Никотинът изостря предизвиканото от такролимус бъбречно увреждане чрез програмирана клетъчна смърт
Mar 23, 2022
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ю Джи Джианг, Шенг Куй, Кан Луо, Джун Дин
ВЪВЕДЕНИЕ
Въпреки откриването на нови имуносупресори, такролимус (TAC) остава крайъгълният камък на имуносупресивните режими при трансплантация на твърди органи. Въпреки това, дългосрочната употреба на TAC увеличава риска от неблагоприятни ефекти (напр. нефротоксичност, невротоксичност, инфекции, злокачествени заболявания, диабет и стомашно-чревни оплаквания) [1]. Сред тях острибъбрекнараняванеили хронична TAC нефротоксичност е докладвана при 46 процента от реципиентите на белодробна трансплантация [2] и 22,4 процента от реципиентите на бъбречна трансплантация [3]. Докато е остърбъбрекнараняванесе счита за обратима след намаляване на дозата TAC или пълно спиране, хроничната нефротоксичност, която води до загуба на алографт, е необратима. Хроничната нефротоксичност на TAC се характеризира с гломерулопатия, хиалиноза на аферентни артериоли и ивична тубулоинтерстициална фиброза (TIF) [4]. Въпреки че точният механизъм на тази клинична дилема остава неизвестен, наскоро демонстрирахме, че възникналото от оксидативен стрес възпаление, трансформиращият растежен фактор 1 (TGF- 1) и програмираната клетъчна смърт могат да бъдат важни играчи [5]. Пушенето на цигари е критично предизвикателство за общественото здраве и финансово бреме за обществото, което намалява качеството на живот. Епидемиологичните доклади показват, че в момента има повече от един милиард пушачи на цигари по света и шест милиона смъртни случая годишно поради употребата на тютюн. Тези проценти се увеличават, особено в развиващите се или неразвитите страни [6]. Добре известно е, че пушенето на цигари е рисков фактор за различни видове рак, сърдечно-съдови събития (инфаркт на миокарда и инсулт) и обструктивни белодробни заболявания. В бъбреците тютюнопушенето увеличава тежестта на бъбречната дисфункция при пациенти с диабет, хипертония, поликистозабъбрекзаболяване, и след бъбречна трансплантация [7]. Нещо повече, тютюнопушенето може да причини ново бъбречно увреждане дори при здрава популация без предшестващо хронично бъбречно заболяване (CKD) [8]. Това проучване има за цел да оцени: (1) далиникотин(NIC), основен токсичен компонент на пушенето на цигари, влошава TAC-индуцираното бъбречно увреждане; и ако е така, (2) кой механизъм отчита NIC(никотин)-ускорена нефротоксичност.
cistanches herba може да облекчи бъбречната функция
РЕЗУЛТАТИ
Ефект на NIC(никотин)по основни параметри
Таблица 1 очертава ефектите от NIC(никотин)по основни параметри в експерименталните групи. И двете NIC(никотин)и TAC повишава UV (полиурия), което допълнително се увеличава от NIC(никотин)и TAC лечение. Нито NIC(никотин)нито TAC предотврати загубата на BW. Екскрецията на протеин в урината, Scr, BUN и Cys-C са значително по-високи и в двата NIC(никотин)и TAC групи в сравнение с VH групата; тези нива се повишават допълнително с комбинацията от двете лекарства, което предполага, че NIC(никотин)ускорява TAC-индуцираната бъбречна дисфункция. Няма значителни разлики в SBP между групите. Четириседмично лечение с TAC повишава концентрацията на TAC в кръвта до 11.0±og ng/mL, докато NIC(никотин) did not influence blood TAC concentration(12.8±15 ng/mL,p>o.o5 срещу TAC). В допълнение, третирането на нормални плъхове с NIC(никотин)в резултат концентрацията на котинин в серума и урината се увеличава съответно с 56,5±17 ng/mL и 8,6±192,6 ug/ден. Тези концентрации на котинин в серума и урината имитират тези, наблюдавани при хора, които са активни пушачи [13].
Таблица 1. Ефект на NIC(никотин)по функционални параметри
Ефект на NIC(никотин)върху хистопатологията при хронична TAC нефротоксичност
Хроничната TAC нефротоксичност се характеризира с уникални хистологични характеристики, включително ивичеста TIF и гломерулопатия. Чрез хистологично оцветяване и електронна микроскопия открихме, че причиненото от TAC гломерулно увреждане се проявява чрез удебеляване на гломерулния фундамент и изтриване на процесите на подоцитните крака (фиг. IA, IC и D), това може да се свърже с повишена екскреция на протеин в урината. При количествени анализи и двете NIC(никотин)и TAC повишава фракционната мезангиална площ, с по-нататъшно увеличение, наблюдавано в NIC(никотин)и TAC група. Основните промени в хроничната TAC нефротоксичност са ограничени до тубулоинтерстициални области, както е очертано от тубулоинтерстициално фиброзно отлагане, тубулна атрофия и ивичеста фиброза (Фиг. 1B, 1E и F). Цифрите ясно показват, че TIF резултатът в NIC(никотин)плюс TACgroup беше по-висок, отколкото в която и да е NIC(никотин)група или TACgroup.
Фигура 1. Представителни микроснимки на периодна киселина-Шиф (PAS)(A), Masson trichrome (B), трансмисионна електронна микроскопия (CF) и количествен анализ на гломерулно увреждане и тубулоинтерстициална фиброза (TIF); (C) удебеляване на гломерулната базална мембрана (стрелки); (D) заличаване на подоцитно стъпало процеси (стрелки); (E) подуване на тубулоинтерстициума и екстензивно отлагане на колаген (разпръснати); (F) атрофирани тубули (стрелки). VH, носител; NIC(никотин), никотин; TAC, такролимус. стр
Ефект на NIC(никотин)върху експресията на профибротични цитокини при хронична TAC нефротоксичност
Настоящото проучване има за цел да сравни експресията на профибротичния цитокин TGF- 1 и CTGF и компонента на извънклетъчния матрикс (ECM) на ig-h; между експерименталните групи. В съответствие с констатациите на TIF, NIC(никотин)увеличена TAC-индуцирана свръхекспресия на профибротичен TGF- 1и CTGF и ECM ig-h3 (фиг.2)
Фигура 2. Представителни микроснимки на имуноблотинг анализза (A) трансформиращ растежен фактор 1 (TGF-B1), (B TGF- -индуциран ген-h( ig-h3) и (C) фактор на растеж на съединителната тъкан (CTGF). Представени са стойности за експресия на протеин използвайки групата на носителя (VH) като 100% референтна стойност и нормализирана към -актин.NIC(никотин), никотин;TAC, такролимус. 3т
Ефект на NIC(никотин)върху възпаление при хронична TAC нефротоксичност
За да определим ефекта на NIC върху възпалението при TAC-индуцирано бъбречно увреждане, ние изследвахме експресията на провъзпалителни медиатори и свързани с пироптоза гени чрез имуноблотинг и имунохистохимия. Фиг. 3 показва, че лечението с TAC повишава експресията на свързаните с пироптоза цитокини (ⅡL-1, IL-18 и NLRP3) и MCP-1, което води до ED-1-положителен клетъчна инфилтрация и по-нататъшни увеличения бяха открити чрез комбинирано лечение на NIC(никотин)и TAC.
Фигура 3. Представителни микроснимки на имунохистохимия за ектодермална дисплазия-1 (ED-1)(A) и имуноблотинг анализ за провъзпалителни цитокини (B). VH, МПС; NIC(никотин), никотин; TAC, такролимус; MCP-1, моноцит хемотаксичен протеин-1;IL, интерлевкин; NLRP3, NOD-подобен рецепторен протеин, съдържащ пиринов домен3. стр
Ефект на NIC(никотин)върху оксидативния стрес при хронична TAC нефротоксичност
Както е показано на фиг.4, хроничен(никотин)Лечението с TAC е тясно свързано с дисбаланс между оксидантните и антиоксидантните ензими [12,14. Имуноблотинг анализът показа, че NIC повишава TAC-индуцираната експресия на NOX-2 и NOX-4, но потиска експресиите на SOD1 и SOD2. В допълнение, серумните и уринарните нива на 8-OHdG, маркер за оксидативен стрес, са били по-високи в групите NIC и TAC в сравнение с групата VH и най-високи в групата NIC плюс TAC. Тези открития предполагат синергичен ефект на NIC и TAC върху оксидативния стрес в този модел.
Фигура 4. Представителни микроснимки на имуноблотинг анализ на серия от свързани с оксидативен стрес протеини (A) и серум (B) и урина (C)Концентрации на 8-хидрокси-2'-деоксигуанозин (8-OHdG). VH, МПС; NIC(никотин), никотин; TAC, такролим; SOD, супероксиддисмутаза; NOX, NADPH оксидаза. Bp
Ефект на NIC(никотин)върху програмираната клетъчна смърт при хронична TAC нефротоксичност
Програмираната клетъчна смърт тип I (апоптоза) или тип II (аутофагия) участва в патогенезата на хронично TAC-индуцирано бъбречно увреждане [1s]. Използвайки TUNEL анализ, ние наблюдавахме, че повечето TUNEL-позитивни клетки или апоптотични тела са локализирани в тубулни епителни клетки и интерстициални васкуларни ендотелни клетки, където тубулната атрофия и типичният TIF прогресират (Фигура 5A). Количественият анализ показа, че и двете NIC(никотин) и TAC значително повишава TUNEL-положителните клетки в сравнение с VH групите; това е по-изразено в групата NIC плюс TAC. На молекулярно ниво добавянето на NIC(никотин)при плъхове, третирани с TAC, е довело до значителна дисрегулация на Bcl-2/Bax и експресията на разцепена каспаза-3 към клетъчна смърт (фиг. 5B). В допълнение, електронната микроскопия показа, че лечението с TAC индуцира обилно образуване на автофагични отделения, като първоначални автофагични вакуоли (AVi), деградативни автофагични вакуоли (Avd) и митофагия (форма на селективна аутофагия) в NIC, TAC и NIC плюс TAC групи (фиг. 6). Количественият имуноблотинг разкрива, че свръхекспресията на протеини p62, LC3B, PINK1 и Parkin, наблюдавани в третирани с TAC бъбреци на плъх, е допълнително увеличена с NIC (Фиг. 6G и 6H).
Фигура 5. Представителни фотомикрографии на TdT-медииран dUTP-биотин анализ за маркиране в края на никнеца (TUNEL)(A) и имуноблотинг анализ за гени, контролиращи апоптоза (B).никотинлечението увеличава TUNEL-позитивните клетки (стрелки) в бъбреците на плъх, третирани с такро-лимус. VH, носител; NIC(никотин)никотин; TAC, такролимус; Bcl, В-клетъчен лимфом; Bax, Bcl2-свързан X. p
Ефект на NIC(никотин)върху митохондриалната дисфункция при хронична TAC нефротоксичност
Чрез трансмисионна електронна микроскопия ясно забелязахме, че и двете NIC(никотин)и TAC унищожават митохондриалните архитектури, както е илюстрирано от намален размер и брой на митохондриите, дезорганизирани кристи, вакуолизация, сливане, образуване на митофагия и митохондрии, разделени на две или три дъщерни органели, делене) (фиг.6). Резултатите от количествения анализ показаха, че NIC(никотин) лечението допълнително намалява броя и размера на митохондриите в сравнение само с лечението с NIC или TAC. Имуноблотинг анализът разкри, че дисрегулацията на свързани с митохондриите протеини (OPA1 и Drpi), индуцирана от Nicor TAC, се влошава от съвместното прилагане на NIC и TAC (фиг. 6).
Фигура 6. Представителни трансмисионни електронни микрографии на автофагия и митохондриална морфология(AF), имуноблотинг анализ (G, H) и количествено определяне на броя и размера на митохондриите във всяка група за лечение. (A) Образуване на автофагия в бъбреците на такролимус (TAC) и/илиникотин(NIC) третирани плъхове (стрелка); (B) автофагично отделение, съдържащо митохондрии бъбреците на „TAC и/или NIC(никотин)третирани плъхове (митофагия, стрелка); (C) нормални митохондрии; (D) намален брой митохондрии в бъбреците на TAC и/или NIC(никотин)третирани плъхове; (E) митохондриално сливане, наблюдавано в бъбреците на третирани с TAC и/или NIC плъхове (кръг); (F) митохондрия, разделена на два или повече дъщерни органела в бъбреците на третирани с TAC и/или NIC плъхове (делене, кръг) . VH, носител; LC3B, лека верига 3B; PINK1, фосфат и тензионен хомолог, изтрит върху индуцирана от десета хромозома киназа 1; OPA, протеин на оптична атрофия; Drp, протеин, свързан с динамин.p
физетинотноснобъбрек
Ефект на NIC(никотин)върху стреса на ендоплазмения ретикулум при хронична TAC нефротоксичност
Както е показано на Фигура 7, Nicor TAC индуцира дегранулация на рибозоми, разединени и разширени цистерни и вакуолизация на пероксизома в грубия ендоплазмен ретикулум (ER), докато гладката ER структура остава почти нормална (Фигура 7B). Имуноблотинг анализът разкрива, че или NIC(никотин)или TAC повишава експресията на ER гени, свързани със стреса, включително CHOP, Bip, IRE-1 и ATF-6, но тяхната експресия е допълнително увеличена от комбинацията от двете (фиг.7C).
Фигура 7. Представителни фотомикрографии на трансмисионна електронна микроскопия (A, B) и имуноблотинг анализ на гени, свързани със стреса на ендоплазмения ретикулум (ER) (C).(A) Нормална груба ER (стрелки); (B) дегранулация на рибозоми, разединени и разширени цистерни и дилатация на везикулите на груба ER вникотин(NIC) и/или такролимус(TAC)-третиран бъбрек на плъх. VH, носител; CHOP, C/EBP хомоложен протеин; Bip, свързващ имуноглобулинов протеин; IRE-1c, протеин, изискващ инозитол-1c; ATF, активиращ транскрипционен фактор. стр< o.01="" vs.vh,="">
ДИСКУСИЯ
Пушенето на цигари е важен модифицируем рисков фактор за прогресията на ХБН както при здрави популации, така и при пациенти със съпътстващи заболявания (напр. диабет, хипертония). Клиничните проучвания показват, че пушенето на цигари увеличава отделянето на албумин в урината и влияе неблагоприятно на бъбречната функция [16]; в допълнение, спирането на тютюнопушенето може да подобри протеинурията при пациенти с ХБН и диабет тип 2 и да забави прогресията до краен стадий на бъбречно заболяване[1-,18]. Освен това тютюнопушенето на реципиента или донора допринася за епизоди на отхвърляне и хронична алографтна нефропатия, което води до загуба на алографт при бъбречна трансплантация [19,2o]. Тези вредни ефекти от тютюнопушенето (NIC(никотин)) са отразени от проучвания върху модели на гризачи на s/6 нефректомия [2al и диабетна нефропатия [o]. В настоящото проучване открихме, че NIC(никотин)влошена TAC-индуцирана фракционна мезангиална област и TIF. Тези патологични промени водят до по-изразено увреждане на бъбречната функция и засилване на отделянето на протеини в урината. Въз основа на тези резултати и други доклади предполагаме, че пушенето на цигари може да ускори загубата на бъбречен алографт при реципиенти на трансплантант, които получават имуносупресори на базата на TAC.
Възпалението играе централна роля в еволюцията на хроничната TACнефротоксичност, тъй като то предшества продължаващия бъбречен белег. Повишените провъзпалителни медиатори в отговор на увреждащи стимули могат да набират възпалителни клетки, които от своя страна свръхекспресират провъзпалителни и профибротични цитокини като хемоатрактанти, адхезионни молекули и TGF- 1. Наскоро демонстрирахме, че NLRP3-зависимата и независимата инфламазома участват в патогенезата на хроничната TAC нефротоксичност [s]. Нашите резултати показват, че администрирането на NIC(никотин)при плъхове, третирани с TAC, усилва експресията на гени, свързани с пироптоза (NLRP3, IL-1 и I-18), провъзпалителни медиатори MCP-1 и профибротични цитокини TGF- и CTGF, водещи до прекомерен приток на ED-1-позитивни клетки и повишена регулация на ig-h; тези отговори отразяват тежестта на гломерулните и тубулните увреждания. Нашите открития са в съответствие с тези на Arany et al [22] и Agarwal et al [23], които показват ефектите на NIC върху бъбречно възпаление и фиброза.
Въпреки че NIC(никотин)-базираната екзацербация на хроничната TAC нефротоксичност в този модел може да бъде многофакторна, вероятно е свързана с въздействието на оксидативния стрес. Добре известно е, че хроничното лечение с TAC е тясно свързано с хипоксия, свързана с аферентна артериолопатия, която впоследствие се свързва с оксидативен стрес, който от своя страна активира профибротична свръхекспресия на TGF- 1, водеща до фиброза. Тази конструкция е подкрепена от наблюдението, че антиоксидантните терапии (напр. коензим Q10) намаляват експресията на TGF- 1 и TIF чрез запазване на целостта на митохондриите при хронична TAC нефротоксичност 24]. Наскоро огромни доказателства от in vitro проучвания демонстрират взаимовръзка между хроничната експозиция на NIC и оксидативния стрес при различни бъбречни увреждания [o,25,26. Тук открихме, че NIC повишава нивата на 8-OHdG в серума и урината и увеличава експресията на окислителен протеин, като същевременно потиска експресията на антиоксидантен протеин, като по този начин повишава индуцирания от TAC оксидативен стрес, както и фиброзата. Наистина, влошаването на NIC на лекуваните с TAC бъбреци в това проучване може да се дължи на оксидативния стрес.
Cistanche еректилна дисфункция
Възможно е също апоптозата (програмирана клетъчна смърт от тип I) и аутофагията (програмирана клетъчна смърт от тип II) да участват в NIC(никотин)-ускорена хронична TAC нефротоксичност. Както беше илюстрирано по-горе, NIC директно индуцира апоптоза на клетките на подоцитите и бъбречните проксимални тубули [27,28]; той също индиректно индуцира апоптотична клетъчна смърт чрез оксидативен стрес[2g] или активиране на TGF- 1[22].NIC(никотин)може също да индуцира аутофагия в звездовидни клетки на панкреаса Bo], сърдечни миоцити на новородени мишки 31] и клетки на гладката мускулатура на съдовете 32]. По този начин оксидативният стрес и програмираната клетъчна смърт са взаимосвързани. Използвайки TUNEL анализ и електронна микроскопия, ние ясно наблюдавахме, че NIC значително увеличава броя на TUNEL-позитивните клетки в тубулните епителни клетки, интерстициалните васкуларни ендотелни клетки и автофагичните отделения в третирани с TAC бъбреци на плъх. Тези морфологични промени бяха придружени от дисрегулация на гени, свързани с апоптоза или автофагия в бъбреците на плъхове, което води до клетъчна смърт. Тези кумулативни доказателства предполагат, че NIC(никотин)сам по себе си не само предизвиква оксидативен стрес и програмирана клетъчна смърт, но също така насърчава неблагоприятния ефект на TAC върху бъбреците, водещ до бъбречна дисфункция и архитектурни увреждания, както беше съобщено по-рано в модели на индуцирана от стрептозотоцин (STZ) диабетна нефропатия [o] и ХБН ( s/6 нефректомия) B3].
В допълнение, вътреклетъчните органели, породени от оксидативен стрес, като митохондриална дисфункция и ER стрес, играят критична роля в целостта на хроничната нефротоксичност на TAC, предизвикват ER стрес и нарушават регулацията на митохондриалните и ER стрес-контролиращи гени и ефектите се влошават от комбинирано лечение с двете . По този начин влошаването на митохондриалната годност и ER стресът могат да обяснят ефекта на NIC(никотин) при TAC-индуцирано бъбречно увреждане
Нашето проучване разкри, че NIC(никотин)при доза от 15 mg/kg влошава TAC-индуцираното бъбречно увреждане чрез оксидативен стрес, възпаление и програмирана клетъчна смърт, в съответствие с предишни проучвания [27,37,38]. Други обаче са наблюдавали противоположни констатации. Sadis et al.Bg] показват, че NICat доза от 0,5 mg/kg предпазва бъбрека от исхемия/реперфузионно увреждане чрез холинергичния противовъзпалителен път. Друго проучване на Agarwal et al.[23] съобщава, че дългосрочно перорално лечение с NIC(никотин)(28 седмици) придава ренопротективни ефекти при плъх модел на спонтанна протеинурия (плъхове Munich-Wistar-Frömter). Причините за това несъответствие в ролята на NIC върху бъбреците са неизвестни, но може да зависят от дозата на NIC, продължителността на лечението с лекарството или модела на гризач. Необходими са допълнителни проучвания за разрешаване на тези проблеми. Това проучване ясно демонстрира, че NIC изостря TAC-индуцираното бъбречно увреждане при плъх модел на хронична TAC нефротоксичност. Влошаването на оксидативния стрес и програмираната клетъчна смърт може да бъде един механизъм, който е в основата на вредните ефекти на NIC. Нашите констатации дават по-добра представа за въздействието на тютюнопушенето сред реципиентите на трансплантация.
cistamche във функцията на бъбреците
ПРЕПРАТКИ
1. Bentata Y. Такролимус: 20 години употреба при трансплантация на бъбрек при възрастни: какво трябва да знаем за неговата нефротоксичност. Изкуствени органи 202044140-152.
2. Sikma MA, Hunault CC, van de Graaf EA, et al. Високи концентрации на такролимус в кръвта рано след белодробна трансплантация и риск от увреждане на бъбреците. Eur J Clin Pharmacol 201773:573-58o.
3. Yagisawa T, Omoto K, Shimizu T, Ishida H, Tanabe K. Артериосклерозата при нулева биопсия е рисков фактор за индуцирана от такролимус хронична нефротоксичност. Нефрология (Carlton)201s;2o Suppl2:s1-57.
4. Nankivell BJ, P'Ng CH, O'Connell PJ, Chapman JR. Нефротоксичност на инхибитора на калциневрин през лещата на надлъжната хистология: сравнение на епохите на циклоспорин и такролимус. Трансплантация 2016;1oo:1723-171.
5. Lim SW, Shin Y, Luo K, et al. Ефект на Klotho върху клирънса на автофагията при индуцирано от такролимус бъбречно увреждане. FASEB J 2o193:2694-2706.
6. Lim SS, Vos T, Flaxman AD, et al. Сравнителна оценка на риска от тежестта на заболяването и нараняването, дължаща се на 67 рискови фактора и групи рискови фактори в 21 региона, 199o-201o:систематичен анализ за Global Burden of Dis-ease Study 201o.Lancet 2o12;38o:2224-226o.
7. Formanek P, Salisbury-Afshar E, Afshar M. Подпомагане на пациенти с ESRD и по-ранни стадии на CKD да спрат да пушат. Am J Kidney Dis 2018; 72: 255-266.
8. Джайн Г, Джеймс Е.А.никотинсигнализиране и прогресиране на хронично бъбречно заболяване при пушачи. Biochem Pharmacol 2013;861215-1223.
9. Zhang LY, Jin J, Luo K и др. Shen-Kang предпазва от индуцирано от такролимус бъбречно увреждане. Korean JIntern Med 2019341078-1090.
10. Ibrahim ZS, Alkafafy ME, Ahmed MM, Soliman MM. Ренопротективен ефект на куркумин срещу комбинирания оксидативен стрес от диабет иникотинпри плъхове. Mol Med Rep 2016; 13:3O17-3026.