Norwogonin отслабва индуцирания от хипоксия оксидативен стрес и апоптоза в PC12 клетки

За повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Резюме

Предистория: Norwogonin е естествен флавон с три фенолни хидроксилни групи в скелетна структура и има отличниантиоксидантна активност. Въпреки това, невропротективният ефект на норвогонин остава неясен. Тук изследвахме защитния капацитет на норвогонин срещу окислително увреждане, предизвикано от хипоксия в PC12 клетки. Методи: Клетъчната жизнеспособност и апоптозата бяха изследвани съответно чрез МТТ анализ и оцветяване с Анексин V-FITC/PI. Съдържанието на реактивни кислородни видове (ROS) се измерва с помощта на DCFH-DA анализ. Лактат дехидрогеназа (LDH), малондиалдехид (MDA) иантиоксидантен ензимнивата бяха определени с помощта на търговски комплекти. Експресията на свързани гени и протеини се измерва съответно чрез количествена PCR в реално време и Western blotting. Резултати: Открихме, че норвогонинът облекчава увреждането, предизвикано от хипоксия в PC12 клетките, като повишава жизнеспособността на клетките, намалява освобождаването на LDH и подобрява промените в клетъчната морфология. Norwogonin също действа катоантиоксидантntчрез пречистване на ROS, намаляване на производството на MDA, поддържане на активността на супероксид дисмутаза (SOD), каталаза (CAT) и глутатион пероксидаза (GPx) и намаляване на нивата на експресия на HIF-1 и VEGF. В допълнение, вогонин предотвратява клетъчната апоптоза чрез инхибиране на нивата на експресия на каспаза-3, цитохром c и Bax, като същевременно повишава нивата на експресия на Bcl-2 и съотношението на Bcl-2/Bax. Заключения: Norwogonin отслабва предизвиканото от хипоксия увреждане в PC12 клетки чрез охлаждане на ROS, поддържане на активността на антиоксидантните ензими и инхибиране на пътя на митохондриалната апоптоза.

Ключови думи: Norwogonin,Антиоксидантна активност, хипоксия, оксидативен стрес,апоптоза

Заден план

Аеробните организми се нуждаят от кислород (O2) за производство на енергия. Хипоксията се дефинира като недостатъчно снабдяване с O2 за поддържане на клетъчната функция в тъканта и често се появява в някои физиологични ситуации като голяма надморска височина [1] и в много патологични ситуации като инсулт [2]. Мозъкът е особено чувствителен към увреждане, предизвикано от хипоксия, поради високата си консумация на кислород, богат на ненаситени мастни киселини и нискаантиоксидантен капацитет[3]. Все повече доказателства сочат, че хипоксията може да предизвика неблагоприятни ефекти върху мозъка [4–6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia и Huiping Ma

Катедра по фармация, 940-та болница за съвместна логистична поддръжка на PLA, Ланджоу 730050, Гансу, Китай

Оксидативният стрес и апоптозата се считат за два фактора, допринасящи за увреждането, предизвикано от хипоксия [7, 8]. Съобщава се, че излагането на хипоксия увеличава производството на вътреклетъчни реактивни кислородни видове (ROS), което улеснява оксидативния стрес. Прекомерното ROS, като супероксиден анион (O2−˙), водороден пероксид (H2O2) и хидроксилен радикал (HO•), води до структурни и функционални клетъчни промени чрез атакуване на липиди, мембрани, протеини и ДНК и впоследствие причинява увреждане на клетките [ 9].

Щракнете за cistanche NZ за антиоксидант

Едновременно с това, свръхпроизведеният ROS също улеснява отварянето на порите за преход на митохондриална пропускливост (mPTP) [10] и прехвърлянето на проапоптозни протеини към външната митохондриална мембрана, което индуцира деполяризация на митохондриалните мембрани и освобождаване на цитохром c [11]. Тези промени в крайна сметка причиняват зависима от митохондриите апоптоза [12]. И така, смята се, че антиоксидантите със способността да инхибират или елиминират прекомерната ROS могат да упражнят своя защитен ефект чрез отслабване на оксидативния стрес и апоптоза, предизвикана от хипоксия. Много проучвания са доказали, че антиоксидантни добавки като витамин С [13], изофлавон [8] и нитроксидни радикали [14] могат да ограничат увреждането, предизвикано от хипоксия in vitro и in vivo. Флавоноидите са голям и разнообразен клас от вездесъщи растителни вторични метаболити. Те винаги се считат за отличен естествен антиоксидант със способността да улавят свободните радикали и да инхибират липидната пероксидация.

Понастоящем се обръща все повече внимание на този клас съединения поради благоприятното им въздействие върху човешкото здраве. Доказано е, че флавоноидите притежават широк спектър от фармакологични действия, като противовъзпалителна, антиноцицептивна и невропротективна активност и т.н., всички от които могат да се припишат на тяхната антиоксидантна активност [15]. Много проучвания показват, че флавоноидите проявяват отлични защитни ефекти при неуспех, предизвикан от хипоксия. Например, рутинът има силен невропротективен ефект срещу смъртта на ганглийните клетки на ретината, предизвикана от хипоксия [16]. Скорошно проучване също демонстрира, че рутинът може да облекчи увреждането на хипоксията, причинено от кобалтов хлорид, чрез инхибиране на оксидативния стрес и апоптозата в клетките H9c2 [17]. Освен това, Liu et al предполагат, че нобилетин (3',4',5,6, 7,8-хексаметокси флавон) отслабва миокардното I/R увреждане чрез активиране на Akt/GSK-3 пътя в H9c2 клетка [18]. В допълнение, акацетинът може да защити кардиомиоцитите на плъхове и H9C2 кардиомиобластите срещу увреждане, предизвикано от хипоксия/реоксигенация чрез AMPK-медиирано активиране на Nrf2 сигналния път [19].

Norwogonin (5,7,8-трихидрокси флавон, фиг. 1) е фармакологично активен флавон, отделен от корена на Scutellaria baicalensis Georgi ("Huang Qin" на китайски), традиционна китайска билка, използвана за лечение на грип и рак [20, 21]. Въпреки това са докладвани ограничени проучвания за биологичната активност на норвогонин поради ниските му нива в естествените растения. За да се отговори на този проблем, се съобщава за няколко метода за синтез на норвогонин [22, 23].

Предишното ни проучване също установи прост метод за получаване на норвогонин от кризин в четири стъпки [24]. Тези изследвания повлияха положително на по-нататъшната оценка на биологичната активност на норвогонин. Проучванията разкриват, че норвогонинът притежава антиоксидантна [25], противоракова [26, 27], антивирусна [28] и антимикробна активност [29], както и инхибира стимулираното от цианид производство на ROS [30]. Въпреки това, дали норвогонинът има защитни способности срещу увреждане, предизвикано от хипоксия, остава неизвестно. Целта на настоящото изследване беше да се изследват защитните ефекти на норвогонин срещу индуциран от хипоксия оксидативен стрес и апоптоза в PC12 клетки.

Методи

Материали и реактиви

Norwogonin (чистота по-голяма или равна на 98 процента) беше синтезиран съгласно нашия докладван по-рано метод [24]. Рутин (чистота по-голяма или равна на 96 процента) е закупен от Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd. (Xian, Shannxi, Китай). Норвогонин и рутин се разтварят в стерилен диметилсулфоксид (DMSO), съхраняват се при -20 градуса и се разреждат в средата за клетъчна култура непосредствено преди употреба. Модифицираната среда на Eagle на Dulbecco (DMEM), фетален говежди серум (FBS), стрептомицин и пеницилин бяха закупени от Solarbio co., Ltd. (Пекин, Китай).

Комплектите от малондиалдехид (MDA), лактат дехидрогеназа (LDH), супероксид дисмутаза (SOD), каталаза (CAT) и глутатион пероксидаза (GPx) бяха получени от Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Jiangsu, Китай). 2',7'-дихлорид-хидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA) и (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5- дифенилтетразолий бромид) тетразолий (МТТ) е получен от Sigma-Aldrich Co (Сейнт Луис, МО, САЩ). Първични антитела за индуцируем от хипоксия фактор-1 (HIF-1), съдов ендотелен растежен фактор (VEGF), В-клетъчен лимфом-2 (Bcl-2), Bcl{{17 }} свързан X протеин (Bax), каспаза-3, цитохром С и -актин всички бяха закупени от Abcam (Кеймбридж, Обединеното кралство). Вторичните антитела бяха получени от ZsBio Company (Пекин, Китай).

Комплект за анализ на апоптозата беше получен от Института по биотехнологии Beyotime (Jiangsu, Китай). Всички химикали и разтворители са с аналитичен клас и са получени от търговски доставчик в Китай. Клетъчна култура PC12 клетките са закупени от Cell Bank на Китайската академия на науките (TCR 9, Шанхай, Китай) и се поддържат в DMEM с 10 процента (v/v) FBS, 100 U/mL пеницилин и 100 U/mL стрептомицини при 37 градуса във влажен инкубатор, съдържащ 5 процента CO2. За да се оцени цитотоксичността на норвогонин, PC12 клетки (пасаж 4 ~ 6) бяха предварително инкубирани с различни концентрации (10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4 mol/L) на норвогонин за 1 час и след това се култивират за 24 часа. Експозиция на хипоксия За да се предизвика модел на увреждане на клетъчна хипоксия, PC12 клетките бяха подложени на среда с хипоксия (1% O2, 5% CO2 и 94% N2) при 37 градуса за 24 часа във влажна камера. Нормоксичните контролни клетки се култивират при 37 градуса в 5% CO2 инкубатор за 24 часа.

За да се оцени защитният ефект на норвогонин срещу увреждане, предизвикано от хипоксия, PC12 клетките бяха предварително инкубирани с различни концентрации (10- 8, 10- 7, 10- 6, 10- 5 mol/ L) на норвогонин за 1 час преди лечението с хипоксия. Жизнеспособност на клетките Жизнеспособността на клетките се измерва чрез МТТ анализ, както е описано по-горе [31]. Накратко, PC12 клетки (1 × 105 клетки/mL) се посяват в 96-ямкови плаки за култура. След това към ямките се добавят различни концентрации на норвогонин. Към контролните ямки се добавя равен обем DMSO. Крайната концентрация на DMSO в средата за клетъчна култура е 0,1 процента. След инкубиране при нормоксични или хипоксични условия, към всяка ямка се добавят 10 μL МТТ (5.0 mg/mL), последвано от инкубиране при 37 градуса за 4 часа. След това супернатантата с МТТ се отстранява и формазановият продукт се разтваря в 100 μL DMSO. Абсорбцията се измерва на SpectraMax i3 четец на микроплаки (Molecular Devices, Sunnyvale, СА, САЩ) при 570 nm. Резултатите бяха изразени като относителен процент от контролната група. Оцветяващите с хематоксилин и еозин (HE) PC12 клетки, посяти върху стъклени покривни стъкла, се инкубират в продължение на 24 часа, преди да бъдат третирани с норвогонин по същия начин, както е описано по-горе.

Средата се отстранява и стъклените покривни стъкла се промиват със студен PBS, последвано от фиксиране с метанол за 10 минути при стайна температура и след това се промиват със студен PBS три пъти за 5 минути. Накрая, клетките бяха оцветени съгласно протокола за оцветяване с HE [32]. Анализите на клетката бяха извършени с помощта на микроскоп OLYMPUS IX73 (100 ×), за да се проверят клетъчните морфологични промени. Цифровите изображения бяха получени с помощта на цифровата камера DXM 1200 C (Nikon), свързана с микроскопа. Съдържание на ROS Вътреклетъчното ниво на ROS в PC12 клетки се определя с помощта на DCFH-DA анализ [33]. Накратко, PC12 клетки (1 × 105 клетки/mL) се посяват в 6-ямкови плаки. След лечение с хипоксия, PC12 клетките се промиват с PBS и след това се инкубират в културалната среда, съдържаща 10 μM DCFH-DA за 30 минути на тъмно при 37 градуса. Клетките бяха наблюдавани с обърнат флуоресцентен микроскоп Olympus (Токио, Япония) и бяха анализирани с поточен цитометър Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, Калифорния, САЩ) с дължина на вълната на възбуждане 488 nm и дължина на вълната на излъчване 525 nm. Нивото на ROS се изразява като относителен процент от контрола. Изтичане на LDH, съдържание на MDA и антиоксидантна ензимна активност PC12 клетки (1 × 105 клетки/mL) се посяват в 90 mm паничка. След третиране с хипоксия, както е описано по-горе, 50 μL културален супернатант от всяка чиния се събира и LDH активността в средата се открива с помощта на търговски комплекти за анализ (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Китай) и се изразява като U/mL. PC12 клетките бяха събрани и хомогенизирани след промиване два пъти със студен PBS. Концентрацията на общия протеин се измерва с помощта на комплекта за анализ на протеин BCA. Съдържанието на MDA и активността на антиоксидантния ензим се определят с помощта на търговски комплекти за анализ (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Китай).

Съдържанието на MDA беше представено като nmol/mg протеин. Активностите на SOD, CAT и GPx бяха представени като U/mg протеин. Клетъчна апоптоза (анексин-V/PI оцветяване) След третиране с хипоксия, PC12 клетките бяха събрани, промити два пъти със студен PBS и след това суспендирани със свързващ буфер. Клетките бяха третирани с Annexin V-FITC и PI разтвор, следвайки протокола на производителя (Beyotime, Шанхай, Китай). Събирането на данни се извършва с помощта на поточен цитометър Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, Калифорния, САЩ). Количествен PCR анализ в реално време Общата РНК на PC12 клетки се екстрахира с помощта на Trizol реагент (Takara, Далиан, Китай) и се преобразува в cDNA с помощта на комплекта реагент PrimeScript TM RT (AK4301,

Такара, Далиан, Китай). cDNA, кодираща HIF-1, VEGF, Bcl-2, Bax, каспаза-3, цитохром С и глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) ген беше амплифициран чрез количествени реални времева PCR с помощта на система за откриване в реално време 7300 (Applied Biosystems, Калифорния, САЩ). Използваните праймери са показани в таблица 1. Условията на PCR цикъл са 95 градуса за 30 s, последвани от 40 цикъла от 95 градуса за 5 s и 60 градуса за 31 s. Нивата на тРНК се изчисляват с помощта на 2-ΔΔCt метода и се нормализират към GAPDH, който е референтният ген. Western blot PC12 клетки бяха събрани и хомогенизирани в RIPA агенти. Концентрацията на общите протеини се определя количествено с помощта на комплекта за анализ на протеин BCA. 30 ug от пробите се разделят на 12% SDS-PAGE електрофореза и след това се прехвърлят в мембрани от поливинилиден флуорид (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, USA).

Мембраните се блокират с 5 процента обезмаслено сухо мляко в TBST буфер за 1 час при стайна температура и се инкубират с първични антитела: анти-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, UK), анти-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, UK), анти-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, UK), анти-Bax (1:500, ab32503, Abcam, UK), анти каспаза-3 (1:300, ab44976, Abcam, UK), анти цитохром C (1:1000, ab13575, Abcam, UK) и анти- -актин (1:2000, ab8227 , Abcam, UK) при 4 градуса през нощта. След това мембраните се промиват и инкубират с вторични антитела (1: 2000, ZsBio, Пекин, Китай;) в продължение на 1 час при стайна температура. Имунореактивните ленти се визуализират с помощта на усилени хемилуминесцентни (ECL) реагенти. Относителният интензитет на лентите се нормализира към вътрешната контрола на -актин и се анализира с помощта на Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

Статистически анализ

Резултатите бяха изразени като средно ± SD, получено от поне три независими експеримента. Разликата между групите беше анализирана с помощта на еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA), последван от пост-хок теста Student–Newman–Keuls. P-стойност от < 0.05="" се="" счита="" за="" статистически="">

Резултати

Norwogonin защитни PC12 клетки срещу увреждане, предизвикано от хипоксия

Първо, за да се изключи пролиферативната активност на норвогонин, неговата цитотоксичност върху нормални PC12 клетки се определя с помощта на МТТ анализ. Както се вижда на Фиг. 2а, клетъчната пролиферация не се променя значително след третиране с норвогонин при концентрации от 1 × 10− 8 -1 × 10− 5 mol/L (P > 0,05 ). Въпреки това, жизнеспособността на клетките значително намалява, когато концентрацията на норвогонин се повишава до 1 × 10-4 mol/L (P <0.05). резултатите="" показват,="" че="" норвогонинът="" не="" проявява="" токсичност="" или="" пролиферативна="" активност="" върху="" pc12="" клетки="" при="" концентрации="" от="" 1="" ×="" 10-="" 8="" -1="" ×="" 10-="" 5="">

След това изследвахме защитния ефект на норвогонин срещу увреждане на PC12 клетки, предизвикано от хипоксия. Както е показано на Фиг. 2b, в сравнение с контролната група, клетъчната жизнеспособност в групата с хипоксия е намалена до 58,71 процента (P < 0.01).="" в="" сравнение="" с="" лечението="" с="" хипоксия,="" предварително="" обработено="" с="" 1="" ×="" 10−="" 8="" ,="" 1="" ×="" 10−="" 7="" и="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l="" норвогонин="" защитен="" от="" дозата="" pc12="" клетки="" срещу="" увреждане,="" предизвикано="" от="" хипоксия,="" възстановяване="" на="" клетъчната="" жизнеспособност="" от="" 58,71="" до="" 62,79="" процента="" (p=""><0,05), 66,68="" процента="" (p=""><0,01) и="" 69,88="" процента="" (p=""><0,01), съответно.="" предварителната="" обработка="" с="" 1="" ×="" 10−6="" mol/l="" рутин="" също="" показва="" защитен="" ефект,="" значително="" повишавайки="" жизнеспособността="" на="" клетките="" до="" 63,78="" процента="" в="" сравнение="" с="" лечението="" с="" хипоксия.="" жизнеспособността,="" предварително="" обработена="" с="" 1="" ×="" 10-5="" mol/l="" норвогонин,="" е="" намалена="" до="" 63,43="" процента,="" което="" все="" още="" е="" значително="" по-високо="" от="" това="" в="" групата="" с="" хипоксия="" (p=""><0,05). тези="" резултати="" показват,="" че="" норвогонинът="" показва="" значителна="" цитопротекция="" при="" концентрации="" от="" 1="" ×="" 10-="" 8="" -1="" ×="" 10-="" 5="" mol/l="" и="" най-ефективната="" концентрация="" е="" 1="" ×="" 10-6="" mol/l.="" след="" това="" тази="" доза="" беше="" използвана="" като="" оптимална="" доза="" в="" следващите="">

Защитният капацитет на норвогонин също беше потвърден чрез морфологични промени. Както е показано на Фиг. 2c, PC12 клетки без лечение с хипоксия растат добре с правилни форми (вретеновидни), еднакви размери. След излагане на хипоксия, PC12 клетките показват свиване, заоблена форма, десквамация и намалена клетъчна плътност. Клетките, предварително третирани с норвогонин или рутин преди излагане на хипоксия, растат по-добре, броят на десквамационните клетки намалява и формата на клетките се възстановява нормално. Освен това, защитната способност на норвогонин се потвърждава от изтичането на LDH, което е свързано със загубата на целостта на клетъчната мембрана. Както е показано на Фиг. 2d, активността на LDH в културалната среда е значително повишена след излагане на хипоксия (P <>

Предварителната обработка с норвогонин или рутин драматично намалява изтичането на LDH, което предполага, че норвогонин и рутин възстановяват целостта на клетъчната мембрана. Norwogonin инхибира индуцирания от хипоксия оксидантен стрес в PC12 клетки ROS и MDA са два важни индикатора за клетъчен оксидантен стрес, индуциран от хипоксия. Както е показано на Фиг. 3a и b, значително повишено съдържание на ROS и MDA се наблюдава в PC12 клетки след излагане на хипоксия. Предварителната обработка с норвогонин или рутин значително инхибира производството на ROS и MDA.

Антиоксидантните ензими, като SOD, CAT и GPx, се считат за основна защитна система срещу оксидативен стрес в клетките. Както е показано на Фиг. 3c-e, излагането на хипоксия значително инхибира активностите на SOD, CAT и GPx в PC12 клетки. Лечението с норвогонин или рутин обръща тези промени и възстановява активността на антиоксидантните ензими. Всички тези резултати показват, че норвогонинът защитава клетките PC12 срещу оксидативен стрес, предизвикан от хипоксия.