NGF модулира метаболизма на холестерола и стимулира секрецията на ApoE в глиалните клетки, предоставяйки неврозащита срещу оксидативен стрес, част 2

2.6. NGF-медиирана секреция на ApoE от U373 защитава невронните клетки от окислително увреждане

Натрупващите се доказателства подчертават, че ApoE повишава устойчивостта на невроните към оксидативни инсулти, като по този начин предотвратява апоптозата и невродегенерацията [17,18,37]. В този контекст, ние оценихме дали индуцираната от NGF ApoE секреция от U373 клетки може да защити N1E -115 невроните от оксидативен стрес. Напълно диференцираните N1E-115 бяха предварително третирани с ротенон, който индуцира оксидативен стрес чрез инхибиране на митохондриалния комплекс I.

Апоптозата е процес на самоунищожение и е важен начин клетките да поддържат хомеостазата на тялото чрез програмирано самоунищожение при определени обстоятелства. Апоптозата играе различни роли в различните етапи от живота.

Последните проучвания показват, че има известна връзка между апоптозата и паметта. Вече знаем, че паметта е сложен нервен процес в мозъка, включващ връзки и координация между множество области на мозъка. Апоптозата може да играе роля в този нервен процес.

От една страна, апоптозата може да стабилизира мрежовата структура на невроните чрез изчистване на ненужните неврони и синапси, правейки връзките на невроните по-рафинирани, като по този начин подобрява качеството и ефективността на паметта. От друга страна, прекомерната апоптоза може също да доведе до намаляване на броя на мозъчните клетки, което може да повлияе негативно на съхранението и улавянето на спомени.

Следователно, докато поддържаме подходящи нива на апоптоза, можем да подобрим паметта чрез поредица от поведения и умения, като четене, учене, упражнения и коригиране на нашето мислене. Тези поведения и умения могат да насърчат растежа и връзката на мозъчните клетки и да подобрят качеството и ефективността на паметта чрез стимулиране на връзките и координацията между мозъчните неврони.

В заключение, връзката между апоптозата и паметта е сложна. Само докато поддържаме правилна апоптоза, можем да стимулираме мозъка си и да подобрим паметта си чрез набор от поведения и умения. От тази гледна точка трябва да подобрим паметта си. Cistanche deserticola може значително да ни помогне да подобрим паметта си, тъй като Cistanche deserticola може също да регулира баланса на невротрансмитерите, като например повишаване на нивата на ацетилхолин и растежни фактори. Тези вещества са важни за паметта. Много е важно за ученето и ученето. В допълнение, месото от месо може също да подобри течливостта на кръвта и да насърчи транспортирането на кислород, което може да гарантира, че мозъкът получава достатъчно хранителни вещества и енергия, като по този начин подобрява мозъчната жизненост и издръжливост.

Щракнете върху познайте добавките за подобряване на паметта

След 16 часа експозиция на ротенон, N1E-115 невроните се култивират в прясна среда (Ctrl), кондиционирана среда от U373 клетки (U373-Ctrl), кондиционирана среда от U373, предварително третирана с NGF за 48 часа (U373-NGF), или кондиционирана среда от ApoE-заглушен U373, предварително третиран с NGF в продължение на 48 часа (U373-NGF ApoE siRNA). Предварителната обработка с ротенон силно намалява броя на N1E-115, култивирани в контролната среда, което показва, че прилагането на този пестицид сериозно влияе върху оцеляването на N1E-115.

Цитотоксичността на ротенон също определя интензивна ретракция на невритите, както се наблюдава от дължината на невритите. Увреждането на невритите, предизвикано от лечението с ротенон, е особено очевидно при оценка на клетки, носещи неврит, тъй като броят на N1E-115 с неврити намалява до 50%. Подобни резултати бяха получени, когато N1E-115 клетки бяха култивирани в U373-Ctrl кондиционирана среда, което предполага, че наличието на супернатанта, получена от нестимулирани астроцити, не е достатъчно за защита на невронните клетки от ротенон-медиирана токсичност. От друга страна, прилагането на кондиционирана среда, получена от третиран с NGF U373, ефективно предотвратява невронната смърт, както и намаляването на носещите неврити клетки и дължината на невритите, причинени от прилагането на ротенон (Фигура 5).

По-важното е, че кондиционираната среда, получена от ApoE-заглушени U373 клетки, напълно губи благоприятните ефекти, предизвикани от d от U373-NGF кондиционирана среда, което показва, че неврозащитата се задвижва от NGF-медиираното освобождаване на АроЕ в културалната среда. Трябва да се отбележи, че кондиционираната среда от обработен с NGF U373, трансфектиран с разбъркана siRNA, запазва напълно защитните ефекти, упражнявани от U373-NGF кондиционирана среда, демонстрирайки, че загубата на неврозащита, наблюдавана в кондиционирана среда от ApoE-заглушени клетки, е ефективно зависима от ApoE регулиране надолу (Фигура S3C).

Фигура 5. Ефекти на U373 кондиционирана среда върху оксидативния стрес в невроните. Представителни изображения в светло поле и количествена оценка на невронната морфология на N1E-115. Клетките бяха предварително третирани (+) или не (-) с ротенон (0.1 µM) в продължение на 16 часа и след това култивирани в пресен DMEM (Ctrl), в кондиционирана среда, получена от контрола U373 (U{{ 9}}Ctrl), предварително третиран с NGF U373 (U373-NGF) и предварително третиран с NGF U373, заглушен за apoE (U373-NGF ApoE siRNA) за 48 часа. n=5 различни експеримента. Данните представляват средно ± SD. Статистическият анализ беше оценен чрез използване на еднопосочен ANOVA, последван от post hoc теста на Tukey. ** p < 0.01, *** p < 0,001.

За да подсилим резултатите, получени от кондиционираната среда, направихме U373/N1E115 съвместни култури. За да започнете, клетките U373 бяха предварително третирани или не с NGF в продължение на 48 часа. Освен това, диференцирани N1E -115 клетки бяха предварително третирани или не с ротенон в продължение на 16 часа. Впоследствие средата U373 беше заменена с прясна среда, съдържаща 0.5% FBS, и покривни стъкла, посяти с N1E-115, бяха прехвърлени върху слоя U373 за приготвяне на съвместни култури (Фигура 6А).

Окислителното увреждане, предизвикано от третиране с ротенон, значително повлиява клетъчните виабилиневритни носещи пръстенови клетки и невритната дължина на контролните N1E-115 и N1E-115, култивирани съвместно с U373-Ctrl астроцити (Фигура 6B). В съответствие с експериментите с кондиционирана среда, N1E-115 клетки, култивирани съвместно с U373-NGF клетки, бяха защитени от окислително увреждане, докато ApoE заглушаването в U373 премахна неврозащитата, поддържана от NGF.

Фигура 6. АроЕ секреция от третирани с NGF U373 клетки осигурява невропротекция от оксидативен стрес. (A) Представителна схема на съвместни култури от астроцит-неврон, създадени, както е описано в раздела за материали и методи. Клетките, носещи неврит, дължината на невритите и броят на клетките бяха оценени часове след установяването на съвместна култура. (B) Представителни изображения в светло поле и количествена оценка на невронната морфология на N1E-115 клетки, предварително третирани (+) или не (-) с ротенон (0.1 µM) за 16 часа.

N1E-115 след това се съхраняват в пресен DMEM (Ctrl) или се култивират съвместно с контрола U373 (U373-Ctrl), предварително третиран с NGF U373 (U373-NGF) и Предварително обработен с NGF U373 е заглушен за ApoE (U373-NGF ApoE siRNA) за 48 часа. n=5 различни експеримента. Данните представляват средно ± SD. Статистическият анализ беше извършен чрез използване на еднопосочен ANOVA, последван от post hoc теста на Tukey. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.

3. Дискусия

Дисбалансите в сигналните пътища на невротрофините, както и промените в метаболизма на мозъчния холестерол, са силно свързани с неврологични и невродегенеративни заболявания, като синдром на Rett, HD, болест на Алцхаймер (AD) и болест на Паркинсон (PD) [2,38,39] . В този контекст, фундаменталното изследване на биологичната активност на невротрофините е от основно значение за дисекцията на молекулярните механизми, свързващи метаболизма на холестерола и мозъчната физиопатология. През последните няколко години интересно проучване съобщава за ролята на BDNF в регулирането на метаболизма на холестерола в астроцитите [38].

Въпреки това схващане, няма налична информация за предполагаемото участие на NGF в регулирането на астроцитния холестерол. Следователно, в тази работа, ние се фокусирахме върху проспективната роля, упражнявана от NGF в регулирането на метаболизма на холестерола, с особено внимание към влиянието на секрецията на ApoE върху невронната диференциация и оцеляване. U373, астроцитомната клетъчна линия, използвана като експериментален модел на човешки астроцити, запазва потенциала да реагира напълно на NGF, тъй като изразява значителни нива както на TrkA, така и на p75NTR.

Основните резултати показват, че NGF повишава нивата на основните протеини, участващи в биосинтезата на холестерола (HMGCR), вътреклетъчния трафик (NPC1) и секрецията (ABCA1). Тези събития са придружени от едновременно повишаване на АроЕ и холестерол леин в културалната среда, което предполага, че NGF повишава биосинтезата на холестерола и екструзията от глиалните клетки. Съобщава се, че NGF индуцира експресията на ApoE протеин чрез увеличаване на неговата транскрипция [40]. Въпреки това, ние не наблюдавахме значителна промяна във вътреклетъчната експресия на АроЕ. Това очевидно несъответствие може да се обясни, тъй като натрупването на АроЕ не може да бъде оценено поради повишеното му изтичане от третирания с NGF UIn
В опит за по-добра дисекция на молекулярните механизми, ние третирахме U373 с LM11A-31 и открихме, че p75NTR модулаторът е в състояние да имитира само повишаването на експресията на HMGCR, медиирано от NGF. Участието на p75NTR в модулирането на нивата на HMGCR е в съответствие с предишни данни, получени в други типове клетки, показващи, че този рецептор контролира транскрипцията на холестерогенни ензими [41]. Въпреки това, LM11A-31 не индуцира никакви промени нито в другите протеини, анализирани в това проучване, включително ABCA1, нито в нивата на холестерола и ApoE в културалната среда, което показва, че селективната модулация на p75NTR не е достатъчна за насърчаване на холестерола екструзия през богати на ApoE частици, наблюдавани в третирани с NGF клетки. Тези резултати ни карат да предположим, че NGF управлява метаболизма на холестерола в глиалните клетки чрез участието на p75NTR и TrkA рецепторите.

Добре известно е, че свързването на невротрофин към Trk рецепторите активира ERK1/2, като по този начин регулира няколко пътя, участващи в клетъчната диференциация, пролиферация и оцеляване [2,38]. Интересно е, че се наблюдава, че активирането на ERK1/2 също регулира експресията на ABCA1 и ApoE в различни типове клетки [38,42,43]. Тези открития, заедно с доказателствата, че оста BDNF/TrkB/ERK насърчава екструзията на ApoE и експресията на ABCA1 в глиалните клетки [38], предполагат, че пътят на сигнална трансдукция, включващ оста TrkA/ERK, може да обясни част от ефектите, упражнявани от NGF в нашето проучване.

Въпреки че не са наблюдавани промени в невритния растеж, използването на U373- кондиционирана среда и установяването на експерименти за съвместно култивиране показват, че повишената секреция на ApoE от глиални клетки, медиирана от NGF, е определяща за предотвратяване на вредните резултати, предизвикани от оксидативно стрес в невронните клетки. За да индуцираме цитотоксичност, ние използвахме ротенон, пестицид, който обикновено се използва в предклиничните изследвания за индуциране на получени от митохондриите реактивни кислородни видове (ROS) и последваща апоптоза [44].

Нашите резултати подчертават, че NGF стимулира секрецията на ApoE от глиалните клетки, което е необходимо, за да се гарантират невропротективните ефекти срещу прилагането на ротенон в диференцирани N1E -115 клетки. Ролята на ApoE в превенцията на оксидативния стрес е добре документирана. Например, изчерпването на ApoE в миши модели изостря оксидативното увреждане в мозъчната тъкан [45,46]. Съответно, прилагането на екзогенен АроЕ предпазва от необратимо окислително увреждане от третиране с водороден пероксид чрез противодействие на вторичната глутаматна токсичност [18]. В допълнение, АроЕ-съдържащите липопротеини са ефективни при отслабване на апоптозата, предизвикана от оттеглянето на трофичната подкрепа в невроните на ганглия на ретината [47].

В нашето проучване, използването на ротенон предполага, че ApoE-медиираната невропротекция, стимулирана от NGF-стимулирани глиални клетки, може да бъде от значение в контекста на невродегенеративни състояния като PD. Трябва да се отбележи, че ротенонът възпроизвежда допаминергична невронална дегенерация, подобна на тази, наблюдавана при PD, както в животински модели, така и в клетъчни култури, включително неврони, получени от N1E-115- [48–50]. Кохерентно, нашите резултати подкрепят предишни доказателства, показващи, че АроЕ предизвиква невропротекция при прилагане на 6-хидроксидопамин (6-OHDA), друг невротоксин, способен да индуцира PD-подобен фенотип [51]. Колективно, нашето проучване демонстрира, че NGF е решаващ модулатор на метаболизма на холестерола и екструзията на ApoE от глиалните клетки. Най-важното е, че усилването на секрецията на АроЕ, насърчавано от този невротрофин, е необходимо, за да се осигури невропротекция срещу цитотоксичност на ротенон.

BDNF е най-разпространеният невротрофин в мозъка на възрастните. Въпреки тези доказателства е доказано, че NGF може да играе решаваща роля не само по време на развитието, но и в централната нервна система на възрастни. Например, NGF влияе върху хипокампалната активност и, като следствие, пространствената памет и ученето [52]. Други открития предполагат, че NGF проявява невропротективен ефект върху нигростриаталните допаминергични неврони и че тази активност може да постави основата за нови терапевтични подходи, базирани на NGF, за PD [53].

Според това схващане е показано, че производството на NGF е дълбоко регулирано в астроцитите по време на зряла възраст и упражнява модулиращи действия върху невровъзпаление, мозъчно увреждане и невродегенерация [54–56]. В този контекст би било интересно да се оцени в бъдещи проучвания дали тези ефекти могат да бъдат медиирани, поне отчасти, от модулирането на глиалния холестерол, насърчаван от NGF. Настоящата работа представя някои ограничения, които трябва да бъдат преодолени в следващите експериментални изследвания; например, би било важно да се анализират по-добре молекулярните механизми, свързващи лечението с NGF и метаболизма на холестерола в глиалните клетки.

Широкото разбиране е полезно за идентифициране на специфични молекулярни цели, податливи на фармакологична манипулация, които могат да бъдат използвани в невродегенеративни контексти. Освен това, въпреки че клетките U373 и N1E-115 се използват широко като управляеми клетъчни линии за съответно възпроизвеждане на астроцитни и невронни характеристики [27–29,57], тези открития трябва да бъдат допълнително потвърдени в първични клетъчни култури. Въпреки че трябва да се положат по-нататъшни усилия за засилване на участието на невротрофиновото сигнализиране в мозъчната холестеролна хомеостаза, тази работа демонстрира за първи път, че NGF може индиректно да упражнява невропротекция чрез повлияване на метаболизма на глиалния холестерол.

4. Материали и методи

4.1. Клетъчна култура

N1E-115 невробластомни клетки и U373 клетки се култивират при 5% CO2 в DMEM при висока глюкоза (Merck Life Science, Милано, Италия), с 10% (v/v) фетален говежди серум (FBS) (Merck Life Science , Милано, Италия) и добавен с разтвор на пеницилин/стрептомицин.

За да се индуцира невронална диференциация, клетките N1E-115 се посяват при 30% сливане и се превключват към DMEM с 0,5% FBS за 96 часа.

За да се индуцира невронална диференциация, клетките N1E-115 се посяват при 30% сливане и се превключват към DMEM с 0,5% FBS за 96 часа.

Съвместните култури от астроцит-неврон бяха създадени съгласно протокола, описан от Ioannou и колеги, с модификации [59]. Парафиновите разделители бяха притиснати върху покривни стъкла, за да се осигури прилепване; използвахме дистанционни елементи върху покривните стъкла на невроните, за да предотвратим ефективно механично увреждане, когато клетките бяха поставени една срещу друга. След това покривните стъкла се стерилизират в етанол и се покриват с поли-D-лизин (Merck Life Science, Милано, Италия). N1E-115 се посяват върху покритите покривни стъкла с желаната плътност и след като са готови за съвместна култура, се използват стерилни щипци за повдигане на покривните стъкла с N1E-115 неврони и поставянето им с лицето надолу в { {10}}ямки, посяти с U373 астроцити.

Предварителните обработки на N1E-115 клетки се провеждат чрез прилагане на 0.1 µM ротенон (Sigma-Aldrich, Милано, Италия, R8875) в продължение на 16 часа. Контролните клетки получават DMSO (разреждане 1:1000 в среда за клетъчна култура) като носител. U373 клетки бяха третирани с NGF (Alomone Labs, Йерусалим, Израел, N-245) при доза от 100 ng/mL за 48 часа във всички експерименти.

4.2. Приготвяне на лизат и Western blot анализ

Клетките U373 бяха обработени с ултразвук (работен цикъл 20%, изход 3) в буфер за проба (0.1 Tris-HClisHCl, съдържащ 10% SDS, протеазен инхибиторен коктейл, pH 6.8) за получаване на общ лизат, както е описано по-горе [ 60,61]. Добавя се буфер Laemmli и пробите се денатурират при 95 °C за 5 минути. Протеиновите екстракти (двадесет микрограма протеини) се разделят на SDS-PAGE и прехвърлянето върху нитроцелулозна мембрана се извършва чрез използване на система за транс-блот турбо трансфер (Biorad Laboratories, Милано, Италия), както беше съобщено по-рано [62].

Впоследствие мембраната се инкубира при стайна температура в продължение на 1 час с 5% обезмаслено сухо мляко в Tris-буфериран физиологичен разтвор (25 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl, 27 mM KCl, 0.05% Tween{ {10}}, рН 6,8) и се изследва една нощ при 4 ◦C със следните първични антитела: анти-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Далас, Тексас, САЩ, sc-271708, разреждане 1:500), анти- TrkA (Santa Cruz Biotechnology, Далас, Тексас, САЩ, подкожно-118, разреждане 1:500), анти-SREBP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Далас, Тексас, САЩ, подкожно-8984 , разреждане 1:1000), анти-SREBP-2 (Abcam, Cambridge, UK, ab30682, разреждане 1:1000), anti-HMGCR (Abcam, Cambridge, UK, ab242315, разреждане 1:1000), анти-LDLr (Abcam, Cambridge, UK, ab30532, разреждане 1:500), анти-NPC1 (Novus Biologicals, Centennial, CO, САЩ, NB400-148, разреждане 1:3000 ), antiABCA1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-58219, разреждане 1:400), anti-ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-53570, разреждане 1 :400), антивинкулин (SigmaAldrich, Милано, Италия, V9264, разреждане 1:10 000) и анти- -актин (Santa Cruz Biotechnology, Далас, Тексас, САЩ, sc-47778, разреждане 1 :10 000).

Мембраните бяха последователно инкубирани в продължение на 1 час при стайна температура с HRP-конюгирани вторични анти-миши или анти-заешки антитела (Bio-Rad Laboratories, Милано, Италия). Свързаните с протеини антитела се визуализират чрез яснота ECL Western blotting (Bio-Rad Laboratories, Милано, Италия, #1705061) и хемилуминесценцията се регистрира чрез системата ChemiDoc MP (Bio-Rad Laboratories, Милано, Италия). Денситометричният анализ, получен от Western blots, след това беше извършен с помощта на софтуер ImageJ версия 1.52t (Национални здравни институти, Бетезда, MD, САЩ) за Windows. Винкулин или -актин бяха използвани като домакински протеини, които служеха като вътрешни контроли за зареждане с протеини. Денситометричните изчисления бяха получени като произволни единици, получени от съотношението между интензитета на протеиновата лента и съответния домакински протеин.

4.3. Маслено червено О оцветяване

Клетките U373 се посяват върху покрити с поли-L-лизин (Sigma-Aldrich, P6282-5MG) покривни стъкла в 6-ямкови плаки и се извършва оцветяване с Oil red O, както беше съобщено по-рано [60]. Накратко, клетките се фиксират в параформалдехид (4% разтвор) за 10 минути и внимателно се изплакват три пъти с PBS. Фиксираните клетки се инкубират с 60% изопропанол в продължение на 5 минути и след това се промиват с дестилирана вода. Впоследствие клетките бяха изследвани с 1 mL работен разтвор Oil Red O (Sigma-Aldrich, O1391-250ML) в продължение на 15 минути при стайна температура чрез поставяне на 6-плочката с ямки върху орбитален ротационен шейкър. След инкубиране с оцветяващия разтвор, ямките се промиват три пъти с дестилирана вода, за да се елиминира излишното петно.

Покривните стъкла бяха накрая монтирани с монтираща среда Fluoroshield (Sigma-Aldrich, F6182) и автофлуоресценцията на Oil red Oil беше визуализирана чрез конфокална микроскопия (TCS SP8; Leica, Wetzlar, Германия). Изображенията бяха заснети с помощта на Leica TCS SP8, оборудван с 63 × увеличение и софтуер Leica LAS X (Милано, Италия). Количественото определяне на оцветяването с маслено червено O се извършва чрез софтуер ImageJ за Windows и се изчислява като среден интензитет на флуоресценция на клетъчна площ.
4.4. Филипинско оцветяване

Оцветяването с филипин се извършва с помощта на комплекс филипин (Sigma-Aldrich, F9765). Изходният разтвор на Filipin (10 mg/mL в PBS) винаги се приготвя непосредствено преди употреба. Клетките се фиксират в параформалдехид (4% разтвор) за 10 минути и се промиват с PBS. След това U373 се оцветяват с 1 mL работен разтвор на Filipin (0.05 mg/mL в PBS) в продължение на 1 час на тъмно, при стайна температура. Впоследствие клетките се промиват три пъти с PBS и покривните стъкла се монтират с монтираща среда Fluoroshield и незабавно се анализират чрез конфокална микроскопия с помощта на комплект UV филтър (340–380 nm възбуждане). Изображенията са получени при 40Х увеличение. Филипинското количествено определяне се изчислява като среден интензитет на флуоресценция на клетъчна площ с помощта на софтуера ImageJ за Windows.

4.5. Количествено определяне на холестерола

Количественото определяне на холестерола се извършва с помощта на колориметричен анализ (Cholesterol Quantitation Kit, MAK043, Sigma-Aldrich, Милано, Италия), следвайки инструкциите на производителя.

4.6. ELISA
Нивата на ApoE в културалната среда бяха оценени чрез използване на комплекта човешки аполипопротеин E ELISA (Abcam, Cambridge, UK, ab108813), съгласно инструкциите на производителя.

4.7. Имунофлуоресценция

Имунофлуоресценцията на U373 клетки се извършва, както е описано по-горе [60]. U373 се фиксират в параформалдехид (4% в PBS) и се изследват за една нощ с първични антитела: анти-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Далас, Тексас, САЩ, sc-271708, разреждане 1:100) и анти-TrkA ( Santa Cruz Biotechnology, Далас, Тексас, САЩ, sc-118, разреждане 1:100). Впоследствие клетките се инкубират в продължение на 1 час с козе анти-мише вторично антитяло Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA, A28180) и с козе анти-заешко вторично антитяло Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA , A27034). Беше извършено оцветяване с DAPI, за да се визуализират ядрата и накрая покривните стъкла бяха монтирани с монтажна среда Fluoroshield. Пробите се анализират чрез конфокална микроскопия, както е описано по-горе.

4.8. ApoE заглушаване

Заглушаването на ApoE mRNA се извършва върху U373 клетки, използвайки ApoE siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-29708) съгласно инструкциите на производителя. Трансфекцията беше поставена в 6-плака за тъканна култура с ямки, където 100000 клетки на ямка бяха посяти в DMEM среда за растеж без антибиотици, допълнена с 10% FBS за 24 часа. За всяка ямка, среда за трансфекция на siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Далас, Тексас, САЩ, sc-36868) ​​се добавя към разтвор за реакция на трансфекция на siRNA, приготвен с помощта на siRNA дуплекс и реагент за трансфекция на siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, САЩ, sc29528). След това клетките се промиват веднъж със среда за трансфекция на siRNA и се покриват с предварително направената смес за трансфекция. Впоследствие културалната плака се инкубира в продължение на 7 часа при 37 ◦C в 5% CO2 инкубатор.

DMEM растежна среда с 20% FBS и антибиотици (2-кратно нормалната концентрация) се добавя към трансфекционната смес във всяка ямка в съотношение 1:1. Клетките се инкубират в продължение на 18 часа и след това средата се изхвърля и се заменя със свежа нормална растежна среда; 24 часа след тази последна стъпка клетките бяха готови за използване за по-нататъшни експерименти. Ефективността на заглушаването на ApoE беше оценена чрез RT-qPCR в U373 клетки и чрез ELISA в клетъчния супернатант; ApoE siPHK ефективно предотвратява индуцирането на ApoE от NGF в сравнение със scramble siRNA (ApoE mRNA: 83% намаление; ApoE ELISA: 78% намаление). Трябва да се отбележи, че експресията на ApoE при заглушаване на siRNA е по-ниска от базалните нива на експресия, наблюдавани при контрола U373 (ApoE mRNA: 72% намаление; ApoE ELISA: 58% намаление) (Фигура S 3A, B).

4.9. Екстракция на РНК и PCR в реално време

mRNA анализът беше извършен, както беше докладвано по-рано [22,63]. Накратко, общата РНК от U373 клетки се екстрахира с TRI реагент (Merck Life Science, Милано, Италия) съгласно инструкциите на производителя. Беше извършено лечение с ДНКаза (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Милано, Италия) и след това РНК беше пречистена с помощта на комплект за почистване на РНК (Zymo, Италия). РНК беше последователно обратно транскрибирана към cDNA чрез клетъчен комплект за обратна транскрипция на cDNA с голям капацитет (Applied Bio-System, Foster City, CA, USA) и използвана за qPCR анализ.

Праймерите, използвани в qRT-PCR за apoE, бяха: преден 5 0 -GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 и обратен 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0. Праймерите, използвани в qRT-PCR за gapdh (избран като референтен ген), бяха: преден 50 - GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-30 и обратен 50 -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-30. Производството на правилния ампликон се оценява чрез оценка на кривата на топене. Всяка биологична проба се провежда в три екземпляра с реагент SYBR green IQ (Bio-Rad Laboratories, Милано, Италия) и с помощта на системата за откриване CFX Connect (Bio-Rad Laboratories, Милано, Италия).

4.10. Количествена оценка на невронната морфология

Невронната морфология в N1E-115 клетки беше оценена чрез заснемане на изображения с обърнат микроскоп. Морфометричният анализ беше извършен чрез софтуера ImageJ за Windows и бяха оценени общият брой клетки (изразени като процентна вариация на контролата), средната дължина на неврит (изразена като процент от контролата) и клетките, носещи неврит. За клетките, носещи неврит, процентът се изчислява чрез разделяне на броя на диференцираните клетки на общия брой клетки на поле. N1E-115 бяха диференцирани деви, когато имаха поне един неврит a с дължина, равна или по-голяма от диаметъра на сомата. Морфологичната оценка е извършена на най-малко пет независими експеримента, в които са анализирани най-малко три изображения.

4.11. Статистически анализ

Всички резултати, представени в това проучване, са изразени като средно ± SD (нормалното разпределение на стандартното отклонение на данните е проверено с помощта на теста на Shapiro-Wilk. Когато са сравнени две експериментални групи, са приложени несдвоени тестове. Въпреки това, когато три или повече групи бяха сравнени, беше използван еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от post hoc тест на Tukey.Относно експериментите с ротенон, където присъстваха две променливи, беше използван двупосочен ANOVA, последван от пост-тест на Bonferroni. p < 0.05 се считат за статистически различни Статистическият анализ е извършен с помощта на GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, USA) за Windows.

Авторски принос:

Концептуализация, MS; методология, МС и МК; валидиране, MS и MC; формален анализ, MS, MC, DP и MP; разследване, MC, NM, LL, MP и DP; ресурси, MS и VP; обработка на данни, MS и MC; писане—изготвяне на оригинална чернова, MS и MC; писане—преглед и редакция, MP, LL, DP, NM и VP; визуализация, MS, MC и MP; надзор, MS; администриране на проекти, MS; придобиване на финансиране, MS Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране:

Това изследване е финансирано от Funds for Departmental Research 2021 (Университет на Молизе) за MS и от покана на фондация Jerome Lejeune за сесия за безвъзмездни средства 2021a, #2043 за MS

Изявление на институционалния съвет за преглед:

Не е приложимо.

Декларация за информирано съгласие:

Не е приложимо.

Декларация за наличност на данни:

Не е приложимо.

Благодарности:

Благодарим на Клаудия Тонини за помощта при изследването на холестерола

Конфликти на интереси:

Авторите декларират липса на конфликт на интереси.

Препратки

1. Бьоркхем, И.; Meaney, S.; Fogelman, AM Мозъчен холестерол: дълъг таен живот зад бариера. Артериосклер. Thromb. Vasc. Biol. 2004, 24, 806–815. [CrossRef] [PubMed]

2. Колардо, М.; Мартела, Н.; Pensabene, D.; Ситени, С.; Ди Бартоломео, С.; Палотини, В.; Сегато, М. Невротрофините като ключови регулатори на клетъчния метаболизъм: Последици за хомеостазата на холестерола. Вътр. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5692. [CrossRef] [PubMed]

3. Гориц, С.; Mauch, DH; Pfrieger, FW Множество механизми медиират индуцираната от холестерол синаптогенеза в неврон на ЦНС. Mol. клетка. Neurosci. 2005, 29, 190–201. [CrossRef] [PubMed]

4. Pfenninger, KH Разширяване на плазмената мембрана: херкулесовата задача на неврона. Нац. Rev. Neurosci. 2009, 10, 251–261. [CrossRef]

5. Такамори, С.; Холт, М.; Стениус, К.; Lemke, EA; Grønborg, M.; Riedel, D.; Urlaub, H.; Schenck, S.; Брюгер, Б.; Ringler, P.; et al. Молекулярна анатомия на органел за трафик. Cell 2006, 127, 831–846. [CrossRef] [PubMed]

6. Сузуки, С.; Кийосуе, К.; Хазама, С.; Огура, А.; Кашихара, М.; Хара, Т.; Koshimizu, H.; Kojima, M. Невротрофичен фактор, получен от мозъка, регулира метаболизма на холестерола за развитие на синапса. J. Neurosci. 2007, 27, 6417–6427. [CrossRef]

7. Сегато, М.; Leboffe, L.; Трапани, Л.; Pallottini, V. Неуспех на хомеостазата на холестерола в мозъка: Последици за синаптичната дисфункция и когнитивен спад. Curr. Med. Chem. 2014, 21, 2788–2802. [CrossRef] [PubMed]

8. Джеске, DJ; Dietschy, JM Регулиране на скоростите на синтеза на холестерол in vivo в черния дроб и трупа на плъх, измерен с помощта на [3H] вода. J. Lipid Res. 1980, 21, 364–376. [CrossRef]

9. Pfrieger, FW; Ungerer, N. Метаболизъм на холестерола в неврони и астроцити. Прог. Lipid Res. 2011, 50, 357–371. [CrossRef]

10. Ниевег, К.; Schaller, H.; Pfrieger, FW Маркирани разлики в синтеза на холестерол между неврони и глиални клетки от постнатални плъхове. J. Neurochem. 2009, 109, 125–134. [CrossRef]

11. Oram, JF; Heinecke, JW ATP-свързващ касетен транспортер A1: Клетъчен износител на холестерол, който предпазва от сърдечно-съдови заболявания. Physiol. Rev. 2005, 85, 1343–1372. [CrossRef]

12. Pfrieger, FW Аутсорсинг в мозъка: Зависят ли невроните от доставката на холестерол от астроцитите? BioEssays 2003, 25, 72–78. [CrossRef]

13. Кристоферсън, Канзас; Улиан, ЕМ; Стокс, CCA; Mullowney, CE; По дяволите, JW; Ага, А.; Lawler, J.; Mosher, DF; Bornstein, P.; Barres, BA Тромбоспондините са протеини, секретирани от астроцити, които насърчават синаптогенезата на ЦНС. Cell 2005, 120, 421–433. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com