Маслинови листа (Olea Europaea L) Екстракт Натоварени липидни наночастици: Оптимизиране на параметрите за обработка по кутия-Behnken статистически дизайн, Ин-витро характеризиране, и оценка на анти-оксидант и анти-микробна дейност част 2

Моля, свържете се сoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

2.5.6 Оценка на стабилността

Стабилността на оптимизираната формулировка(F9)беше разгледана като на Международния съвет за хармонизация(ICH)насоки). SLN дисперсията е взета в три отделни стъклени флакона(10 mL във всяка). Сред трите флакона единият е съхраняван в хладилника(4°C±2°C), вторият при стайна температура(25±2°C/60±5 RH% RH), а последният е съхраняван в камера за стабилност(Thermo Scientific, Швеция)при 40±2°C/75±5°C% RH. В конкретна времева точка viz 1,3,6 месец пробите са били извадени и изследвани за определени параметри като размер на частиците, ефективност на заплитане, потенциал на Zeta & PDI и т.н., които са били определени и сравнени статистически с нулеви данни за времето(първоначално). 2.5.7 Антиоксидантна активност

Един от най-полезните методи за откриване на анти-оксидант потенциал е 2,2-Дифенил-1-Picryl-Hydrazyl-Хидрат свободни радикали(DPPH)метод2. Радикална продухване дейност(т.е. анализ на способността им за продухване DPPH свободни радикали)на OLP-SLNs е оценена спектрофотометрично при 517 nm. Антиоксидантната активност на OLP, както и OPL-SLNs, е определена с помощта на(метода DPPH). Приготвен е разтвор на DPPH(0,1 mM)в етанол. OLP-SLNs(еквивалентни на 0,2 mg/mL OLP)са дисперсни в фосфатен буфер и оставени за 24 h за освобождаване на лекарството. Еквивалентна концентрация на OLP(0,2 mg/mL)и празни SlNs също е приготвена в същата среда. В това проучване аскорбинова киселина с концентрация 0,2 mg/mL е взета като стандарт и докато DPPH разтворът е използван като контрол.cistanche България3300 μL DPPH е смесен във всеки разтвор на OLP-SLNs(500 μL), празни SlNs и OLP разтвор(500 μL). Всяка реакционна смес е държана на шейкърска водна баня при 37±0,5°C за 30 мин при защитени условия от светлината. Накрая, абсорбцията на всяка проба е определена от UV-видим спектрофотометър(Shimadzu 1800, Япония)при 517 nm с помощта на етанол е използван като празна проба. Всеки експеримент е оценен три пъти и стойностите са представени като средна±SD. Стойността на анти-оксидантната активност под формата на % DPPH продухване дейност беше определена по следната формула(уравнение 2):

2.5.8 Анти-микробно проучване

Антимикробното проучване на OLP-заредени SLNs(оптимизирана партида F9)е проведено чрез използване на метода на агар кладенец дифузия. За оценката са използвани бактериални щамове като Staphylococcus aureus (положителното на Грам)и Pseudomonas aeruginoza(Грамовата отрицателна) ". Хранителни агарни плочи са приготвени при стерилни условия и бактериална суспензия(100 μL, концентрация около 10°CFU/mL)на всяка бактерия е поставена индивидуално върху всяка стерилна хранителна агарна плоча с помощта на стерилни тампони, инкубирани при 37±0,5°C за 1 ч.ползите от cistancheНа всяка плоча са произведени четири кладенеца около 8 мм диаметъра с помощта на стерилен корк борер. Тук за антимикробното проучване и поставени във всеки кладенец са използвани празни SlNs, положителен контрол(чист екстракт), физическа смес(OLP екстракт+ празно), и SLN и оптимизиран OLP-SLNs препарат(100 μL). Плочите са инкубирани при температура 37±0,5°C. В предварително определени времеви точки(6,12,24 h), плочите са изтеглени и зоните на инхибиране около стените са измерени в мм с помощта на калипер.

Моля, кликнете тук, за да научите повече

3 Резултати и дискусия

3.1 Предварителен скрининг и предварителна оптимизация на форма-латентни променливи

Установено е, че най-високата разтворимост на OLP е в съпри-до 888 ATO, както е изобразено на фиг.1. Низходящ ред на OLP разтворимост/100 gm в различни липиди е compritol 188 ATO(36.93±4.92mg)>Precirol ATO 5(29.37±3.01 mg)>GMS(23,84±2,73mg)>палмиева киселина(21,41±2,81 mg)>стеаринова киселина(16,25±1,65 mg). Compritol 888 ATO е бил използван като липид за приготвяне на SlNs на устна основа за препарата SLNs.

Въз основа на резултатите от предварителното скрининг проучване, tween 80 и compritol 888 ATO са избрани съответно като повърхностноактивен и липиден. Други параметри като лекарство към липидно съотношение(1:3-1:6), концентрация на повърхностноактивни вещества(%,1,5-4,5%)и хомогенизация скорост (об/мин, 3000-6000 об/мин), времето за хомогенизация(2 h), времето за ултразвук(10 min)бяха решени чрез провеждане на предварителните експерименти. Фактори като лекарство към липидно съотношение(A), повърхностноактивна концентрация(B), и хомогенизация(C)отново бяха оптимизирани чрез използване на отговор повърхност методология(RSM)във връзка с 3-фактори и 3-нива BBD, и тяхното влияние беше открито върху зависими фактори viz размер на частиците(Y1), ефективност на заклещването(Y2)и PDI(Y3).

3.2 Подготовка на SlNs и оптимизация на OLP заредени SLNS

Стойностите на предварително оптимизираните параметри, както е описано

горе са били монтирани на BBD на експертен дизайн. Съставът на общо седемнадесет формулировки е изследван от BBD с 5 център точки. Всички формулировки бяха разработени и бяха изследвани и допълнително монтирани на BBD стойности на зависими параметри като размер на частиците, ефективност на заплитане и PDI бяха изследвани и допълнително монтирани на BBD, за да получат крайния резултат. Генерирани са полиномни уравнения и 3D графики, показващи влиянието на независимите фактори върху зависимите фактори. Положителният знак на полиномиалното уравнение изследва положителен ефект и отрицателният знак посочи отрицателен ефект върху зависимите променливи. Стойност на действителните и прогнозираните зависими променливи регресионен анализ и Анализ на данните за вариациите на моделите са представени съответно в таблици 1,2 и 3. Квадратичният модел е смятан за най-добре пригоден модел за всички отговори, тъй като в този случай е наблюдавана най-високата стойност на регресионния коефициент.

3.3 Ефект на определени параметри върху размера на частиците(Y1)

Следното полиномиално уравнение е получено от BBD, показващо ефекта на различни независими фактори върху размера на частиците(Y1):

Горепосоченото уравнение показа, че compritol 888 ATO показва положителен ефект върху размера на частиците, докато туийн 80 и хомогенизацията проявяват отрицателно влияние върху размера на частиците.

Тук променливиТе A, B, C, AB, BC и B" имаха значителен ефект върху размера на частиците.цистанш холестеролПри 95% доверителен интервал липсата на припадане е незначителна(p>0,05)докато за останалите параметри е установено, че са значителни(p<0.0001)with adequate="" precision（="">4)(Таблица 3). Въз основа на R²

(0,9996)стойност, квадратичният модел е считан за най-добре пригоден модел с адекватен сигнал(Таблица 4).

Установено е, че размерът на частиците на различните партиди е в диапазона от 112.35-277.46 nm. Ако други променливи се поддържаха постоянни, размерът на частиците беше увеличен при повишаване на лекарството към липидното съотношение(Таблица 1, партида F1 237.05 nm и F2 259.57 nm). Това може да се дължи на агрегацията на частиците поради недостатъчния повърхностноактивен за разпръсне частиците. От друга страна, повърхностноактивното средство(1,5-4,5%)проявява отрицателен ефект върху размера на частиците(Таблица 1, партида F1 237,05 nm и F3 112,35 nm). Това може да се дължи на намаляване на интерфейсното напрежение между водената и липидната фаза, което предотвратява агрегацията на частиците). Скоростта на хомогенизация проявява отрицателно въздействие (таблица 1, партида F5 187,46 nm и F7 134,27 nm)върху размера на частиците поради генерирането на висока сила, която разбива частиците и оттам намалява размера на частиците. Уравнение 3 показва, че ефектът на повърхностноактивното действие(коефициентна стойност-40.87)проявява по-виден ефект върху размера на частиците в сравнение със скоростта на хомогенизация(стойност на коефициента -24.97).цистанш дезертикола нежелани реакцииФигура 2 изследва влиянието на различни независими параметри върху размера на частиците.

Cistanche може да анти-стареене

3.4 Ефект на някои параметри върху ефективността на заплитане(Y2)

Следното полимерно уравнение е получено от BBD, показващо влиянието на различни независими параметри върху ефективността на заклещването:

Тук променливи A, B, C, AB, AC, BC, A, и B²had е значително влияние върху ефективността на заплитане. При 95%доверителен интервал липсата на годни е незначителна(p<0.05)while the="" remaining="" parameters="" were="" found="" to="" be=""><0.0001)with adequate="" precision(="">4)(Таблица 3). Квадратичният модел(R²=0,9991)е считан за най-добре пригоден модел с адекватен сигнал(Таблица 4).

От горното уравнение 4 се наблюдава, че липидът (compritol 888ATO)проявява положителен ефект, докато останалите два параметъра проявяват отрицателно влияние върху ефективността на запушване. Повърхностноактивният(коефициентна стойност -7.23)имаше по-виден ефект в сравнение със скоростта на хомогенизация(коефициентна стойност -5.76). Положителният ефект на липидите върху ефективността на запушване(Таблица 1, партида F1 и F2)се дължи на наличието на по-липидни за настаняване на налични лекарства. Наблюдаван е променлив ефект върху ефективността на заплитането. В началния етап, при увеличаване на повърхностноактивното средство, стойността на ефективността на запушване е увеличена, но при по-нататъшно увеличаване на повърхностноактивното средство, той е намален поради изтичане на лекарството във външната среда(Таблица 1, партида F1 и F3). Хомогенизиращата скорост проявява отрицателен ефект върху ефективността на завличането поради повече сила на срязване, която може да отговаря за експулсиране на лекарството(Таблица 1, партида F5 и F7). Фигура 3 изследва ефекта на различни независими параметри върху

3.5 Влияние на независимите параметри върху PDI(Y3)

Следващо полиномиално уравнение, показващо влиянието на различни параметри върху PDI:

Тук,променливи като A,B, C,AB,AC,BC,A2,and C°имаше значителен ефект върху PDI. При 95% доверителен интервал липсата на припадане е незначителна(p>0,05)докато за останалите параметри е установено, че са значителни(p<0.0001)with adequate="" precision(="">4)(Таблица 3). Квадратичният модел(R=0,9991)е считан за най-добре пригоден модел с адекватен сигнал(Таблица 4).

От уравнение 5 се посочва, че всички три независими параметъра като съотношение на наркотици липиди, повърхностноактивно средство, и хомогенизация скорост имаше положителен ефект върху PDI. Доминиращ ефект се дължи на скоростта на хомогенизация(съефективна стойност 0,048), последвана от липид(коефициентна стойност 0,046), а най-малкото е повърхностноактивно(коефициентна стойност 0,014). Поради хомогенизацията кинетичната енергия на системата стана донякъде висока, които причиняват сблъсъка и агрегацията на липидните наночастици(Таблица 1, Партида F9 и F11). Висока концентрация на повърхностноактивни вещества, произведени повече малки частици, които образуват мост с големи частици и оттам произвеждат нее еднородност, която засилва PDI. Увеличаването на липидната концентрация при постоянно повърхностноактивно ниво е причинило коагулацията на частиците, което е довело до нееднаква разпределение на размера на частиците. Фигура 4 изследва влиянието на различни независими променливи върху ПЧИ). Въз основа на три характеристики т.е. размер на частиците, ефикасност на завлапването, и PDI партидата F9 се счита за оптимизирана формулировка със стойността на размера на частиците, ефективността на запиране, и PDI 277.46 nm,80.48%, и 0.275 съответно.

3.6 Характеризиране на OLP-SLNs

3.6.1 Оценка на размера на частиците, PDI и zeta потенциала

Установено е, че стойността на размера на частиците, PDI и zeta потенциала на оптимизираната партида(F9)е 277.46 nm, 0.282, (Фиг.5A), и -23.18 mV съответно. Малката стойност на PDI(<0.5)indicates the="" uniform="" or="" mono="" distribution="" of="" particles="" without="" any="" aggregation="" in="" the="" developed="" slns="" dispersion.="" a="" similar="" finding="" was="" observed="" by="" yasir="" et="" al.="">цистанш доза redditпо време на производството на Buspirone заредени SLNs за носа до мозъка доставка. Както размерът на частиците, така и повърхностният заряд са важни в случай на доставка на наркотици на наночастици. Смята се, че размерът на частиците по-малък от 500 nm бяга от фагоцитозния механизъм, предизвикан от макрофагите. Zeta потенциал под формата на отрицателен повърхностен заряд(около -20 mV)е желателен за правилната стабилност на наноформулацията. Наблюдаваната стойност на zeta потенциала е -23,18 mV, показваща добра физическа стабилност

на SLNs дисперсия. Важна роля на отрицателните повърхностни наночастици е привличането им към положително заредените протеини от увредените тъкани и помощ при регулирането на процеса на окисляване". Разработената оптимизирана формулировка

(F9)изпълняваше както критерии за размера на частиците, така и за повърхностните заряди.

3.6.2 Морфологично проучване

Оптимизираната партида от разработени OLP-SLNs(F9)показва приблизително сферична форма, както се наблюдава от проучването tEM(Фиг.5Б).

3.6.3 Ефективност на заплитане(%)

Ефективността на заплитане на развити партиди oPL SLNs е установено, че е в диапазона от 50.17-86.46% с 80.48% от оптимизирана формулировка(F9)показва добра способност за заплитане на наркотици на разработени SLNs. 3.6.4 Диференциална сканираща калориметрия(DSC)проучване Свойства като кристалност и термично поведение на развитите OLP-SLNs са важни свойства, които гарантират прилагането им при доставка на наркотици. The DSC термограма на OLP(лекарство),липид(compritol 888 ATO),и оптимизирана формулировка(F9)е представена в Фиг. Термичният спектър на OPL показа кратък и широк ендотермичен връх при 65,23°C, но се качи до 100,96°C. Компритолът 88ATO показва ендотермичен връх при 70,5°C, който се пресмива с точката си на топене. Пикът на характеристиките на OLP отсъстваше в термограмата на оптимизираната формулировка(F9). Тук е наблюдаван само един сравнително широк връх около 67,81°C, който бележи запушването на OLP в липидната матрица, водеща до образуването на OLP-SLNs4.

3.6.5 Ин-витро освобождаване на наркотици

Освобождаването на наркотици от оптимизиран OLP-SLNs формулировка(F9)е установено, че е 95.29±8.13% както е показано на фиг.7. Освобождаването от оптимизираната формулировка изложи би-

фазически модел т.е. първоначално бързо освобождаване(23.83±4.51 в първата 1 з)поради освобождаването на повърхността абсорбира наркотици и по-късно се поддържа(95.29±8.13% в 24 h)поради освобождаване на наркотици от SLNs матрица. Освобождаването кинетично на OLP форма оптимизирана формулировка е била открити чрез поставяне на получените данни за освобождаване на наркотици в различните кинетични модели, както е представено графично във Фиг.8. Установено е, че максималната R²(0.9984)стойност е за кинетичния модел от първа поръчка. Ето защо кинетик от първи ред се считаше за най-добре монтирания модел. Установено е, че механизмът за освобождаване е типът fickian дифузия със стойността на освобождаване експонент(n)0.441.

3.6.6 Оценка на стабилността

При подходящите условия на съхранение, всяка развита форма на дозиране се очаква да бъде стабилна до продължителността си на употреба(срок на годност). Тук разработената оптимизирана формулация OLP-SLNs(F9)е съхранена при определени условия на съхранение, както по спецификацията, предоставена от насоките на ICH. Формулировката, съхранявана при 4±2°C(хладилник)и условията на помещението(25±2°C/60±5% RH)не са значително(p<0.05) differ="" from="" the="" initial="" data(zero="" time)in="" respect="" of="" particle="" size,="" pdi,="" surface="" charge(zeta="" potential)="" and="" entrapment="" efficiency.="" a="" significant=""><0.05)in zeta="" potential(-19.27="" mv)and="" entrapment="" efficiency="" (73.29%)and="" a="" significant=""><0.05)in particle="" size(388.37="" nm)was="" observed="" in="" the="" formulation="" stored="" at="" 40±2℃/75±5%="" rh.it="" might="" be="" due="" to="" the="" partial="" loss="" of="" surfactant="" covering(hence="" zeta="" potential="" reduced)which="" leads="" to="" aggregation="" of="" particles(hence="" particle="" size="" increased)and="" leakage="" of="" a="" drug="" in="" the="" external="" environment="" (hence="" entrapment="" efficiency="">

3.6.7 Антиоксидантна активност

Основното действие на OLP е да се предотврати пероксидацията чрез почистване на свободните радикали и допринасяне за оценка на нараняванията, причинени от оксидативен стрес. Както е показано на фиг. 9, безплатният OLP проявява 48,38±5,28 5% анти-оксидант, който е значително(p<0.01)less than="" the="" anti-oxidant="" activity="" (67.93±7.37%)of="" optimized="" formulation(f9).="" this="" could="" be="" due="" to="" the="" nano-size="" of="" the="" lipid="" particles="" which="" offered="" a="" higher="" surface="" area="" for="" the="" chemical="" quenching="" and="" also="" protect="" the="" olp="" in="" the="" external="" environment.="" no="" absorbance="" was="" found="" for="" the="" blank="" slns="" and="" hence="" blank="" slns="" did="" not="" exhibit="" any="" radical="" scavenging="" activity.="" similar="" findings="" were="" reported="" previously".="" the="" value="" of="" anti-oxidation="" activity="" for="" ascorbic="" acid="" was="" supposed="" to="" be="" 69.42±5.38%="" which="" was="" not="" significantly=""><0.05)from the="" optimized="" formulation(f9).="" 3,6.8="" anti-microbial="">

Проучването проявява анти-микробния потенциал на развитата slns формулировка на OLP(F9)срещу бактериите като Staphylococcus aureus(Грам е положителен)и Pseudomonas aeruginosa(Грам е отрицателен), както е показано на Фиг.10 Резултатът показа, че няма зона на инхибиране за празна формулация, тъй като е свободен от ЕКСТРАКТ ОЛП.

Максималната зона на инхибиране за положителен контрол и физическа смес(OLP екстракт+празни SLNs)е наблюдавана в рамките на първите 6h. След тази продължителност(първа 6h), не е имало промяна в зоната на инхибиране на положителния контрол и физическа смес. Стойността на зоната на инхибиране за положителен контрол срещу Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus е съответно 7,5±1,25 mm и 8±1,30 mm. По същия начин е установено, че стойността на зоната на инхибиране за физическата смес(OLP екстракт+празни SlNs)срещу Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus е съответно 8,25±1,9 mm и 8,60±2,1 mm. От друга страна, SLNs, натоварени с OLP, проявяват анти-микробния ефект за по-дълго време(до 24 h)в сравнение със свободната OLP и физическа смес. Това се дължи на устойчивото освобождаване на OLP от SLNs формулиране. Антимикробният ефект на OLP-натоварените SlNs срещу двете грам-положителни

и грам-отрицателни бактерии са наблюдавани до 24 ч. Антимикробният ефект на OLP-SLNs е значително(p<0.001)more than="" that="" of="" olp="" extract="" and="" physical="" mixture="" against="" pseudomonas="" aeruginosa="" and="" staphylococcus="" aureus.="" the="" value="" of="" the="" zone="" of="" inhibition="" of="" opl-slns="" against="" pseudomonas="" aeruginosa="" and="" staphylococcus="" aureus="" was="" observed="" at="" 14.75±2.25="" mm="" and="" 16.30±2.1="" mm="" in="" 24="" h="" respectively.="" moreover,="" study="" findings="" indicated="" that="" all="" formulations="" containing="" olp="" extract="" exhibited="" better="" anti-microbial="" efficiency="" towards="" gram-positive="" staphylococcus="" aureus="" as="" compared="" to="" gram-negative="" pseudomonas="" aeruginosa,4".="" to="" the="" best="" of="" our="" knowledge,="" the="" previous="" report="" showed="" that="" the="" major="" constituents="" for="" antimicrobial="" activity="" present="" in="" the="" olive="" extract="" are="" cyclotrisiloxane="" hexamethyl(36.98%),="" cyclo-tetrasiloxane="" octamethyl(15.18%),="" and="" cyclopentasilox-ane="">

4 Заключение

В това проучване, маслинови листа екстракт прах, който е по-малко стабилен в нормални условия на околната среда е успешно превръща в стабилна SLNs формулировка. Оптимизираната формулировка прояви обещаващ размер на частиците, ефективност на завлапването, както и повърхностни заряди. Оптимизираната формулировка проявява траен модел на освобождаване на наркотици до 24 h след първата поръчка освобождаване на наркотици кинетичен и фикийски дифузия тип механизъм за освобождаване на наркотици. Проведено е проучването за стабилност и оптимизираната формулировка(F9)е стабилна при посочените условия на съхранение. Формулирането на OLP прояви обещаващо анти-оксидантно свойство, както е оправдано от метода на DPPH assay. Антимикробната активност срещу положителния(Staphylococcus aureus) на Грам)и отрицателните(Pseudomonas aeruginosa)бактерии на Грам. Накрая, беше заключено, че SlNs могат да бъдат обещаващите носители за доставка на екстракт от маслиново листо на прах.

Тази статия е извлечена от J. Oleo Sci. 70, (10) 1403-1416 (2021)