Екстрактът от маслинови листа (OLE) нарушава трафика на аквапорин-2, индуциран от вазопресин, чрез активирането на калциево-чувствителния рецептор

За повече информация. контакт:tina.xiang@wecistanche.com

Вазопресин (AVP) повишава водопропускливостта вбъбречнасъбирателен канал чрез регулиране на трафика на аквапорин-2 (AQP2). Няколко разстройства, включително хипертония и неподходяща секреция на антидиуретичен хормон (SIADH), са свързани с аномалии във водната хомеостаза. Доказано е, че някои фитосъединения са полезни за човешкото здраве. Тук ефектите на екстракта от маслинови листа (OLE) са оценени чрез in vitro и in vivo модели. Конфокалните проучвания показват, че OLE предотвратява индуцираната от вазопресин AQP2 транслокация към плазмената мембрана в MCD4 клетки и плъховебъбреци. Инкубацията с OLE намалява AVP-зависимото увеличение на осмотичния коефициент на водопропускливост (Pf). За да се изяснят възможните ефекти на OLE, беше оценен вътреклетъчният калций. OLE увеличава вътреклетъчния калций чрез активиране на калциевия сензорен рецептор (CaSR).NPS2143 , селективен инхибитор на CaSR, премахва инхибиторния ефект на OLE върху AVP-зависимата водопропускливост. Експериментите in vivo разкриха, че лечението с OLE повишава експресията на CaSR иРНК и намалява AQP2 иРНК, успоредно с увеличаване на AQP2-насочената миРНК-137. Заедно тези открития предполагат, че OLE антагонизира действието на вазопресин чрез стимулиране на CaSR, което показва, че този екстракт може да бъде полезен за облекчаване на разстройства, характеризиращи се с абнормно CaSR сигнализиране и засягане на бъбречната реабсорбция на вода.

Листата от маслиново дърво са били широко използвани като традиционни средства за лечение на няколко заболявания, особено в средиземноморските страни. Листата обикновено се консумират в човешката диета като екстракт или прах за приготвяне на инфузии или билков чай. Анализът на химическата характеристика разкрива, че листата на маслиновото дърво съдържат няколко биоактивни съединения, които могат да окажат благоприятен ефект при определени заболявания като метаболитен синдром, дислипидемия и хипертония. При пациенти с есенциална хипертония OLE намалява кръвното налягане и леко намалява гликемията и калцемията. Установено е, че множество полифеноли като олеуропеин, хидрокситирозол и тирозол са обогатени в екстракт от зелени маслинови листа (OLE)5 и е известно, че участват в превенцията на определени заболявания, характеризиращи се с оксидативен стрес. Поради това през последните няколко години интересът към изследване на потенциалните благоприятни ефекти на екстракта от маслинови листа нараства сред учени в различни области на изследване. OIE показа значителен антипролиферативен ефект в клетките на злокачествен мезотелиом чрез промяна на вътреклетъчната калциева динамика, вероятно насочена към T- тип Ca2 плюс канали. Интересно е, че е установено, че OLE упражнява антихипертензивни ефекти върху генетичната хипертония при спонтанно хипертензивни плъхове (SHR), свързани с подобряването на съдовата функция*. Прекомерната реабсорбция на вода играе важна роля в патогенезата на повишеното кръвно налягане. При пациенти с хипертония, лекувани с екстракт от маслинови листа, е установено значително намаляване на няколко възпалителни фактора, свързани с понижаване на кръвното налягане. Освен това прекомерното задържане на вода характеризира няколко заболявания като чернодробна цироза, сърдечна недостатъчност и неподходяща секреция на антидиуретичен хормон (SIADH). Водната хомеостаза в тялото се контролира строго от антидиуретичния хормон вазопресин (AVP), който се освобождава при дехидратирано състояние. AVP свързва своя сроден V2R рецептор, локализиран в базолатералната мембрана набъбречнаглавните клетки, като по този начин активират сАМР сигналния път, който води до транслокация на носещите аквапорин-2(AQP2) везикули от вътреклетъчен басейн към апикалната плазмена мембрана, където се получава реабсорбция на вода. На молекулярно ниво няколко фактора могат да модулират бъбречния воден баланс. Повишеното ниво на луминален калций регулира надолу краткотрайния вазопресин-зависим AOP2 трафик чрез активиране на калциево-чувствителния рецептор (CaSR)1,12. От друга страна, активирането на CaSR в условно обезсмъртени бъбречни проксимални тубулни епителни клетки, изолирани от човешката урина, индуцира значително повишаване на цитозолния калций и значително намалява увеличението на cAMP, предизвикано от форсколин (FK), директен активатор на аденилат cvclase3 Освен това , в MCD4 клетки на бъбречния събирателен канал, стабилно експресиращи водния канал AOP2, стимулирането на CaSR отслабва cAMP-зависимото увеличение на AQP2 фосфорилирането при серин 256, което е основно събитие в каскадата на сигнална трансдукция, активирана от вазопресин, и което в крайна сметка повишава водната пропускливост4 ,15 Освен това вбъбрексрезове от вътрешния медулен бъбрек на мишка, активирането на CaSR с калцимиметика NPS-R568 причинява значително увеличение на AQP2-насочената miRNA-137, потвърждавайки тясното взаимодействие между CaSR сигналния път и AQP{ {4}}зависима водопропускливост17. В настоящото проучване ефектите на екстракта от маслинови листа, получен от местния сорт Coratina, бяха оценени върху индуцираната от вазопресин AQP2 функция в MCD4 клетки на бъбречния събирателен канал, стабилно експресиращи AOP2 и в dDAVP третирани плъхове, инжектирани с екстракта. Предоставяме доказателства, че лечението с OLE противодейства на реакцията на вазопресин в бъбречните клетки, което може отчасти да обясни неговия диуретичен ефект. Интересно е, че този ефект изглежда е свързан с OLE-индуцирано активиране на CaSR, рецептор, за който е известно, че има отрицателно взаимодействие с рецептора на вазопресин12.

Научете повече за ефектите на цистанхата върху бъбреците

Резултати

Ефекти на OLE върху индуцираната от вазопресин AQP2 функция в MCD4 клетки. За да се изследва възможното участие на OLE във вазопресин-зависимата AQP2 функция,бъбречнасъбирателни канали MCD4 клетки, стабилно експресиращи вазопресинов рецептор 2 (V2R) и човешки AQP2, бяха използвани като експериментален модел18. Конфокалните проучвания (Фиг. 1A) разкриват, че в сравнение с третирани с dDAVP клетки, в които оцветяването с AQP2 е локализирано към апикалната плазмена мембрана, лечението с OLE предотвратява мембранната локализация на AOP2, предизвикана от стимулация с dDAVP. В съответствие с тези наблюдения, лечението с OLE нарушава dDAVP-индуцираното повишаване на темпоралния осмотичен отговор (посочен като 1/t на фиг. 1B)(OLE/dDAVP=88.70±1.86 процента, n=292 клетки спрямо dDAVP=206.8±5,49 процента ,n=186 клетки;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Ефекти на OLE в бъбреците на плъхове, инжектирани с OLE.

За по-нататъшно изследване на действията на OLE са проведени in vivo проучвания. По-конкретно, на плъхове е инжектиран OLE (250 mg/kg/ден) веднъж на ден в продължение на три дни. Алтернативно, плъховете са третирани съвместно с OLE в продължение на 3 дни и dDAVP в продължение на 30 минути. Оценката на CaSR иРНК, която беше изолирана от бъбречния събирателен канал на плъхове и обработена за PCR в реално време (фиг.6), разкри значително увеличение на CaSR иРНК в OLE(OLE=1.87±0.29, n{{ 10}} плъхове спрямо CTR=1.02±0.17, n=5 плъхове; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">бъбрекбяха извършени Western blotting анализ и конфокални изследвания (Фигура 9). При плъхове, инжектирани с OLE/dDAVP, фосфорилирането на AQP2 при серин 256 беше значително намалено в сравнение с бъбречните тъкани на животни, третирани с dDAVP (OLE/dDAVP=0). 77±0.16, n=5 плъхове срещу dDAVP=2.16±0.25,n=5 плъхове; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Дискусия

Калцият е важен вътреклетъчен пратеник, който модулира множество клетъчни функции2. Анормалното сигнализиране на калций може да доведе до няколко заболявания, включително сърдечна недостатъчност, рак и хипертония23. Специфичният контрол на експресията и активността на протеини, контролиращи множество вътреклетъчни калциеви сигнали, е доказано успешен за справяне с множество разстройства и следователно е привлекателен за разработване на лекарства. Това проучване предоставя нови прозрения за механизма на действие на OLE, като показва способността му да модулира вътреклетъчното калциево сигнализиране чрез стимулиране на CaSR, който участва във фината настройка на индуцирания от вазопресин трафик и експресия на AQP2. При физиологични условия AQP2 играе важна роля в контролирането на водната хомеостаза в тялото25. Стимулирането на вътреклетъчния механизъм, което води до локализиране на AQP2 в апикалната плазмена мембрана, води до анормално задържане на вода и последваща хипонатриемия, както при синдрома на неподходяща секреция на антидиуретичен хормон (SIADH), чернодробна цироза и застойна сърдечна недостатъчност-. При мишка модел на SIADH, свързан с хаплонедостатъчност на поликистозно бъбречно заболяване 1, базалното вътреклетъчно ниво на калций е значително намалено в сравнение с нивото, измерено в събирателните канали на мишки от див тип. Ниският вътреклетъчен калций регулира надолу активността на определени ензими, включително протеиновата фосфатаза PP2A, което води до повишаване на регулацията на AOP2 фосфорилирането при серин 2561. За разлика от това. активирането на CaSR с калцимиметика NPS-R568 повишава вътреклетъчната концентрация на калций и намалява нивото на cAMP в клетки с дефицит на PKD1. Важно е, че цитозолният калций може да регулира надолу калциево-инхибиращата аденилирана циклаза3, като по този начин фино регулира вътреклетъчното ниво на cAMP. В MCD4 клетките наистина стимулирането на CaSR с NPS-R568 намалява AQP2-pS256 чрез инхибирането на аденилата циклаза4. В това проучване лечението с OLE предотвратява вазопресин-зависимото повишаване на cAMP и AOP2-pS256, вероятно вторично на повишаване на вътреклетъчната концентрация на калций. Трябва да се отбележи, че излагането на външен източник на cAMP, използвайки пропусклив 8-Br-cAMP, значително противодейства на инхибиторния ефект на OLE върху пътя на V2R.

Повишеното ниво на цитозолен калций може да доведе до клетъчна смърт и апоптоза. Въпреки това, продължително увеличение на вътреклетъчния калций от 250 nM до повече от 600 nM насърчава оцеляването на невроните4. В MCD4 клетки лечението с OLE при 0,1 mg/ml не показва цитотоксичен ефект. При тази концентрация OLE (0,1 mg/ml) леко повишава вътреклетъчното ниво на калций. Калциевото изобразяване разкри, че острата стимулация с OLE причинява преходно увеличение на вътреклетъчния калций чрез активиране на CaSR, което се премахва, когато клетките са били предварително инкубирани със селективния CaSR антагонист NPS2143, В бъбречни проксимални тубулни клетки, алостерично активиране на CaSR с I-орнитин намалява производството на ROS, като по този начин намалява митохондриалния оксидативен стрес, който причинява клетъчна апоптоза356. Освен това, нашето предишно проучване показа, че експресията на вариантите на усилване на функцията на CaSR намалява освобождаването на ROS и S-глутатионилирането на AQP237. Инкубацията с OLE намалява генерирането на ROS в MCD4 клетки 35, показвайки неговата антиоксидантна способност. Въпреки това, в момента не е ясно дали OLE засяга AOP2-S-глутатионилирането. Многобройни проучвания разкриват, че OLE или олеуропеин, който е основната съставка на OLE, може да има защитни роли чрез инхибиране на клетъчната смърт,39 Въпреки това, дозозависими ефекти са описани при плъхове, получаващи OLE. Благоприятни реакции са получени при дози от 250 и 500 mg/kg. Обратно, при по-високи концентрации, лечението с OLE може да има вредни ефекти, вероятно поради прооксидантните действия на няколко фитосъединения. В това проучване, плъхове са инжектирани с OLE в доза от 250 mg/kg в продължение на три дни, което показва повишена регулация на CaSR. Нивото на експресия на CaSR се повишава от определени съединения, които действат като алостерични активатори на рецептора. Калцимиметиците наистина намаляват съдовите калцификации чрез увеличаване на биосинтезата на CaSR в човешки васкуларни гладкомускулни клетки0. В това състезание не може да се изключи възможността някои съединения в OLE да функционират като алостерични модулатори на CaSR. От друга страна, стимулирането с вазопресин може да доведе до освобождаване на IL-6, което може да допринесе за повишаване на нивото на експресия на CaSR42.

В бъбреците стимулирането на CaSR сигнализирането е свързано с понижаване на експресията на AQP2, вероятно чрез поколението на miR-137. miPHK са основни посттранскрипционни модулатори. Описани са също няколко вазопресин-зависими miRNAs, насочени към експресията на AQP243. Трансфекцията с miR-32 и miR-137 значително намалява нивото на експресия на AOP2 в mpkCCDc14 клетки. Интересното е, че OLE може да отслаби възпалителните сигнали и да упражнява защитни ефекти чрез модулиране на нивото на експресия на няколко miPHK". По-специално, в клетките на мултиформен глиобластом, OLE насърчава експресията на различна miRNA, включително miR-13745, която участва в понижаването на регулацията на Akt/mTOR сигнален път 46. Трябва да се отбележи, че лечението с олеуропеин предотвратява Akt/mTOR сигнализирането чрез активирането на индуцирани от калций CAMK и AMPK. Активирането на CaSR с NPS-R568 активира AMPK и намалява активността на mTOR в човешки проксимални тубулни клетки3. В съответствие с тези констатации, инкубацията с OLE повишава цитозолния калций, понижава PKA активността и намалява размера на кистата в модел на 3D-клетъчна култура48. Заедно тези открития предполагат, че OLE може да бъде полезен при лечение на разстройства, характеризиращи се с дисрегулация на вътреклетъчната калциева динамика, свързана с понижаването на CaSR сигнализирането.

Екстрактът от маслинови листа се състои от няколко биоактивни компонента, включително полифеноли, фибри и минерали49. В момента не е ясно дали едно съединение или синергична комбинация от фитосъединения в OLE може да бъде от полза за модулиране на вътреклетъчните отговори. Екстрактът, използван в това проучване, е приложен като възможна хранителна добавка и следователно е важно да се определи физиологичното въздействие на самия екстракт, като се има предвид, че няколко фенола, включително хидрокситирозол, могат да бъдат филтрирани от бъбреците и възстановени в урината50. Допълнителни проучвания ще осигурят ефикасността на специфични компоненти, които могат активно да регулират вътреклетъчния калциев сигнал чрез CaSR. В заключение, това проучване предоставя доказателства, че OLE може да се счита за нов потенциален адювант, полезен за смекчаване на разстройства, характеризиращи се с намаляване на експресията на CaSR, както и сигнализиране и повлияване на пропускливостта на бъбречната вода.

Материали и методи

Химикали и антитела.Всички химикали и антибиотици са закупени от Merck (Merck KGaA, Дармщат, Германия). Calcein-AM, Fura-2-AM, среда за клетъчни култури, фетален говежди серум (FBS) и хемилуминесцентни субстрати Super Signal West Pico бяха закупени от Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Aquaporin{ {2}}(AQP2) беше открит с помощта на специфични антитела (C-tail Ab), получени срещу синтетичен пептид, съответстващ на последните 15 С-терминални аминокиселини на човешки AQP2!. Антителата AQP2-pS256 бяха любезно подарени от проф. Питър Дийн. Вторични анти-заешки антитела от хрян, свързани с пероксидаза, са получени от Merck (Merck KGaA, Дармщат, Германия). Вторично козе-анти-заешко антитяло, свързано с Alexa-488, беше закупено от Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Производство на богати на феноли екстракти и химическа характеристика.Производството на богат на фенол екстракт от маслинови листа е извършено, както е докладвано в Ranieri et al.35. След смилане с блендер (Waring-Commercial, Torrington, CT, USA), се добавя вода ddH2O (съотношение 1/20, w/y) и след това се подлага на ултразвук (CEIA, Viciomaggio, Италия) три пъти , за 30 минути при 35±5 градуса всеки път. Накрая, екстрактите се филтруват през филтърна хартия, лиофилизират се и се съхраняват при -20 градуса С. Получените екстракти се филтруват с найлонови филтри от 0,45 μm（Merck KGaA, Дармщат, Германия） и се използват за химично характеризиране. Общото съдържание на фенол, антиоксидантната активност и идентификацията на отделните фенолни съединения бяха извършени съгласно Difonzo et al.. OLE показа съдържание на полифеноли, определено от Folin-Ciocalteu, равно на 195 mg. еквиваленти на галова киселина (GAE) и антиоксидантна активност, определена чрез ABTS (2,2'-азино-бис(3-етилбензотиазолин-6-сулфонова киселина диамониева сол), което представлява 750 μmol TE （еквиваленти на Trolox) .

Клетъчна култура и лечения.MCD4 клетки от кортикален събирателен канал на мишка, стабилно експресиращи човешки AQP2 и химерния V2R-Rluc бяха използвани като експериментален модел18. Клетките се отглеждат в смес 1:1 от Dalbec-cos модифицирана среда на Eagle и F-12, допълнена с 5 процента (г/г) фетален говежди серум. 1 процент (y/y) L-глутамин и 1 процент пеницилин/стрептомицин, 5 μM дексаметазон, 400 ug/ml G418（за AQP2 резистентност） и 1 ug/ml пуромицин (за V2R-Rluc резистентност) , във влажна атмосфера с 5 процента CO, при 37 градуса . MCD4 клетките бяха оставени при базално състояние (CTR) или дългосрочно третирани с OLE при 0,1 mg/ml O/N, dDAVP при 100 nM за 30 минути, или съвместно третирани с OLE и dDAVP или NPS2143 при 1 μM O/N Алтернативно, клетките бяха изложени на 8-Br-cAMP при 500 μM за 45 минути, Краткосрочни експерименти бяха проведени с OLE при 1 mg/ml за 5 минути и NPS2143 при 10 μM за 15 минути. Експериментите бяха проведени 3-5 независими пъти, като се използваха клетки от различни пасажи.

Животински модел и лечения.Всички процедури бяха извършени в съгласие с датските национални насоки за грижа и работа с експериментални животни и публикуваните насоки на Националния институт по здравеопазване. Протоколите бяха одобрени от Института по клинична медицина. Aarhus University, съгласно лицензите за използване на експериментални животни, издадени от Министерството на правосъдието на Дания (номер на одобрение 2015-15-0201-00658). Проведени са проучвания върху възрастни мъжки плъхове Wistar с начално тегло 200-225 g. Животните бяха държани на стандартна диета за гризачи (Altromin, Lage, Германия) и имаха свободен достъп до чешмяна вода. По време на експериментите плъховете бяха настанени в групи от по двама в клетка, с 12:12 часа цикъл светло-тъмно, температура 21±2 градуса C и влажност 55±2 процента. Пет плъха бяха третирани с подкожна инжекция от 1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Дания) в 200 ul физиологичен разтвор/животно и пет плъха, третирани с носител, служеха като контроли. След 30 минути плъховете бяха убити и бъбреците бяха обработени, както е описано по-долу.

Клетки и IMCD лизати.Клетките се култивират върху {{0}} mm блюда и се ресуспендират в буфер, съдържащ 220 mM манитол, 70 mM захароза, {{10}}. 5 M EGTA pH 8.0, 0.5 M EDTA pH 8.0, 1 M Tris-HCl pH 7.4 в присъствието на протеази (1 mM PMSF, 2 mg/ml леупептин и 2 mg/ml пепстатин А) и фосфатази (10 mM NaF и 1 mM натриев ортованадат) инхибитори. Като алтернатива се приготвят бъбречни срезове с приблизително 0,5 mm и се уравновесяват за 10 минути в буфер, съдържащ 1-8 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM глюкоза, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4 и 1,8 mM KH2PO4 (рН 7,4). Бъбречната папила се смила с ножица в същия буфер в присъствието на протеази (1 mM PMSF, 2 mg/mlleupeptin и 2 mg/mlpepstatin A) и фосфатази (10 mM NaF и 1 mM натрий ортованадат) инхибитори. След обработка с ултразвук (60 kHz за 5 s), лизатите се центрофугират при 12,000×g за 10 минути. Супернатантите се събират и използват за имуноблотинг изследвания'8.

Конфокална микроскопия.Конфокалните изследвания бяха извършени, както е описано по-горе1. Накратко, клетките се отглеждат върху PET вложки от клетъчна култура и се третират, както е описано по-горе. Алтернативно, бъбречни срезове, получени от контролни, OLE, dDAVP и OLE с dDAVP третирани плъхове бяха подложени на имунофлуоресцентни експерименти, както е описано по-горе. Изображенията са получени с конфокален лазерно сканиращ флуоресцентен микроскоп Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Швейцария). Гел електрофореза и имуноблотинг. Протеините се разделят на 12 процента полиакриламидни гелове без петна (Bio-Rad Laboratories, Inc., Херкулес, Калифорния, САЩ) при редуциращи условия, както е описано по-горе=5,52. Накратко, протеинови ленти бяха прехвърлени върху Immobilon-P мембрани (Merck KGaA, Дармщат, Германия) и имуноблотирани с помощта на анти-AQP2 (Pre-C-tail Ab) и анти-AQP2-pS256 антитела. Имунореактивните сигнали бяха получени с помощта на хемилуминесцентни субстрати Super Signal West Pico с Chemidoc System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Херкулес, Калифорния, САЩ). Лентите бяха нормализирани до общ протеин с помощта на технология без петна (Bio-Rad Laboratories, Inc., Херкулес, Калифорния, САЩ). Денситометричният анализ беше извършен с помощта на ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Херкулес, Калифорния, САЩ) и анализиран с помощта на GraphPad Prism (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ).

Тест за водопропускливост.Осмотичната водопропускливост се измерва, както е описано по-горе43. Накратко, MCD4 клетки се отглеждат върху 40- mm стъклени покривни стъкла. След третирането, клетките бяха заредени с 10 μM мембранно-пропусклив Calcein-AM за 45 минути при 37 градуса, 5 процента CO, в DMEM/F-12. Покривните стъкла бяха монтирани в перфузионна камера (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, САЩ). Измерванията бяха извършени с помощта на обърнат TE2000-S микроскоп (Nikon Eclipse микроскоп, Токио, Япония), оборудван за измервания на флуоресценция на единични клетки и анализ на изображения. Заредените с Calcein-AM проби бяха възбудени при 490 nm. Измервания на флуоресценция, след изосмотични (140 mM NaCl.5 mM KCl, 1 mM MgCl..1 mM CaCl., 10 mM Hepes сулфонова киселина, 5 mM глюкоза, рН 7.4) или хиперосмотични (изосмотичен разтвор, добавен със 135 mM манитол) разтвори . бяха проведени с помощта на софтуер Metafluor (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Торонто, Канада). Бяха записани данни за флуоресценция във времето след перфузия на клетки с изо- и хиперосмотични разтвори. Времевият ход на клетъчното свиване се измерва като времева константа (Ki, изразена като 1/r, sec), параметър, свързан с водопропускливостта, получен чрез напасване на данни с експоненциална функция, анализирана с помощта на GraphPad Prism (GraphPad Software, Сан Диего , Калифорния, САЩ).

Измервания на флуоресцентен резонансен трансфер на енергия.За да се оценят вътреклетъчните промени в cAMP, беше приложена технологията за флуоресцентен резонансен трансфер на енергия (FRET). За FRET експерименти клетките бяха трансфектирани с плазмид, кодиращ H96 сензора, съдържащ cAMP-свързващия консенсусен мотив на EPAC1, вграден между циан флуоресцентния протеин (CFP) и cp173Venus-Venus, както беше показано по-рано 32.33.54. Плазмидът, кодиращ сондата H96, беше подарък от Dr.K. Джалинк. Визуализация на ECFP-и/или EYFP-експресиращи клетки и откриване на FRET беше извършено с помощта на обърнат TE2000-S микроскоп (Nikon Eclipse микроскоп, Токио, Япония). Всяко изображение беше коригирано и анализирано, както беше показано по-рано55.

Вътреклетъчни измервания на калций. Измерванията на вътреклетъчния калций се извършват, както е показано по-горе56. Накратко, MCD4 клетките бяха заредени с 4 μM Fura-2 AM за 15 минути при 37 градуса в DMEM/F-12. Разтворът на Рингер се използва за перфузия на клетките по време на експеримента, съдържащ 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM глюкоза, 1,8 mM CaCl, рН 7,4. При флуоресцентни измервания, покривните стъкла с претоварени клетки бяха монтирани в перфузионна камера (FCS2 система със затворена камера. BIOPTECHS. Butler, САЩ). Измерванията бяха извършени с помощта на обърнат TE2000-S микроскоп (микроскоп Nikon Eclipse, Токио, Япония). Съотношението на интензитетите на флуоресценция при 340 и 380 nm беше начертано и изчислено като промяна във флуоресценцията. По-специално, стимулацията с OLE（1 mg/ml） или NPS2143 （10 μM） беше сравнена в същия тип клетки с тези, получени след стимулация с максимална доза от калциево-медиирания агонист ATP（100 μM）, който беше използван като вътрешен контрол (100 процента).

Вътреклетъчното ниво на калций се измерва в стационарно състояние и се калибрира, както е описано от Grynkiewicz57. OLE и NPS2143 бяха използвани дългосрочно при 0.1 mg/ml и l uM, съответно, и всяка проба беше калибрирана чрез добавяне на 5 μM йономицин в присъствието на 1 mM EGTA（Rm.）, последвано от 5 μM йономицин в 5 mM CaCl, (RMA).

PCR анализ в реално време на AQP2 и CaSR mRNA в контролни и третирани плъхове.Проведени са PCR експерименти в реално време за измерване на относителната експресия на mRNA във вътрешния събирателен канал на медулата (IMCD), изолиран от контролни и третирани бъбречни папили на плъх. Бъбречни срезове от около 0.5 mm бяха направени и уравновесени за 10 минути в буфер, съдържащ 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM глюкоза, 3.2 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.8 mM MgSO4 и 1.8 mM KH2PO4 (рН 7.4). Бъбречната папила се изолира под стереомикроскоп. След това проби от контролни и третирани плъхове се смилат с ножица директно в Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Беше извършена обратна транскрипция върху 2,5 ug обща РНК с помощта на SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, САЩ), в съответствие с предложенията на производителя (25°C за 10 минути; 42°C за 60 минути; 85°C за 5 минути). PCR амплификацията в реално време се извършва с помощта на TagMan Fast Advanced Master Mix с CaSR, AOP2 и GAPDH анализи (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) в StepOne Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ), задавайки условията на топлинен цикъл, както е посочено от производителя (95 градуса C за 20 s; 40 цикъла алтернативно при 95 ° C за 1 s и 60 градуса C за 20 s). Резултатите бяха изразени като 2- стойности (относително количествено определяне) с △ACt=(Ct мишена-Ct GAPDH) третирани-(Ct мишена-Ct GAPDH)Sham1.

miRNA-137 оценка при контролни и третирани плъхове.Съдържанието на miPHK{{0}} в събирателния канал на вътрешната медула на контролен и третиран плъх беше оценено с помощта на TagMan Advanced miRNA анализи (has-miR-137; Assay ID;477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A), което позволи високочувствително и специфично уведомяване за зряла miPHK с помощта на количествена PCR. Бъбречни срезове от около 0,5 mm бяха направени и уравновесени за 10 минути в буфер, съдържащ 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM глюкоза, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4 и 1,8 mM KH2PO4(pH7.4). Бъбречната папила се изолира под стереомикроскоп. След това проби от контролни и третирани плъхове се смилат с ножица директно в Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), за да се извлече общата РНК. TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit （Каталог n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA） се използва за получаване на cDNA синтез, съгласно протокола, предоставен от производителя (Poly(A)tailing reakcija; реакция на лигиране; реакция на обратна транскрипция; miR-Amp реакция). Синтетичната РНК (UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) с 59-фосфор беше синтезирана от Thermo Fisher Scientific и използвана за извършване на калибровъчна крива за интерполиране на стойностите на пробите на miRNA и за получаване на точна оценка (в нанограми) на съдържанието на miR-137 в образци16, като използвате GraphPad Prism (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ).

Статистически анализ.Всички стойности са докладвани като средни стойности ± SEM. Статистическият анализ е извършен чрез еднопосочен ANOVA, последван от тест за множество сравнения на Newman-Keuls с *p<0.05 considered="" statistically="" different="">

Декларации, етично одобрение и съгласие за участие.Проучванията върху животни са проведени в съгласие с датските национални насоки за грижа и работа с експериментални животни и публикуваните насоки на Националните здравни институти. Комитетът по етика на грижата за животните към Института по клинична медицина, Орхуски университет одобри протоколите от изследването, съгласно лицензите за използване на експериментални животни, издадени от датското Министерство на правосъдието (номер на одобрение 2015-15-0201-00658). Авторите потвърждават, че всички методи са проведени в съответствие със съответните насоки и разпоредби. Освен това авторите потвърждават, че проучването е проведено в съответствие с насоките на ARRIVE.

Препратки

1. El, SN & Karakaya, S. Маслиновото дърво (Olea europaea) оставя потенциални благоприятни ефекти върху човешкото здраве. Nutr. Rev. 67, 632–638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. Ефекти на екстракта от маслинови листа върху метаболитния отговор, функциите на черния дроб и бъбреците и възпалителните биомаркери при пациенти с хипертония. PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM Маслинови полифеноли и метаболитният синдром. Молекули

4. Cherif, S. et al. Клинично изпитване на титриран екстракт от Olea при лечение на есенциална артериална хипертония. J. Pharm. Белг. 51, 69–71 (1996).

5. Difonzo, GRA и др. Зелени екстракти от листата на маслиновия сорт Cortina имат антиоксидантна характеристика и биологична активност. J. Функц. Храни 31, 8.

6. Herrero, M. et al. Нови възможности за валоризиране на субпродукти от зехтин. J. Chromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. et al. Обогатеният с олеуропеин екстракт от маслинови листа повлиява динамиката на калция и уврежда жизнеспособността на клетките на злокачествен мезотелиом. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, M. et al. Антихипертензивни ефекти на обогатен с олеуропеин екстракт от маслинови листа при спонтанно хипертензивни плъхове. Хранителна функция 7, 584–593.

9. Hall, JE Бъбречна дисфункция, а не небъбречна съдова дисфункция. Медиира хипертония, предизвикана от сол. Тираж 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Вазопресин и регулирането на аквапорин-2. Clin. Exp. Нефрол. 17, 751–764.