Олигозахаридите облекчават острото бъбречно увреждане чрез облекчаване на клъстер от диференциация 44-медиирани имунни отговори в клетките на бъбречните тубули

Резюме:Остра бъбречна травма (ОПН)е внезапен епизод наувреждане на бъбрецитекоето обикновено се среща при пациенти, приети в болници. Към днешна дата не е разработено идеално лечение за намаляванеТежест на AKI. Олиго-фукоидан(FC) пречи на протеиновия клъстер на повърхността на бъбречните тубулни клетки на диференциация 44 (CD44) за предотвратяване на бъбречна интерстициална фиброза; обаче, влиянието на олигозахаридите върху AKI остава неизвестно. В това проучване FC, галакто-олигозахарид (GOS) и фрукто-олигозахарид (FOS) бяха избрани за изследване на влиянието на олигозахаридите върху AKI. Доказано е, че и трите олигозахарида се абсорбират частично от червата. Открихме, че олигозахаридите в зависимост от дозата намаляват CD44 антигенността и потискат индуцираната от хипоксия експресия на CD44, фосфо-JNK, MCP-1, IL-1 и TNF- в NRK-52E бъбречни тубулни клетки. Междувременно трансфекцията на CD44 siRNA и JNK инхибиторът SP600125 намаляват индуцираната от хипоксия експресия на фосфо-JNK и цитокини. Лигандът на CD44, хиалуронанът, противодейства на влиянието на олигозахаридите върху CD44 и фосфо-JNK. На 2 дни след операцията за исхемично-реперфузионно увреждане олигозахаридите намаляват възпалението на бъбреците, серумният креатин, MCP-1, IL-1 и TNF- при AKI мишки. На 7-ия ден след операцията се насърчава възстановяването на бъбреците. Тези резултати показват, че FC, GOS и FOS инхибират индуцираната от хипоксия CD44/JNK каскада и цитокини в бъбречните тубулни клетки, като по този начин подобряват AKI и възпалението на бъбреците при AKI мишки. следователнодобавка на олигозахаридие потенциална здравна стратегия за пациенти с AKI.

Ключови думи: остра бъбречна травма; клъстер на диференциация 44; фрукто-олигозахарид; галактоолигозахарид; олиго-фукоидан; възпаление

1. Въведение

Остра бъбречна травма(AKI) се характеризира с внезапно намаляване на скоростта на гломерулна филтрация и последващо повишаване на серумния креатинин. Това увреждане е често срещано при пациенти, приети в болници и интензивни отделения, особено при възрастни хора. Исхемия, сепсис и нефротоксичност са основните причини за AKI, които често съществуват едновременно и по този начин усложняват диагностиката и лечението [1]. Тежкият AKI поставя изписаните пациенти в риск от нежелани събития, като хронично бъбречно заболяване, сърдечно-съдови събития, рак и инфекции [2]. AKI има бързо развитие и не е налично ефективно лечение за избягване или намаляване на тежестта му. Приемът на специфични хранителни вещества може да намали увреждането на бъбречните тубули при AKI [3]. Следователно, изучаването на влиянието на специфичното хранене върху AKI ще помогне за подобряване на AKI и съпътстващите рискове, пред които са изправени изписаните пациенти.

Възпаление и набиране на левкоцитиса ключови медиатори на AKI. Бъбреците, особено клетките на бъбречните тубули, генериратвъзпалителни цитокинипо време на AKI, като IL-1, IL-6, моноцитен хемоатрактантен протеин-1 (MCP-1) и тумор некрозисфактор- (TNF-) [4,5] . Тези цитокини допълнително предизвикват системно възпаление и набиране на левкоцити. Въпреки че няколко подгрупи левкоцити упражняват защитни ефекти върху AKI (като Т-регулаторни клетки), повечето неутрофили, моноцити и дендритни клетки са вредни за възстановяването на AKI [6]. Системното възпаление също е вредно за възстановяването от AKI поради високите нива на цитокини [7]. Сред цитокините, секретирани от бъбреците, MCP-1 е отговорен главно за набирането на левкоцити, реагира на различни цитокини, включително IL-1 и TNF- [8,9], и играе важна роля в патогенезата различни бъбречни увреждания [10]. В човешките проксимални тубулни клетки HK-2, индуцираната от хипоксия MCP-1 експресия се медиира от пътя на c-Jun NH2- терминална киназа (JNK) [11]. Пътят на р38 също участва в индуцираната от албумин MCP-1 експресия в бъбречните тубулни епителни клетки [12]. Следователно регулирането на JNK и p38 пътищата може да повлияе на възпалението и набирането на левкоцити при AKI.

Олигозахаридите са захаридни полимери, съдържащи 3–10 монозахариди, които са несмилаеми и представляват основен компонент от всички налични пребиотици като диетични добавки [13]. Повечето фруктоолигозахариди (FOS), погълнати в човешкото тяло, са напълно ферментирали от флората на дебелото черво и малка част се възстановява в урината [14]. Галактоолигозахаридите (GOS) могат да се абсорбират в кръвта и впоследствие да се екскретират в урината [15]. Същата ситуация се отнася и за фукоидан в кафяви морски водорасли [16]. Абсорбираните олигозахариди могат да повлияят на биохимичните реакции и клетъчното разпознаване [17]. Нашето предишно проучване разкрива, че олиго-фукоидан (FC) пречи на взаимодействието между повърхностния протеин на бъбречните тубулни клетки CD44 и неговите екстрацелуларни лиганди, като по този начин предотвратява бъбречната интерстициална фиброза [18]. Взаимодействието между CD44 и неговите извънклетъчни лиганди насърчава JNK сигналния път [19]. Следователно ежедневният прием на олигозахариди може да намали възпалението на бъбреците при пациенти с AKI. Въпреки това влиянието на тези полимери върху AKI остава неизвестно. Това проучване изследва ефекта на FC, FOS и GOS върху третирани с хипоксия бъбречни тубулни клетки и AKI мишки с исхемично-реперфузионно увреждане (IRI). Резултатите показват, че трите олигозахарида потискат CD44-медиираните бъбречни имунни отговори и намаляват тежестта след AKI. Следователно използването на тези полимери като хранителна добавка представлява нова стратегия за лечение на AKI

2. Материали и методи

2.1. Материали

FOS (средна степен на полимеризация <10), GOS (средна степен на полимеризация <8) и FC (средна степен на полимеризация <5) са получени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ, Кат. № F8052), Carbosynth (Berkshire, UK, Кат. № OG32134) и Hi-Q Marine Biotech International (Тайпе, Тайван), съответно. Олигозахаридите се разтварят в двойно дестилирана вода и се филтруват с помощта на 0.22 µm стерилни филтри (Merck Millipore, Darmstadt, Германия). Хиалуронанът (HA) и всички други химикали с клас реагент са получени от Sigma. Антитела срещу JNK (sc-7345), фосфо-JNK (sc-6254), MCP-1 (sc-52701), IL-1 (sc{{17) }}) и TNF- (sc-52746) са закупени от Santa Cruz Biotechnology (Далас, Тексас, САЩ). Антитела срещу р38 (9212) и фосфо-р38 (9211) бяха получени от Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Антитела срещу Ly6G (ab25377) и F4/80 (ab100790) бяха закупени от Abcam (Кеймбридж, Обединеното кралство). Антитела срещу HIF-1 (NB100-105) бяха закупени от Novus Biologicals (Centennial, CO, USA).

2.2. Клетъчна култура

Проксималните бъбречни тубулни клетки на плъхове (NRK-52E) и линията на миши макрофаги RAW264.7 бяха закупени от Института за изследване и развитие на хранителната промишленост (Hsinchu, Тайван); култивиран в DMEM, допълнен с антибиотичен/противогъбичен разтвор и 10% фетален телешки серум; и се съхранява при 37 ◦C и 95% влажност в CO2 инкубатор. След достигане на 70% сливане, клетките се култивират в среда без серум и се инкубират за една нощ преди експеримента. За експеримента с хипоксия клетките NRK-52E и Anaero Pack (Mitsubishi Gas Chemical America, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ) бяха депозирани в правоъгълни буркани (Mitsubishi Gas Chemical America) и цялата настройка беше поставена в 37 ◦C инкубатор за 4 часа. След това клетките се култивират една нощ при нормални условия.

2.3. Уестърн блот анализ

Накратко, 15 µg NRK-52E протеинов лизат се прилагат към всяка лента и резултатите се анализират чрез Western blot. Относителните нива на протеинови ленти бяха количествено определени от пет независими експеримента от софтуера Quantiscan от Biosoft (Кеймбридж, Обединеното кралство).

2.4. Кратка интерферираща (si)RNA трансфекция на CD44

CD44 siRNA на плъх (4390771) е закупен от Thermo Scientific (Waltham, MA, USA). След нарастване до 70% сливане, клетките се трансфектират със siRNA, като се използва реагент за трансфекция Lipofectamine 2000 (Thermo Scientific) съгласно инструкциите на производителя.

2.5. Анализ на клетъчна пролиферация

След като хипоксичните NRK-52E клетки бяха култивирани в продължение на 24 часа, същата среда беше използвана за култивиране на RAW264.7 клетки в 96-ямкова плака (2000 клетки/ямка). След 24 часа инкубация, пролиферацията на RAW264.7 клетки се анализира чрез използване на SRB Assay Kit (Abcam, Cat. No. ab235935) съгласно инструкциите на производителя.

2.6. Тестове за антигенност на CD44

Рекомбинантен CD44 на плъх е получен от R&D Systems (Минеаполис, Минесота, САЩ, кат. № 6577-CD) и е използван за получаване на реакция на свързване с НА според инструкциите на производителя. Накратко, 20 ng/mL рекомбинантен CD44 на плъх се смесва с различни концентрации на FC, FOS или GOS за 10 минути, за да се изследва влиянието на олигозахаридите върху антигенността на CD44. Смесите се анализират с помощта на комплект CD44 ELISA (Abcam, Cat. No. ab213928) съгласно инструкциите на производителя.

2.7. Експериментални животни и бъбречен IRI

Осемседмични мъжки 129S1/SvImJ мишки бяха закупени от Lasco Technology (Тайпе, Тайван). Всички експерименти с животни бяха одобрени от Комитета за грижа и използване на експериментални животни към Медицинския университет в Тайпе (одобрение № LAC-2019-0511) и съставени от Ръководството на NIH за грижа и използване на лабораторни животни. За индуциране на IRI, мишки (с тегло 21-23 g) бяха подложени на двустранно притискане на бъбречната дръжка за 30 минути чрез провеждане на хълбочен разрез [20]. Мишките бяха анестезирани чрез инхалационна анестезия с изофлуран преди операцията. Фиктивно оперираните мишки претърпяха подобна операция, с изключение на клампирането на бъбречните дръжки. Всички мишки бяха хранени с олигозахариди чрез орална сонда от 1 ден преди до 2 дни след IRI операция. Експерименталните мишки бяха разделени на следните пет групи с n=8 за резултатите на ден 3 и ден 7: (1) фиктивна група; (2) AKI група; (3) AKI група, хранена с FC (10 mg/kg/ден); (4) AKI група, хранена с FOS (10 mg/kg/ден); и (5) AKI група, хранена с GOS (10 mg/kg/ден). Мишките бяха умъртвени 3 или 7 дни след операцията и кръвта беше събрана и анализирана с помощта на биохимичен анализатор и комплекти ELISA. Нивото на серумния креатинин на всяка мишка се анализира, за да се оцени развитието на AKI. Морфологията на бъбреците беше изследвана чрез оцветяване с периодична киселина-Шиф (PAS) и имунохистохимично оцветяване (IHC) във фиксирани във формалин 2 µm парафинови срезове.

2.8. Имунохистохимично оцветяване

Бъбречните тъкани бяха фиксирани с 4% буфериран параформалдехид, вграден в парафин и нарязани на 2 µm срезове за оцветяване с UltraVision Quanto Detection System HRP DAB комплекти (Thermo Scientific, Fremont, CA, USA) и хибридизиране с основното антитяло според инструкциите на производителя .

2.9. PAS оцветяване

Бъбречните срезове се оцветяват с PAS комплект за оцветяване (Abcam, кат. № ab150680) в съответствие с инструкциите на производителя.

2.10. ELISA анализ

Култивираната среда на NRK-52E клетки и серумните проби от експерименталните мишки бяха събрани и анализирани с помощта на комплекта MCP-1 ELISA (Abcam, кат. № ab208979) и IL-1 ELISA комплект (Abcam, Кат. № ab197742). Серумните проби също бяха анализирани с помощта на комплект TNF-ELISA (R&D Systems, кат. № MTA00B) и ELISA комплект, свързан с неутрофилна желатиназа липокалин (NGAL) (R&D Systems, кат. № MLCN20) от инструкциите на производителя.

2.11. Статистически тестове

Значимите разлики между двете групи са определени с помощта на t-теста на Student. Разликите се считат за значими за p стойностите<0.05

3. Резултати

3.1. Олигозахаридите инхибират увеличаването на CD44 и цитокини в хипоксични NRK{3}}E клетки

Експресията на CD44 в NRK-52E клетки, третирани с FC, FOS и GOS, първо беше наблюдавана, за да се оцени влиянието на олигозахаридите върху бъбречните тубулни клетки. Индуцираната от хипоксия CD44 експресия се инхибира от трите олигозахарида в диапазона 0.05–0.5 mg/mL (Фигура 1A). Следователно, олигозахаридната доза от 0,1 mg/mL беше използвана в следващите клетъчни експерименти. В подготвената система лечението с хипоксия забележително индуцира експресията на маркер за хипоксия HIF-1 в NRK-52E клетки, което показва, че клетките са били в състояние на хипоксия (Фигура 1B). Хипоксията повишава нивата на фосфорилиран JNK, MCP-1, IL-1 и TNF-, но не и в клетките, третирани с олигозахариди (Фигура 1B, C). Експресията на JNK се повишава в хипоксични клетки, но не и в третирани с FC или FOS клетки. GOS не повлиява експресията на JNK в хипоксични клетки, но потиска регулирането нагоре на фосфорилираната JNK. Следователно, олигозахаридите могат да инхибират индуцираната от хипоксия JNK сигнална трансдукция и експресията на цитокини в клетките на бъбречните тубули. Въпреки че FC и GOS регулират нагоре фосфорилиран p38 в хипоксични клетки, експресията на този протеин не се увеличава в хипоксични клетки. Това откритие показва, че р38 не играе ключова роля в отговорите, предизвикани от хипоксия в NRK-52E клетки.

3.2. CD44 и JNK играят критична роля в увеличаването на цитокините в хипоксичните NRK{3}}E клетки

Експресията на CD44, фосфорилиран JNK и цитокини в бъбречните тубулни клетки са повлияни от олигозахаридите, но тяхната връзка остава да бъде изяснена. За да се изследва ролята на CD44 в JNK сигнализиращата трансдукция и експресията на цитокини в хипоксични клетки, NRK-52E клетките бяха трансфектирани с различни дози CD44 siRNA. CD44 siRNA при 50 и 100 PM ефективно блокира повишената от хипоксия експресия на CD44 и значително инхибира предизвиканото от хипоксия повишаване на нивата на фосфорилиран JNK, MCP- 1, IL-1 и TNF- (Фигура 2A). Влиянието на блокирането на CD44 върху експресията на JNK е свързано с дозите на siRNA. Експресията на JNK в хипоксични клетки се индуцира от CD44 siRNA при 50 рМ, но се инхибира при 100 рМ. И двете дози потискат регулирането нагоре на фосфорилираната JNK. Селективният инхибитор за JNK, SP600125, значително намалява експресията на MCP-1, IL-1 и TNF- в хипоксични NRK-52E клетки (Фигура 2B). Тези резултати предполагат, че инхибиторният ефект на CD44 siRNA трансфекция върху индуцирани от хипоксия цитокини се дължи на намаляване на фосфорилираната JNK.

Фигура 1. Инхибиторен ефект на олигозахаридите върху CD44 сигналната трансдукция в хипоксични NRK{2}}E клетки. Клетките бяха предварително третирани с FC, FOS или GOS за 3 0 минути и след това бяха подложени на хипоксична култура. Експресията на протеин се анализира чрез Western blotting. (A) Дозозависими ефекти на олигозахаридите върху експресията на CD44. (B) Ефект на олигозахаридите върху сигнали, свързани с CD44-. Концентрацията на олигозахариди беше зададена като 0.1 mg/mL. Относителното увеличение на протеиновите ленти също е представено във формата на стълбовидна диаграма (C). Резултатите са изразени като средна стойност ± SD (n=4).

Фигура 2. Роля на CD44 и JNK в индуцирани от хипоксия възпалителни реакции в NRK-52E клетки. Експресията на протеин се анализира чрез Western blot. (A) Инхибиторен ефект на CD44 siRNA трансфекция върху фосфорилиран JNK и цитокини. (B) Инхибиторен ефект на SP600125 върху цитокините. Клетките бяха предварително третирани с 20 цМ SP600125 за 30 минути преди третиране с хипоксия. Относителното увеличение на протеиновите ленти също е представено под формата на стълбовидна диаграма. Резултатите са изразени като средна стойност ± SD (n=4).

3.3. Индуцирана от хипоксия секреция на цитокини в бъбречни тубулни клетки насърчава пролиферацията на макрофаги

Възпалението е медиатор на бъбречно увреждане при AKI. Следователно е изследвано влиянието на олигозахаридите върху левкоцитите. Фигура 3А показва, че FC, FOS и GOS не повлияват пролиферацията на макрофаги RAW264.7 клетки. Пролиферацията на RAW264.7 клетки се стимулира от 24-часовата културална среда за хипоксични NRK-52E клетки (Фигура 3B), но не и от средата за хипоксични NRK-52E клетки, третирани с олигозахариди. Първият има по-високи нива на MCP-1 и IL-1 от втория (Фигура 3C, D). И трите олигозахарида значително намаляват MCP-1 и IL-1 в културалната среда на хипоксични NRK-52E клетки. Следователно, FC, FOS и GOS могат да намалят експресията и секрецията на цитокини в хипоксични бъбречни тубулни клетки и, следователно, да намалят възпалението, причинено от увредени бъбречни тубулни клетки.