В настоящото изследване галактановият екзополизахарид (EPS) отЦистанчеKR780676 беше оценен за неговия потенциал даоблекчават оксидативния стресизползвайки in vitro анализи и in vivo проучвания, Saccharomyces cerevisiae (див тип) и неговитеантиоксидант(sod14, sod24, tsa14, cta2 и ctt12)антиапоптотичен(pep4 и fs14) ипротив стареене(sod24, tsa1 и ctt12)) мутанти с изогенна генна делеция. Галактанът показва силен DPPH иактивност на поглъщане на азотен оксидсъс стойност на lCso съответно 450 и 138 ug/mL. В модела на мутант на дрожди, оксидативният стрес, генериран от H,0., беше екстензивно почистен от галактан в средата, както беше потвърдено с помощта на точкови анализи, последвани от флуоресцентно DCF-DA оцветяване и микроскопски изследвания. Третирането с галактан доведе до намаляване на ROS, генерирани в дрождените мутантни клетки, както се демонстрира чрез намален интензитет на флуоресценция. Освен това, галактанът показва защита срещу окислително увреждане чрез H, O, -индуцирано инхибиране на апоптоза в мутантните щамове на дрожди (pep4 и fs1), което води до повишена степен на оцеляване чрез неутрализиране на оксидативния стрес. При хронологичния анализ на продължителността на живота, WT клетките, третирани с galactanEPS, показват 8 процента увеличение на жизнеспособността, докато sod2 мутантът показва 10-15 процентно увеличение, което показва изразени ефекти против стареене. Галактанът от W. confuse KR780676 има огромен потенциал да бъде използван като естествен антиоксидант за хранителни, фармацевтични и хранителни технологични приложения. Доколкото ни е известно, това е първият доклад за задълбочена оценка на in vivo антиоксидантните свойства на абактериален EPS в моделна система за делеция на дрожди.

Щракнете, за да получите Cistanche Rich на EPS

Окисляването е основен процес за поддържане на биологичните процеси, а също и за производството на енергия във всички живи организми. Реактивните кислородни видове (ROS) и реактивните азотни видове (RNS) се произвеждат от нормалния катаболизъм съответно на кислородните и азотните молекули. Тежкият оксидативен стрес води до различни дегенеративни състояния като увреждане на ДНК, клетъчна дегенерация и канцерогенеза. Те могат да доведат до много здравословни увреждания, като напрстареене, сърдечно-съдови заболявания, рак, цироза, атеросклероза, диабети ревматоиден артрит2-6, антиоксидантите са молекулите, които улавят свободните радикали, генерирани в храната или живата система, и водят до предотвратяване на здравословни състояния, свързани с оксидативно увреждане-9. Въпреки че много синтетични антиоксиданти са налични като силни уловители на радикали, някои от тях са свързани с някои нежелани странични ефекти. С оглед на това има повишен интерес и търсене на естествени антиоксиданти в хранителната и фармацевтичната промишленост. Повечето от полизахаридите на основата на растения и гъби са докладвани като значими защитни агенти срещу ROS11–21. Различни микробни екзополизахариди (EPS), включително от млечнокисели бактерии (LAB), също са докладвани за техните значителни антиоксидантни свойства. Те се считат за по-безопасни алтернативи на синтетичните. През последните години много EPS от LAB са изследвани за техния антиоксидантен потенциал и предотвратяване на окислително увреждане22,23. Антиоксидантният потенциал и защитната роля на Weissella EPS също са докладвани от различни EPS, изолирани от Weissella много щамове като Cistanche EPSWWC, W. confusa OF126, W. cibaria GA44, W. cibaria YB-1, W. confusa W4 и W. cibaria SJ1424–29. In vivo антиоксидантните свойства могат да бъдат изследвани с помощта на различни моделни системи като клетъчни линии30, C.elegans31, дрожди32 и мишки33. Преди това различни съединения са били изследвани за техните потенциални антиоксидантни свойства, използвайки мутантна моделна система за делеция на ген на дрожди Saccharomyces cerevisiae 32, 34–37.

Това проучване е фокусирано върхуантиоксидантен потенциал на галактан EPSпроизведен от пробиотичния щам Cistanche KR780676 от индийска традиционна ферментирала храна (Idli batter)38,39. В тази статия галактановият EPS е скриниран за in vitro антиоксидантен потенциал с помощта на DPPH, азотен оксид и анализи за отстраняване на хидроксилни радикали и in vivo антиоксидант,антиапоптотиченисвойства против стареенеизползвайки мутантна моделна система с делеция на ген на дрожди.

Материали и методи

Всички химикали, включително медийните добавки, са доставени от Hi-Media Laboratories Pvt. Ltd., Индия и DCF-DA (2,7 дихлородихидрофлуоресцеин диацетат) от Sigma.

Микробна култура.ЦистанчеKR780676, изолиран от индийска киселинна ферментирала храна (Idli batter), за която се съобщава, че произвежда галактан EPS, е използван в настоящото проучване 38.

Откриване на производство на EPS. Продуцирането на EPS от W. confusa се наблюдава от нивото на колонията. Накратко, щамът се култивира върху MRS агар (допълнен с 2 процента захароза). След 48 часа при 30 градуса се наблюдава появата на слузести колонии. Производството на галактан EPS беше потвърдено допълнително чрез сканиращ електронен микроскоп (SEM) анализ.

Извличане на EPS. Процесът на екстракция на EPS се извършва съгласно метода, описан в Kavitake et al.38. Пресен инокулум (10 процента) от W. confusa беше добавен към 2 процента усилена със захароза MRS среда при 30 градуса за 48 часа при статични условия. По този начин суспензията беше центрофугирана (12,000×g за 15 минути), за да се изолира биомасата и допълнително обработена с трихлорна кисела киселина, за да се елиминират протеиновите части. Галактан-EPS се утаява с помощта на леденостуден етанол (трикратен обем), центрофугира се (19 200 × g за 15 минути) и полученият EPS се разтваря в Milli-Q вода. Суровият EPS се диализира при 12–14 kDa (48 часа, 4 градуса) и се лиофилизира чрез лиофилизация за 48 часа.

In vitro антиоксидантни свойства на галактан EPS. DPPH анализът за галактан беше извършен съгласно по-ранния доклад на Ye et al.9 и процентът на изчистваща активност (процент) беше изчислен чрез следното уравнение.

където Ao и As са абсорбцията съответно на контролата (празна, без EPS) и пробата. Тестът за отстраняване на радикали от азотен оксид (NO) за галактан беше извършен съгласно Sreejayan et al.40 и изчислен по следното уравнение,

където Ao е абсорбцията на контролата (празна, без EPS) и As е абсорбцията в присъствието на EPS. Редуциращата енергийна активност беше измерена за галактанов EPS, както е докладвано от Ye et al.9. Абсорбцията се отчита при 700 nm и редуктивният потенциал е показан чрез висок капацитет на абсорбция на реакционната смес. Аскорбиновата киселина (Vc) се използва като положителна контрола. Активността за отстраняване на хидроксилни радикали на галактан EPS беше оценена, както е описано от Yang et al.41. Абсорбцията се отчита при 536 nm и процентът на почистване се изчислява като:

където проба е абсорбцията на пробата, празната проба е абсорбцията в отсъствието на проба и разтвор на H2O2, а контролата е абсорбцията в отсъствието на пробата

In vivo антиоксидантни свойства на галактан EPS в мутантни щамове на дрожди.

Дрождите, S. cerevisiae, BY4741 див тип (WT) (MATa his3∆:leu2∆:met15∆:ura3∆) и мутантните щамове с генна делеция бяха получени от Thermo Fisher Scientific, САЩ. Щамове дрожди се отглеждат в дрождена пептон декстрозна (YPD) среда, допълнена с или без 200 ug/mL генетицин (G418 сулфат) за селекция на мутанти. Твърдата среда на YPD се приготвя чрез добавяне на 2 процента Bacto агар към течната среда на YPD42.

Ефект на EPS върху растежа на дрождите. Експоненциално растяща култура от див тип (WT) дрожди (приблизително 1 × 104 клетки) се третира с различни концентрации (0–400 ug/mL) EPS в микрогнездова плака и крайният обем се довежда до 200 μL с YPD бульон. Културата се инкубира в продължение на 18 часа при 30 градуса, последвано от серийно разреждане и разпръскване върху YPD агарови плаки. Плаките се инкубират при 30 градуса в продължение на 2 дни и единиците, образуващи колонии (CFUs), се преброяват и жизнеспособността се изразява като процент CFU43.

Измерване на биомаркери на оксидативен стрес. Експоненциално растящи дрождени WT клетки бяха предварително третирани с или без 300 ug/ml EPS в продължение на 2 часа. Десет клетките бяха изложени на 1 mM H2O2 за 1 час при 30 градуса в шейкър инкубатор и обработени за измерване на активността на SOD и нивата на липидна пероксидация съгласно метода, описан в по-ранни доклади 44–46

Антиоксидантното свойство на EPS в мутанти с делеция на ген S. cerevisiae.

Експоненциално растящи култури на дрожди WT и мутантни щамове с дефицит на антиоксиданти (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆, ctt1∆, glr1∆ и yhb1∆) бяха третирани с 300 ug/mL EPS за 2 часа, последвано от излагане на 1 mM H2O2 за 1 час. Серийно разредените клетки бяха разпръснати върху YPD агарови плаки, инкубирани в продължение на 2 дни при 30 градуса и жизнеспособността беше изчислена. За точков анализ, културите бяха серийно разредени в 10-гънки, 4 μL от които бяха набелязани върху YPD агарови плаки и инкубирани при 30 градуса за 2 дни и фотографирани 43,47. Откриване и измерване на ROS. Експоненциално растящи WT и антиоксидантно-дефицитни мутантни щамове (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆ и ctt1∆) бяха предварително третирани със или без EPS за 2 часа и изложени на 1 mM H2O2 за 1 час при 30 градуса. Клетъчните пелети след центрофугиране при 5000 rpm за 5 минути се промиват два пъти с PBS буфер, ресуспендират се в 200 μL PBS и се инкубират с 20 μM DCF-DA на тъмно за 15-20 минути при стайна температура. Веднага след инкубацията, клетките се промиват два пъти с PBS, монтират се върху слайдовете и се наблюдават под флуоресцентен микроскоп Olympus Ix71 под 40 × обектив, като се използва син филтър. За количествено определяне на ROS, оцветените с DCF DA клетки се ресуспендират в 200 μL PBS след промиване и интензитетът на DCF флуоресценцията се измерва с помощта на спектрофлуорометър при максимум на възбуждане и дължини на вълната на излъчване от 495/529 nm. Флуоресцентните единици бяха нанесени спрямо всяка третирана и нетретирана култура и сравнени48,49.

Антиапоптотична активност на галактан.

Точкови и CFU анализи. Експоненциално отглеждани WT и анти-апоптозно-дефицитни мутантни (pep4∆ и fs1∆) клетки бяха предварително третирани с EPS и инкубирани заедно със съответните нетретирани контроли за 2 часа. За броя на CFU, културите бяха третирани или нетретирани с EPS в продължение на 2 часа и инкубирани с 0.5 mM H2O2 в продължение на 1 час. Всяка серийно разредена култура се разпространява върху YPD агарови плаки и се инкубира при 30 градуса за 2 дни и клетъчната жизнеспособност се представя като процент CFU. За точков анализ, културите бяха разрешени за серийно разреждане, последвано от нанасяне върху YPD агарови плаки със или без 1 mM H2O2. Плаките се инкубират при 30 градуса в продължение на 2 дни и се фотографират47.

Откриване на антиапоптотичен маркер на EPS

използване на мутантни щамове на дрожди. За по-нататъшно потвърждаване на спасителното действие на EPS върху клетки от дрожди от апоптотична клетъчна смърт, индуцирана от водороден пероксид в дрожди, WT и антиапоптотични дефицитни мутантни щамове (pep4∆ и fs1∆) бяха изследвани за маркери на апоптоза. Експоненциално растящи WT, pep4∆ и fs1∆ клетки бяха третирани или нетретирани с 300 µg/mL EPS за 2 часа и след това бяха изложени на 1 mM H2O2 за 1 час. Както третираните, така и нетретираните клетки се оцветяват с акридиново оранжево и етидиев бромид (AO/EB) и се наблюдават под флуоресцентен микроскоп за кондензация на хроматин50,51. За оцветяване с DAPI, третираните и нетретирани клетки се фиксират с 4% параформалдехид и се инкубират с 1 ug/mL DAPI за 5-10 минути на тъмно при стайна температура. Клетките се монтират върху слайдовете след промиване с PBS и се наблюдават под флуоресцентен микроскоп Olympus IX71 (UV филтър, 40 × обектив) за ядрена фрагментация 52, 53.

Ефектът против стареене на EPS чрез хронологичен анализ на продължителността на живота.

Култури от див тип дрожди и мутантни култури с дефицит на антиоксиданти (sod2∆, tsa1∆ и ctt1∆) се отглеждат, за да достигнат стационарната фаза и се инкубират с или без EPS за анализ на хронологичната продължителност на живота (CLS). Преживяемостта на всеки щам се изчислява на различни интервали от време от 0 до 30 дни. Клетъчната жизнеспособност се изразява като процент CFU както за третираните, така и за нетретираните култури54,55. Статистически анализ. Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра (±SD) и статистически анализирани с помощта на софтуер IBM SPSS 20 в еднопосочен ANOVA модел. Сравнителният тест на HSD на Tukey (стр<0.05) was used to measure the significance level. 

Резултати и дискусия Млечнокиселите бактерии (LAB), изолирани от ферментирали храни, привлякоха огромно внимание на хранителните технолози през последните няколко години поради техните доказани пробиотични свойства. Сред бактериите, изолирани от индийски ферментирали храни са Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp. и по-малко проучените Weisella spp. Подобно на другите полезни LABs, за щама Cistanche KR780676, който беше изолиран от ферментирало тесто idli в нашата лаборатория, се съобщава, че действа като потенциален пробиотичен кандидат39. По-ранни доклади, този галактан е характеризиран като линеен хомополизахарид и също така е изследван за неговите физикохимични, функционални и емулгиращи свойства 38, 56–58. Ние също така съобщихме, че клетките и клетъчните супернатанти на W. confusa KR780676 показват силна антиоксидантна активност39. Производството на EPS от W. confusa KR780676 се наблюдава върху MRS агарна плака, обогатена с 2 процента захароза, инкубирана в продължение на 48 часа (Фиг. 1A-i), което разкрива лигави колонии на Weissella и допълнително се потвърждава в SEM изображение (на колонията Weissella) показващ присъствието на галактан EPS заедно с клетките (фиг. 1A-ii). Стъпка по стъпка производството на EPS е прегледано с графичното представяне на Фиг. 1B.

In vitro антиоксидантни свойства на галактан EPS. Както е показано на Фиг. 2А, се наблюдава, че DPPH почистващата активност е зависима от концентрацията, почистващата активност се повишава с концентрацията на галактан. Полумаксималната ефективна концентрация (IC50) на аскорбиновата киселина е 8,8 µg/mL, докато галактан EPS е 450 µg/mL. 1,1-дифенил-2-пикрилхидразил (DPPH) е стабилен свободен радикал, който делокализира несдвоените електрони срещу молекулата като цяло, като по този начин предотвратява димеризацията на молекулите и води до тъмно виолетов цвят59. Когато DPPH разтвор се добави към различни концентрации (50 до 500 µg/mL) галактан, това води до намаляване на виолетовия цвят с увеличаване на концентрацията. Антиоксиданти, когато реагират с електрон на DPPH, тъмно виолетовият цвят на DPPH се превръща в светло виолетов цвят; а интензитетът на цвета зависи от антиоксидантната активност на субстрата60. Галактан показа 60 процента потенциал за почистване на DPPH, който е по-висок от EPS от ендофитната бактерия Paenibacillus polymyxa EJS-3 (<45.40%)33.

Азотният оксид се получава, когато натриевият нитропрусид се разложи във воден разтвор при рН 7,2. Нитратите и нитритите се произвеждат при аеробни условия, когато азотният оксид се свързва с кислорода61. Както е показано на фиг. 2B, галактанът има потенциала да намали генерирането на азотен оксид от натриев нитропрусид, тъй като полумаксималната ефективна концентрация (IC50) е 138 µg/mL, докато стандартната аскорбинова киселина е 11 µg/mL. Както е показано на фиг. 2C, активността на намаляване на мощността на EPS е положително свързана с концентрацията му в нарастващ ред. Стандарт (аскорбинова киселина) показва по-висок редуциращ капацитет от галактан EPS, което е в съгласие с Ye et al.9. Намаляването на енергийната активност на галактана показва потенциалната антиоксидантна активност. Когато калиев ферицианид [K3Fe (CN)6] се добави към галактан EPS, антиоксидантите, присъстващи в него, се редуцират до калиев ферицианид [K4Fe(CN)6]

Фигура 2. In vitro антиоксидантни свойства на галактан. (A) DPPH радикална активност, (B) Анализ на азотен оксид, (C) Редукционен анализ на мощността и (D) Хидроксилна радикална активност на галактан EPS.

Активността на галактан за отстраняване на хидроксилни радикали е показана на Фиг. 2D. Галактанът показва 41,93 процента като най-висока активност, докато 58,10 процента при стандарта при същата концентрация (1 mg/mL). Тенденцията на резултатите е в съответствие с предишни доклади за EPS от Lactobacillus plantarum C88 (85,21 процента за 4 mg/mL концентрация на EPS)62 и Paenibacillus polymyxa EJS-3 (68,55 процента за 1 mg/mL концентрация на EPS)63. В сравнение със стандартите галактанът показа 72,16 процента ефективност, докато EPS от Lactobacillus plantarum C8862 и Paenibacillus polymyxa EJS-363 показаха съответно 95,19 и 68,55 процента ефективност.

In vivo антиоксидантни свойства на галактан EPS в модел на дрожди. По-ранни доклади показват различни биологични свойства, насърчаващи здравето, като антипролиферативни, противоязвени, понижаващи холестерола, антиоксидантни, противовъзпалителни и имуномодулиращи активности на EPS, получен от LAB64. От тази гледна точка става важно да се оцени в детайли антиоксидантният ефект на EPS, който би могъл да подпомогне техния пребиотичен и/или пробиотичен потенциал, главно за поддържане на чревната хомеостаза чрез облекчаване на оксидативния стрес. Клетъчният антиоксидантен механизъм играе критична роля за облекчаване на неизбежните ROS, генерирани чрез решаващи клетъчни метаболитни пътища. Дисбалансът между вродената антиоксидантна защита на клетката и генерираните ROS може да бъде много пагубен за клетките. Тежкият оксидативен стрес причинява потенциално увреждане на жизненоважни клетъчни компоненти, протеини, нуклеинови киселини и липидни молекули, което от своя страна засяга много основни сигнални пътища и предизвиква апоптоза. Доказано е, че хранителният прием на антиоксиданти понижава честотата на маркерите за клетъчно увреждане като нива на ROS, ROS-медиирано увреждане на ДНК, апоптоза и клетъчна трансформация, което допълнително води до намалена честота на свързаните с възрастта нарушения65 Микробни EPS като ксантан и леванс са показали антиоксидантна активност в in vitro анализи (DPPH и анализи на хидроксилни радикали)5 и срещу човешки стомашни ракови клетки BGC-823, съответно66. По-рано, в това проучване, ние оценихме антиоксидантните, антиапоптозните и антистареещите ефекти, упражнявани от галактан EPS, изолиран от W. confusa KR780676, използвайки дрожди Saccharomyces cerevisiae BY4741 като модел на организъм.

Ефект на EPS върху растежа на дрождите. Клетки от див тип дрожди, третирани с различни концентрации на EPS, не показват никакви дефекти в растежа, потвърждаващи, че галактанът не индуцира никаква цитотоксичност или дефекти в растежа при никоя от концентрациите, вариращи от 0 до 400 ug/mL (фиг. 3A). ). Клетки, третирани с 300 ug/mL или по-висока концентрация на галактан, показват значително по-висок растеж, което показва, че галактанът има стимулираща растежа на дрождите активност.

Концентрация на галактан от 300 ug/mL се използва за последващи експерименти с щамове дрожди. Галактанът намалява ензимната активност на SOD. Следвайки силната in vitro антиоксидантна активност, проявена от галактан EPS, допълнително подложен на проверка на ефекта му върху активността на SOD в WT клетките на дрождите. Нашите резултати (фиг. 3B) показват, че оксидативният стрес, предизвикан от третирането с H2O2, причинява рязко повишаване на SOD активността на третираните с H2O2- WT клетки в сравнение с нетретираните клетки. За разлика от това, предварителното третиране с галактан на WT клетки, последвано от излагане на H2O2, води до двойно намаляване на активността на SOD в сравнение с това на клетките, третирани само с H2O2, което показва, че галактанът помага на клетките на дрождите при управлението на индуцираното от супероксидни радикали оксидативно стрес47,67.

Оксидативен стресиндуцирана от третиране с пероксид, активира супероксидния ензим и промяната в нивото на активността на SOD е пряка мярка за нивото на клетъчния оксидативен стрес. В това изследване е използван методът за намаляване на NBT, където NBT е индикатор за производство на супероксиден радикал. Инхибирането на намаляването на NBT е пряка мярка за SOD. Тъй като SOD се конкурира с NBT за супероксидни радикали, генерирани чрез излагане на рибофлавин на видима светлина в присъствието на кислород и метионин, който е донор на електрони. Супероксидът редуцира NBT до продукт със син цвят, формазан, който може да бъде колориметрично измерен при 560 nm.

Предишни доклади показват, че LAB EPS е проявил антиоксидантен ефект по начин, зависим от концентрацията, в in vitro анализи и в клетъчни линии на рак на дебелото черво и in vivo модели. Способността на EPS да пречиства ROS може да се дължи на техните различни химични групи68. Доказано е, че други от EPS (500 µg/ml) от Bacillus amyl liquefacient значително влияят върху активността на SOD и защитават HepG2 клетките от оксидативен стрес, предизвикан от H2O2 68. По подобен начин EPS от L. plantarum показва зависим от концентрацията ефект върху активността на SOD в Caco2 клетки срещу H2O2-индуциран оксидативен стрес69. Нашите резултати, в съответствие с тези доклади, показват, че предварителната обработка с галактан EPS премахва супероксидните радикали, индуцирани от третиране с H2O2 в WT клетки на дрожди.

EPS намалява клетъчната липидна пероксидация. Малондиалдехидът (MDA) е най-изследваният биомаркер за клетъчна липидна пероксидация, който показва нивото на оксидативен стрес. MDA е химически стабилен, силно реактивен диалдехид и може лесно да се свързва с протеини, нуклеинови киселини и липопротеини. Той е силно мутагенен и може значително да повлияе на биохимичните свойства на тези биомолекули, което е вредно за различни сигнални пътища70. Увеличаването на нивата на MDA е индикатор за ROS-индуцирано увреждане на тъканите и неговите повишени нива се откриват в няколко човешки патологии46. В това проучване, за да се изследва как EPS предварителната обработка влияе на липидната пероксидация, индуцирана от H2O2 в дрождени WT клетки, бяха оценени нивата на MDA. Резултатите показват приблизително 1.5- кратно намаление на нивото на MDA в клетките, предварително третирани с EPS, в сравнение с тези, изложени само на H2O2, както е показано на Фиг. 3C.

По-рано е показано, че EPS от L. plantarum C88 намалява нивата на MDA, индуцирани от третиране с H2O2, по дозозависим начин (50-200 ug/ml) в Caco2 клетки, което показва, че индуцираното от пероксид увреждане на мембраната на чревните клетки може да се облекчи чрез добавяне на EPS69 (zhang 2013). Освен това, 500 ug/mL EPS от B. amyloliquefaciens значително намалява H2O2-индуцираната MDA в HepG2 клетки71. Нашите резултати за индуцирани от H2O2- нива на MDA в клетките на дрождите и значителното му намаление след предварително третиране на клетките с галактан EPS показват, че лечението с галактан EPS намалява клетъчната ROS-индуцирана липидна пероксидация и на свой ред може да защити клетките от увреждане на тъканите, причинено от пероксидни радикали и спомагат за поддържане на целостта на клетката

експерименти. * представлява П<0.0001 a signifcant increase/decrease in EPS+ H2O2 treated samples compared to those treated with H2O2 alone.

Галактанът защитава дрождевите антиоксидантни генни мутанти при оксидативен стрес. За да се оцени антиоксидантната способност на галактан, различни мутанти на дрожди с дефицит на антиоксидантен ген (които нямат различни гени за отговор на оксидативен стрес) бяха третирани с галактан и след това изложени на сублетална доза H2O2 42. SOD (sod1∆ и sod2∆), каталаза (cta1∆ и ctt1∆), тиоредоксин пероксидаза (tsa1∆), глутатион редуктаза (glr1∆) и азотен оксид оксидоредуктаза (yhb1∆) мутанти, когато се третират с H2O2. показаха ниска преживяемост (sod1∆ 10,8 процента, sod2∆ 13,17 процента, tsa1∆ 13,55 процента, cta1∆ 15,34 процента, ctt1∆ 17,06 процента, glr1∆ 27,37 процента и yhb1∆ 33,87 процента) срещу WT. За разлика от това, с предварителната обработка с галактан, толерантността срещу оксидативен стрес се повишава при всички мутанти с дефицит на антиоксидантен ген и тяхната жизнеспособност се увеличава значително (sod1∆ 78,43%, sod2∆ 59,96%, cta1∆ 87%, ctt1∆ 87%, tsa1 ∆ 72,73 процента, glr1∆ 75,26 процента и yhb1∆ 82,41 процента), както е показано на Фиг. 4A. Тези резултати предполагат, че галактанът може ефективно да пречиства свободните радикали, индуцирани от H2O2 в мутанти без специфични гени за отговор на оксидативен стрес и защитава клетките от оксидативен стрес. Подобна защита се наблюдава при точковия анализ, където галактанът спасява мутантите от оксидативен стрес и повишава жизнеспособността, както е показано на Фиг. 4В.

Клетките са еволюирали с ензимни антиоксидантни защитни системи, за да издържат на ендогенния оксидативен стрес, причинен от ROS, генерирани чрез различни физиологични реакции, които иначе биха имали вредни ефекти върху благосъстоянието на клетката. Предишни доклади и нашите резултати в това проучване показват, че EPS е в състояние да изчисти ROS и да подобри жизнеспособността на клетките. Нашите резултати с мутантни щамове на отговор на оксидативен стрес на дрожди предполагат, че лечението с галактан EPS премахва както цитозолните, така и митохондриалните супероксидни радикали, индуцирани от третиране с H2O2, както се вижда от повишената жизнеспособност на мутантните щамове sod1∆ и sod2∆ съответно. SOD са първични ензимни антиоксидантни защити в клетките срещу ендогенен и екзогенен оксидативен стрес и мутациите в тези гени са замесени в рак и дегенеративни разстройства. По същия начин, антиоксидантното спасяване на cta1∆ и ctt1∆ (каталазни мутанти) чрез лечение с EPS показва, че лечението с галактан EPS осигурява защита срещу пероксизомен и цитозолен оксидативен стрес, индуциран от H2O2. Каталазата е отговорна за клетъчната детоксикация на водородния пероксид и нейният дефицит е свързан с появата на свързани с възрастта нарушения. TSA1, тиоредоксин пероксидазата е рибозомно свързан и свободен цитоплазмен протеин, който освобождава клетките от стреса от водороден пероксид. Докладите предполагат, че TSA1 също играе роля в окислителното възстановяване на увреждане на ДНК. Нашите резултати предполагат, че лечението с EPS спасява дрождевите tsa1∆ клетки от стрес, предизвикан от пероксид. Пероксиредоксините на бозайниците имат положителен ефект върху клетъчния растеж, метаболизма и имунните функции. Техният дефицит води до повишен клетъчен оксидативен стрес, който засяга ключови сигнални пътища и е замесен в невродегенеративни разстройства, злокачествени заболявания и възпалителни заболявания 72. Глутатионовият антиоксидантен механизъм е друга ензимна антиоксидантна защитна система от първа линия, присъстваща в клетките за преодоляване на оксидативния стрес. GLR1 е дрождевият хомолог на глутатион редуктазата при бозайници, локализира се както в цитозола, така и в митохондриите73. Glr редуцира окисления глутатион (GSSH) до редуциран глутатион (GSH) и играе роля в поддържането на нивата на GSH в клетките, което от своя страна детоксикира супероксидните и хидроксидните радикали, като по този начин предпазва клетките от оксидативен стрес74. Нашите резултати показват висока чувствителност на glr1∆ дрожди към H2O2, която беше облекчена чрез предварително третиране с галактан EPS, което предполага, че галактан EPS може да предпази клетките с дефицит на GLR1 от оксидативен стрес. Интересно е, че дефицитът на глутатион редуктаза е замесен в стареенето и свързаните с възрастта метаболитни, дегенеративни и сърдечно-съдови нарушения75,76. Както е показано на Фиг. 4A, yhb1∆ също е защитен от галактан EPS срещу H2O2 стрес, което предполага, че галактан EPS защитава клетките, които са с дефицит на YHB1 от оксидативен стрес. Дрождите YHB1 са предпочитан хемоглобин, за който се съобщава, че предпазва клетките от стрес от азотен оксид77 и оксидативен стрес78. Доказателствата сочат, че човешкият хомолог на YHB1 изглежда спасява клетките от алфа-синуклеинова токсичност, която е биомаркер на болестта на Паркинсон79. Тези предишни открития и нашите резултати предполагат, че EPS може да насърчи клетъчното оцеляване срещу развитието на дегенеративни разстройства.

За да се оцени нивото на ROS в дрождевите мутанти с присъствието и отсъствието на галактан при H2O2 стрес, клетките на дрождите се наблюдават под флуоресцентен микроскоп и нивото на вътреклетъчно окисление се изчислява със спектрофлуорометър 47, 48. Дрождените мутанти, третирани само с H2O2, показват повече зелени флуоресцентни клетки в сравнение с тези, които са били предварително третирани с галактан. (Фиг. 4C). Интензитетът на флуоресценция на DCF се увеличава с приблизително 60 процента, докато с предварителна обработка с галактан, той намалява до приблизително 30 процента в третирани с H2O2- дрождеви мутанти в сравнение с WT и съответната контрола (фиг. 4D). Както микроскопските, така и спектрофотометричните резултати показват повишено ниво на ROS в клетките, които нямат специфични антиоксидантни гени в сравнение със съответните контроли. Култури, предварително третирани с галактан и след това изложени на H2O2, показват намалена флуоресценция в сравнение с тези без предварителна обработка с галактан, което предполага, че галактанът намалява експозицията на ROS индукция на H2O2 в дрождеви мутантни клетки и насърчава клетъчното оцеляване. Във всички горепосочени експерименти, когато клетките бяха промити преди добавянето на H2O2 не показаха значително спасяване (допълнителни данни), което показва, че изчистването на ROS от галактан се дължи на директно изчистване в средата, а не на вътреклетъчното действие.