Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Моля, щракнете тук за част 2

I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4,* и Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1 Завършил Институт по неврална регенеративна медицина, Колеж по медицински науки и технологии, Медицински университет в Тайпе, Тайпе 11031, Тайван

2 Институт по молекулярна биология, Academia Sinica, Тайпе 11529, Тайван

3 Институт по клинична медицина, Медицински колеж, Национален университет Cheng Kung, Тайнан 70403, Тайван

4 Изследователски център по клинична медицина, Национална университетска болница Cheng Kung, Колеж по медицина, Национален университет Cheng Kung, Тайнан 70403, Тайван

5 Департамент и Институт по биомедицински науки, Медицински колеж, Университет Чанг Гун, Таоюан 33302, Тайван

6 Изследователски център по невронауки, болница Chang Gung Memorial, Linkou 33302, Тайван

7 Водещ контакт

*Кореспонденция: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche може да подобри паметта

РЕЗЮМЕ

Фенотипната вариация е основна предпоставка за еволюцията на клетката и организма чрез естествен подбор. Докато ролята на стохастичната генна експресия във фенотипното разнообразие на генетично идентични клетки е добре проучена, не се знае много по отношение на връзката между стохастичната генна експресия и индивидуалните поведенчески вариации при животните. Ние демонстрираме, че специфична miRNA (miR-466f-3p) се регулира нагоре в хипокампуса на част от отделни инбредни мишки при задача с воден лабиринт на Морис. Показателно е, че miR- 466f-3p регулира положително невронната морфология, функция и пространствено обучение, ипаметспособността на мишките. Механично, miR-466f-3p потиска транслацията на MEF2A, отрицателен регулатор на обучението/памет. И накрая, ние показваме, че променливата регулация на хипокампалния miR-466f-3p е резултат от рандомизирано фосфорилиране на свързване на елемент с отговор на хипокампалния цикличен AMP (cAMP) (CREB) при индивиди. Това откритие за модулиране на пространственото обучение ипаметчрез рандомизирана хипокампална сигнална ос при невронална стимулация представлява демонстрация на това как вариациите в експресията на тъканен ген водят до разнообразно поведение на животните.

ВЪВЕДЕНИЕ

Фенотипната вариация сред индивидите дава еволюционно предимство, тъй като осигурява разнообразието на популацията, върху което действа естественият подбор (Pavlicev et al., 2011). Генетичният произход и факторите на околната среда допринасят за генерирането на такава естествена вариация (Bendesky and Bargmann, 2011). Експериментално инбредните мишки често са били използвани за изследване на молекулярната и клетъчната основа на средните фенотипове и поведение, така че да се сведат до минимум ефектите от генетичните различия сред тестваните индивиди (Casellas, 2011). Въпреки това, вариации в изобилието на тъканни транскрипти са показани между отделни изогенни мишки. Гените, проявяващи силно променливи нива на експресия, често се свързват с имунната функция, реакциите на стрес и хормоналната регулация, т.е. процеси, чувствителни към сигнали от околната среда (Vedell et al., 2011). Някои от тези проучвания показват също, че разликите в генната експресия или клетъчното сигнализиране, със или без влиянието на фактори на околната среда като облизване от майката, осигуряване на хранителни вещества в утробата или предизвикана от стрес устойчивост срещу чувствителност (Bale, 2015; Danchin et al. ., 2011; Лорш

и др., 2019 г.; Pedersen et al., 2011), може да доведе до разлики във фенотипите и поведението (Casellas, 2011; Locke et al., 2015; Loos et al., 2015; Oey et al., 2015).

Пространствено обучение ипаметобразуването, контролирано от мозъка, може да бъде разделено на две системи: (1) егоцентрична навигация, използваща самодвижение и вътрешни сигнали и (2) алоцентрична навигация, включваща предимно хипокампуса и близките мозъчни структури, която се стимулира от дистални сигнали извън организмите (Ekstrom и др., 2014). Способността за пространствено обучение ипаметпозволява на повечето животински видове прогресивно да коригират поведението си, за да се адаптират в пространствени и времеви променливи среди, което е критично за тяхното оцеляване. Това може да бъде оценено при лабораторни животни чрез прилагане на поведенчески парадигми като водния лабиринт на Морис (MWM) (Vorhees and Williams, 2014). Трябва да се отбележи, че е доказано, че генетично идентични инбредни гризачи проявяват фенотипни вариации в пространственото обучение ипамет(Tsai et al., 2002), но основните механизми на тази поведенческа вариация остават неизвестни.

Формирането на нови спомени е сложен процес, изискващ зависима от дейността генна транскрипция, синтез на нов протеин и

Фигура 1. Корелация между вариацията на пространственото обучение ипаметвъзможност и miR-466f-3p индукция

(A) MWM задача на инбредни C57BL/6J мишки от див тип. Ляв панел: MWM характеристики на GLN мишки (точки) и PLN мишки (квадрати). От общо 289 тествани мишки, 180 бяха категоризирани като GLN и 109 като PLN. Десен панел: тест на MWM задачата (n=47 и 30във всяка група). Измерванията на всеки четири квадранта и региона на платформата се сравняват в хистограмата. П, място на липсващата платформа; T, целева зона без P; R, дясна зона; O, срещуположна зона; L, лява зона. (B) RT-qPCR анализ на експресията на miRNA. Относителните нива на експресия на шест miRNAs, разположени в miR-466-669 клъстера и miR-132-3p, като положителна контрола, обогатена с мозъка, бяха анализирани и нормализирани с вътрешна контрола U6 snRNA от GLN и PLN миши хипокампус (n=9–18 на група). I, miR-466f- 3p; II, miR-466g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3стр.

фино настроена специфична невронна мрежа катопаметенграми за създаване на нови невронни връзки и устойчива пластичност (Asok et al., 2019). Хипокампалните енграми, които са редки популации от неврони в зъбния гирус (DG), представляват ансамбли от неврони, показващи повишена активност следпаметобразуване. Докато DG енграмните неврони проявяват силно отчетлив модел на генна експресия (Rao-Ruiz et al., 2019), специфичните за енграмата молекулярни механизми, лежащи в основатапаметконсолидацията остават до голяма степен неизвестни. Известно е, че различни фактори и сигнални пътища регулират положително или отрицателно ученето ипаметса идентифицирани процеси (Abraham et al., 2019; Humeau and Choquet, 2019). Сред тях, активираната форма на цикличен AMP (cAMP)-отговор елемент-свързващ протеин (CREB) стимулира генна транскрипция в отговор на зависими от активността увеличения на вътреклетъчния Ca2 плюс в невроните (Kandel, 2012). От друга страна, пътят на camp/PKA репресира транскрипционната активност на миоцитен усилвател фактор 2 (MEF2) чрез предотвратяване на ядрен износ на неговия ко-репресор, HDAC5, и ядрен импорт на ко-активатор NFAT (Belfield et al., 2006). Освен това, за разлика от CREB, активността на MEF2A ограничавапаметобразуване (Cole et al., 2012). Освен протеиновите фактори, микроРНК (miRNA) също участват в регулирането на невронните функции, включително учене и памет (McNeill и Van Vactor, 2012). miPHKs са малки (22 nt) некодиращи РНК, които основно действат като пост-транскрипционни регулатори на генната експресия чрез специфично за последователността базово сдвояване с техните места за разпознаване в 30-те нетранслирани области (30 UTR) на специфични иРНК (Daugaard and Hansen, 2017). miRNAs участват в редица сигнални пътища в постмитотични неврони и те медиират зависими от активността клетъчни процеси, включително дендритен растеж и разклоняване, образуване на синапс и съзряване. Чрез регулиране на генната експресия те също играят важна роля в дълготрайните форми на синаптична пластичност, които са в основатапаметформиране, извличане и консолидация (Chen and Shen, 2013; Wang et al., 2012b).

По-долу представяме доказателства за причинно-следствена връзка между експресията на стохастичен тъканен ген и индивидуалните поведенчески вариации при животните. По-специално, ние показваме, че стохастичното активиране на хипокампалната ос CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A модулира индивидуалната вариация на пространственото обучение ипаметспособност при инбредни мишки.

РЕЗУЛТАТИ

Индивидуална вариация на пространственото обучение ипаметспособност е свързана с miR-466f-3p индукция от специфичен miRNA клъстер

За идентифициране на miPHK, участващи в регулирането на ученето ипаметформация, ние използвахме задачата MWM, за да разграничим инбредни мишки от див тип C57BL/6J с добра или лоша способност за учене и памет (Фигура 1А). Ние дефинирахме мишки, които са изпълнили задачата в рамките на 30 s в последната (6-та) сесия, като „добри обучаеми“ (GLN), докато мишките, които не могат да намерят платформата в рамките на 30 s в последната сесия, се считат за „лоши учещи“ “ (PLN). Както е показано на Фигура 1А (ляв панел), 62 процента от мишките принадлежат към групата GLN (180 от 289 мишки), показвайки значително намаляване на латентността на бягство от 98,1 s (1-ва сесия) до 21,8 s (6-та сесия). За разлика от това, латентността на бягство на останалите 38 процента от мишките, групата PLN (109 от 289 мишки), е само умерено намалена между първата и шестата сесия (от 111,8 s в първата сесия до 82,1 s в 6-тата сесия) . Тестът на сондата, показващ, че мишките наистина са научили задачата през шестте сесии, също показа, че GLN мишките остават по-дълго в областта на платформата, отколкото PLN мишките (Фигура 1A, лява двойка ленти в десния панел).

След това анализирахме РНК от хипокампуса на GLN и PLN мишки чрез хибридизация на miRNA микрочипове (n=4 всяка група). Като цяло, ние наблюдавахме относително незначителни разлики в експресионните профили на хипокампалните миРНК от GLN и PLN мишки. Въпреки това, ние отбелязахме, че първите 10 miPHK, за които нивата на експресия са по-високи при GLN мишки, отколкото PLN мишки (данните не са показани), всички са получени от един и същ специфичен за гризачи miRNA клъстер, miR-466-669, разположен в интрон 10 на генът mSfmbt2 (виж по-долу). Въз основа на анализ на обратна транскрипция-количествена полимеразна верижна реакция (RT-qPCR) нивата на експресия на избрани miPHK в клъстера, ние избрахме miR-466f-3p за по-нататъшно изследване (Фигура 1B). Средната експресия на тази miPHK е 15-пъти по-висока в хипокампуса на GLN мишки в сравнение с PLN мишки. Трябва да се отбележи, че средните нива на хипокампалния miR-466f-3p са сходни сред групата на PLN, контролната група в домашна клетка (HC) и контролната група на плуване (Фигура 1C), като по този начин се изключват свързаните с упражненията ефекти по време на плуване и допълнително подкрепя идеята, че miR-466f-3p е индуциран по време на пространствено обучение ипаметобразуване.

На фигура 1C данните разкриват, че нивата на експресия на хипокампалния miR-466f-3p на над 42 процента от GLN мишки са били поне 1.5-пъти по-високи от средното ниво на експресия на HC контролни мишки, докато нивата в 15 процента от PLN мишките са наполовина от тези на HC мишки. Приблизително 25 процента от GLN мишките и 55 процента от PLN мишките са имали подобни нива на miR-466f{{10}}p (0.8- до 1.2- сгъване спрямо HC). Точковата диаграма на корелация на Pearson, показваща положителна корелация между нивата на miR-466f-3p и процентната продължителност на платформата по време на теста на сондата, е представена на Фигура 1D. Ние също така извършихме miR-466f-3p и U6 малка ядрена РНК (snRNA) in situ хибридизация (ISH) на мозъчните срезове както в GLN, така и в PLN мишки (Фигура 1E). Статистическият анализ на miR- 466f-3p сигналите чрез ISH потвърждава, че индукцията на miR-466f- 3p наистина е по-голяма в DG на GLN мишки в сравнение с тази на

PLN мишки, докато не беше открита разлика, когато бяха сравнени U6 snRNA сигналите (дясна хистограма, Фигура 1E). Въпреки че miR-466-3p сигналите не са еднакви сред отделните гранулирани клетки в DG, те все още се увеличават значително и повсеместно в хипокампуса на GLN мишки в сравнение с PLN мишки. Следователно индукцията на miR-466f-3p не се случва само в малка част от клетките, например енграмните неврони. Тези данни показват, че регулирането на miR-466f-3p по време на задачата MWM е тясно свързано с по-добро пространствено обучение ипаметспособност сред значителна част от GLN мишки.

Ние също така анализирахме средните нива на експресия на няколко специфични за мозъка miPHK чрез RT-qPCR. Сред тях, miR-132-3p беше регулиран нагоре в миши хипокампус след задачата MWM, но не наблюдавахме значителни разлики между GLN и PLN групите (двойка ленти VII, Фигура 1B). Нивата на експресия на miR-335-5p и miR-22 са подобни сред групите GLN, PLN и HC (Фигура S1A). По този начин, за разлика от miR-466f-3p, хипокампалната експресия на тези miPHK по време на MWM обучение не е свързана с пространственото обучение ипаметспособността на мишките.

miR-466f-3p регулирането нагоре насърчава невритния растеж и образуването на дендритни шипове

За да потвърдим, че miR-466f-3p наистина е експресиран в неврони, ние извършихме miPHK ISH, комбинирано с имунофлуоресцентно (IF) оцветяване на NeuN и MAP2 в първични неврони на хипокампа. Резултатите показват, че подобно на други miPHK (Cohen et al., 2011; Thomas et al., 2017), miR-466f-3p се експресира главно в областта на невронната сома, с някои допълнителни сигнали в дендритите (Фигура S2A). За да разберем молекулярната и клетъчната основа на асоциирането на регулирания нагоре miR-466f-3p с ученето ипаметобразуване, ние първо преходно свръхекспресирахме miR-466f-3p заедно със слят полипептид dsRed под контрола на убиквитин промотора от pFUGW- miR-466f-3p- dsRed плазмид в DIV10 първични хипокампални неврони (Фигура S2B). Чрез miRNA ISH, ние потвърдихме, че miR-466f-3p сигналът е по-силен в miR-466f-3p групата на свръхекспресия в сравнение с векторния контрол или мутантния miR{{ 12}}f-3p група (стрелки, фигура S2B). Успоредно с това създадохме платформа за изследване на ефекта на miR-466f-3p загуба на функция чрез инхибиране на miR-466f-3p с помощта на miR-гъба, разположена в 30 UTR на EGFP иРНК, експресирана от pFUGW-miR-sponge-EGFP плазмид (Фигура S2C). EGFP репортерът в гъбения плазмид служи както като индикатор за ефикасността на трансфекцията, така и като сензор за активността на клетъчната миРНК (Kluiver et al., 2012). В значителна част от трансфектираните HEK293T клетки, EGFP сигналът намалява при ко-експресия с див тип miR-466f-3p, но не и с мутантен miR-466f{{32 }}p, поради инхибиране на транслацията на EGFP mRNA чрез свързване на miR-466f-3p към miR- гъба в 30 UTR (сравнете левите четири изображения и две his- програма, Фигура S2C) . За разлика от това, ние не наблюдавахме намален EGFP сигнал при ко-експресия на контролната гъба, кодираща осем копия на разбъркана последователност от pFUGW-SCR- sponge-EGFP плазмид с miR-466f-3p или неговият мутант (сравнете десните четири изображения и две хистограми).

Както е показано на Фигура 2А, ектопичната експресия на miR-466f-3p доведе до морфологични промени на невроните, най-вече засилен невритен растеж по отношение на контролните неврони, трансфектирани с dsRed-експресиращия вектор pFUGW- dsRed или мутантен miR-466f-3p-експресиращ плазмид pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. Количествените данни показват, че средният брой дендритни разклонения на неврон не се различава значително между miR-466f-3p-свръхекспресираща група (лента II) и векторна или мутантна контрола (ленти I и III) (вдясно горна хистограма, Фигура 2A). Въпреки това, средната обща дължина на дендритите и средната дължина на първичните дендрити се увеличават при свръхекспресия на miR-466f-3p (сравнете стълб II с стълбове I и III, дясната долна хистограма на Фигура 2А). Успоредно с това, ние инхибирахме ендогенен miR-466f-3p с помощта на miR-гъба. Както се вижда, няма значителна разлика в броя на дендритните разклонения между miR-466f-3p-инхибиране и контролните групи (сравнете стълб IV с стълбове I и V, дясна горна хистограма, Фигура 2A) , но групата с miR-466f-3p-инхибиране показа забележимо намаление на средната обща дължина на дендритите, както и средните дължини на първичните и вторичните дендрити спрямо други групи (сравнете стълб IV с стълбове I и V, дясна долна хистограма на фигура 2A). Освен това, IF оцветяването показа, че свръхекспресията на miR- 466f-3p, но не и инхибирането, също повишава плътността на дендритните шипове (Фигура 2B, горни панели и долна лява хистограма). Извършихме също съвместно оцветяване за протеин на постсинаптична плътност 95 (PSD-95) и преброихме плътността на колокализираните дендритни шипове, за да установим точния брой възбуждащи синапси (Фигура 2B, долна дясна хистограма), което разкри, че miR{{40 }}f-3p свръхекспресията повишава плътността на PSD-95-положителните шипове в сравнение с други контролни групи. Въпреки това, инхибирането на miR-466f-3p не променя значително плътността на PSD-95-позитивните шипове по отношение на тази на контролните групи (Фигура 2B, долна дясна хистограма). Заедно тези данни показват, че при липса на невронална стимулация, инхибирането на miR-466f-3p само по себе си не засяга плътностите на възбудителните синапси или общите дендритни шипове.