен ендотелен растежен фактор (anti-VEGF;sc-7269; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), S100 калций-свързващ протеин B (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, Cambridge, UK) и ядрен фактор kappa-лека верига-енхансер на активирани В клетки (anti-NF-kB p65;sc-8008). Всички разреждания са 1:200 и се инкубират за една нощ при 4 градуса. Вторично антитяло (Mouse/Rabbit PolyVueTM) се добавя съгласно инструкциите на доставчика.цистанче билкаСрезовете се оцветяват с DAB плюс/хромогенен субстрат и хематоксилин. Хистологичните наблюдения и заснемането на изображения бяха извършени в микроскоп Carl Zeiss (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Йена, Германия).

За имунофлуоресцентно оцветяване предметните стъкла се инкубират една нощ при 4 градуса С със следните първични антитела: карбоксиметил лизин (анти-CML; ab124145; Abcam PLC, Кеймбридж, Обединеното кралство), AGE рецептор (анти-RAGE; sc-365154), NADPH оксидаза 4 (анти-Nox4; ab133303), 3-нитротирозин (анти-NT; ab110282) и азотен оксид синтаза (индуцируема) (анти-iNOS; A00368-1; Boster Bio, Pleasanton, CA , САЩ). След това бяха използвани следните вторични антитела: за анти-RAGE, кози анти-миши lgG(FITC)-конюгирани (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); за анти-CML и анти-NT, миши анти-заешки IgG-PE (SC-3753); и за анти-iNOS и анти-Nox4, m-IgGkBP-PE (Sc-516141). Всички бяха инкубирани при стайна температура в продължение на 60 минути. След това срезовете бяха монтирани в среда, съдържаща 4',6-диамидин-2'-фенилиндол дихидрохлорид (DAPI). Анти-CML и анти-RAGE антитела бяха ко-хибридизирани в един и същи слайд. FLoidTM Cell Imaging Station (Life technology Carlsbad, Сан Диего, Калифорния, САЩ) беше използвана за флуоресцентни изображения.

2.3.4. Оценка на апоптозата

Апоптозата на клетките на ретината се открива в съответствие с ръководството, описано чрез анализ за маркиране на края на дезоксиуридин трифосфат (dUTP), медииран от терминална дезоксинуклеотидил трансфераза (TdT) (TUNEL), като се използва комплектът за откриване на клетъчна смърт In Situ, TMR (тетраметил-родамин{{ 3}}dUTP) червено, версия 12 (12156792910; Roche Diagnostics). Накратко, депарафинизираните предметни стъкла бяха рехидратирани и изплакнати два пъти с PBS. След това те бяха инкубирани с реакционната смес TUNEL във влажна атмосфера в продължение на 60 минути при 37°С. След това срезовете бяха монтирани с DAPI и наблюдавани във флуоресцентна микроскопия (FLoidTM Cell Imaging Station). IOD за TUNEL се изчислява за слоевете на ретината.

2.3.5. Тест за липидна пероксидация

За оценка на нивата на малондиалдехид (MDA) в тъканта на ретината, приблизително 3 mg прясна тъкан (n=3) бяха хомогенизирани и обработени, както беше докладвано по-рано [38]. Нивата на MDA се определят количествено, следвайки инструкциите на доставчика на комплекта (комплект за анализ OXItek-TBARS, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA).

2.4. Статистически анализ

За статистически анализ, всички микрографии на ретината бяха заснети с величина 200× на 100 μm извън областта на зрителния нерв. Бяха анализирани приблизително 40 изображения на група животни (n=7). Анализът на изображението беше извършен със софтуера Image-Pro Premier Version 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Използвахме софтуер GraphPad Prism (La Jolla, Калифорния, САЩ; версия 8.0). Фигурите показват стойности, изобразени в графични графики с кутия и мустаци (медиана, първи-трети квартил, минимална-максимална стойност) за слоя на ганглийните клетки (GCL), вътрешния ядрен слой (INL) и външния ядрен слой (ONL). Средната стойност и стандартното отклонение (средно ± SD) са показани в Приложение A (Таблици A1-A3). Във всички случаи беше извършен еднопосочен ANOVA тест, последван от тест на Tukey. стр<0.05 was="" considered="" statistically="">