Част 1: Инхибитор на NF-kB и агонист на AMPK: Мрежово прогнозиране и интегриране на Multi-Omics за извличане на сигнални пътища за актеозид срещу болестта на Алцхаймер

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Ин-Ци Ли1†, И Чен1†, Si-Qi Jiang1 , Юан-Юан Ши2 , Сяо-Ли Дзян1 , Шан-Шан Ву1 , Пинг Джоу1 , Hui-Ying Wang1 , Пинг Ли1* и Фей Ли1,2*

¹ състояние Ключ лаборатория на Естествено Лекарства, Китай Фармацевтични Университет, Нанкин, Китай, ² колеж на аптека,Медицински университет Синцзян, Урумчи, Китай

ВЪВЕДЕНИЕ

Със застаряването и бързото нарастване на населението броят на случаите на деменция в света показва тенденция на нарастване.Болест на Алцхаймер(AD) е често срещано невродегенеративно заболяване, придружено от когнитивно увреждане и дискинезия (Perea et al., 2020), което е най-честият тип деменция. Характеризира се с тежка загуба на неврони, сенилни плаки и неврофибриларни възли (Shiao et al., 2017). Патогенезата на AD(Болест на Алцхаймер)е многоизмерен и се свързва с невровъзпалението. Невровъзпалението се задвижва от активирането на глиалните клетки, което е тясно свързано с появата и развитието на AD(Болест на Алцхаймер)(Hanslik и Ulland, 2020; Linnerbauer и Rothhammer, 2020). По време на прогресията и екзацербацията на невровъзпалението, микроглията се счита за ключов фактор.

Микроглиите са първичните имунни клетки в централната нервна система, които са тясно свързани с каскада от процеси като развитие на мозъка, поддържане на невронната среда, както и отговорите на нараняване и възстановяване (Perea et al., 2020). Освен това, микроглията може да бъде стимулирана до M1 фенотип и да увеличи експресията на провъзпалителни цитокини, когато свързаните с невровъзпалителни заболявания като AD(Болест на Алцхаймер)възниква (Tsukahara et al., 2020). Проучванията също така показват, че поляризацията към M1 фенотипа често е придружена от метаболитни нарушения (Li L. et al., 2020), водещи до дисбаланс на енергийния метаболизъм и митохондриална дисфункция (Agrawal and Jha, 2020). Тези неблагоприятни промени са резултат от невродегенерация, дори AD(Болест на Алцхаймер).

Актеозид(ACT), фенилетаноиден гликозид, се извлича основно отCistanche tubulosa. Все повече доказателства предполагат, че ACT притежава множество фармакологични дейности, включително невропротективни (Wei et al., 2019), противовъзпалителни (Lai et al., 2019) и антиоксидантни (Ji et al., 2019) ефекти. По-специално, доказано е, че ACT може да подобри ученето и увреждането на паметта, както и да регулира енергийния метаболизъм при индуцирани от стрептозотоцин плъхове (Chen J. et al., 2020). В допълнение, той може също така да инхибира невроналната апоптотична клетъчна смърт и увреждане на митохондриите при експериментални мишки с автоимунен енцефаломиелит (Li W. et al., 2020). Въпреки това, рядко се съобщава за ефекта на ACT върху поляризацията на M1/M2 на микроглията и неговия механизъм. Досега механизмите като възстановяването на функцията на митохондриите и регулирането на клетъчния метаболизъм са неясни и са необходими допълнителни научни изследвания, за да се изясни точният механизъм.

Целта на настоящия доклад е да изследва терапевтичната ефикасност на ACT, както и основния молекулярен механизъм на ACT върху AD(Болест на Алцхаймер). Тук е установен систематичен in silico метод за идентификация на лекарствената цел въз основа на консолидираните бази данни. Ние допълнително изследваме възможните механизми на ACT на молекулярно биологично ниво чрез интегриране на РНК-секвениране (RNA-seq) с метаболомичен метод и техники на молекулярна биология. Комбинацията от стратегии за систематичен скрининг in silico, in vivo и in vitro осигурява нов протокол за обективно откриване на многоцелеви съединения на традиционната китайска медицина.

Cistanche tubulosa може да лекуваБолест на Алцхаймер

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Мрежово моделиране

Четири онлайн платформи бяха комбинирани, за да предскажат и открият целите на ACT, а именно GeneCards1, ансамбъл подход на сходство (SEA2), SwissTargetPrediction3 и PharmMapper4. Всички генни асоциации на AD(Болест на Алцхаймер)бяха независимо събрани от DisGeNET5 и GeneCards. След анализа на взаимодействието между целта и целта, извършен от String база данни6, мрежата беше допълнително интегрирана от софтуера Cytoscape (Версия 3.8.2). Анализът на обогатяване на GO и KEGG беше извършен в базата данни DAVID7 за анотиране и копаене на мрежата.

Групиране на животни и модели

В това проучване бяха избрани рибки зебра от див тип (щам AB, на възраст 4 месеца) (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Те бяха поддържани при 14/10--часов цикъл светлина/тъмнина при 28oC, следвайки предишния метод (Li YQ et al., 2020). Всички експерименти с рибки зебра бяха проведени под наблюдението на Комитета по етика на животните към Китайския фармацевтичен университет.

Ларвите на зебрата бяха разделени на шест групи и третирани от 3 дни след оплождането (dpf) до 7 dpf: контролна група, моделна група, модел плюс донепезил хидрохлорид (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) група и модел плюс ACT (HPLC чистота 98 процента, Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.) групи. Контролната група се поддържа в среда с 0.2 процента DMSO и моделната група се третира със 150 uM AlCl3 (рН 5,8). Моделът плюс DPZ групата беше третирана съвместно с AlCl3 и 8 uM DPZ. Моделът плюс ACT групите бяха третирани съвместно с AlCl3 и различни концентрации на ACT (200, 100 и 50 uM).

Поведенчески анализ

Движенията на ларвите на зебрата бяха записани от поведенчески анализатор на ViewPoint (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) при 28oC. Накратко, поведенческите параметри и обработката на резултатите бяха в съответствие с метода, който установихме по-рано (Li YQ et al., 2020). Тук средната скорост (AS), промяната на скоростта (AS), степента на възстановяване на дискинезия (DRR) и ефективността на реакцията (RE, процент) бяха избрани за оценка на възстановяването на дискинезия при рибки зебра.

Определяне на ацетилхолинестеразната и холин ацетилтрансферазната активност

След третиране от 3 до 7 dpf, ларвите на риба зебра бяха събрани за измерване на активността на ацетилхолинестераза (AChE) и холин ацетилтрансфераза (ChAT). Въз основа на протокола на производителя, активността беше открита от комплектите за ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай).

Клетъчни култури и лечения

Клетъчна линия BV-2 е закупена от American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, Съединени щати). Те бяха култивирани в DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Китай). Средата беше допълнена с 10 процента FBS (Gibco, Grand Island, NY, Съединени щати),

100 U/ml пеницилин и 100 mg/ml стрептомицин, придружени с 95 процента въздух/5 процента CO2 при 37oC. BV-2 клетки се инкубират с ACT (50, 25 и 12,5 uM) или се стимулират с липополизахарид (LPS, 1 ug/ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Съединени щати) в продължение на 24 часа. Клетките се наблюдават под обърнат микроскоп (Nikon ECLIPSE Ti2, Япония).

Анализ на клетъчната жизнеспособност

Анализ на комплект за броене на клетки-8 (CCK-8) (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Китай) беше използван за оценка на клетъчната жизнеспособност. Накратко, абсорбцията беше измерена при 450 nm с четец на микроплаки (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, Съединени щати).

Анализ на производството на азотен оксид

Азотният оксид (NO) се определя чрез измерване на нивата на нитрит в BV-2 супернатантата на културата с помощта на Griess реактив. Накратко, средата (100 ul) се прехвърля в нова 96-плака с ямки, същият обем реагент на Griess се добавя към всяка ямка и реагира в продължение на 15 минути на тъмно. Абсорбцията при 540 nm се определя от четец на микроплаки.

Нива на възпалителни цитокини в супернатанта

Концентрациите на TNF-a, IL-1 и IL-10 в BV-2 клетъчния супернатант се определят чрез комплекти ELISA съгласно инструкциите на производителя.

Определяне на клетъчния метаболизъм чрез HPLC-Q-TOF-MS анализ

BV-2 клетки се посяват в блюдо с шест ямки отделно (n=6/група). След третирането средата се отстранява и клетките се промиват три пъти със студен PBS. След това те веднага бяха изложени на течен азот, за да потиснат клетъчния метаболизъм. Клетките бяха събрани с 80 процента студен метанол. За да се улесни утаяването на протеини, клетките бяха енергично завихрени за 1 минута и центрофугирани при 13,000 rpm (15 минути, 4oC). Клетъчната суспензия се изсушава под поток от азот. Изсушеният остатък се разтваря в 150 ul предварително охладен 25 процента ацетонитрил. За да се гарантира стабилността и точността на анализа на последователността, всяка клетъчна проба с еднакъв обем (10 ul) се комбинира като проби за качествен контрол. По време на откриването на метаболит, тези проби се инжектират след всеки шест проби, за да се потвърди тяхната стабилност. 1-ul аликвотна част беше инжектирана за HPLC-Q-TOF-MS.

Анализът се извършва на Agilent 1290 HPLC система

свързан с масспектрометъра Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, Съединени щати). Разделянето се извършва на ACQUITY UPLC BEH C18 колона (2.1 min 100 mm, 1.7 um). Подвижната фаза се състои от 0,1 процента мравчена киселина-вода (v/v; A) и ацетонитрил (B).

Скоростта на потока беше настроена на {{0}}.4 ml/min със следните условия за оптимално градиентно елуиране: 0 до 2 минути, 5 процента В; 2 до 20 минути, 5 до 95 процента B (режим на положителни йони); 0 до 2 минути, 5 процента В; 2 до 20 минути, 5 до 95 процента B (режим на отрицателни йони). Работните параметри на масспектрометъра бяха зададени както следва: температура на газа 320oC; изсушаващ газ, 10 L/min; пулверизатор, 35 psi; VCap, 4, 000 V; фрагментатор, 120 V.

данните са проведени с MetaboAnalyst8. В комбинация с литературата, диференциалните метаболити (VIP > 1, t-тест p < 0.05)="" бяха="" идентифицирани="" на="" hmdb9.="" накрая="" беше="" извършен="" анализ="" на="" пътя="" с="">

Измерване на потенциала на митохондриалната мембрана

Потенциалът на митохондриалната мембрана (MMP) беше открит с помощта на флуоресцентна сонда JC-1 (Beyotime, Китай) в съответствие с инструкциите на производителя. Накратко, клетки от различни групи бяха изплакнати с PBS и инкубирани с JC-1 оцветяващ разтвор за 20 минути при 37oC. След оцветяването, клетките се промиват два пъти с помощта на оцветяващ буфер. След това, флуоресцентни сигнали бяха открити чрез поточна цитометрия (BD Accuri C6).

Измерване на митохондриален аденозин 5f-трифосфат

Концентрацията на аденозин 5/-трифосфат (АТР) в митохондриите беше открита от комплект за анализ на АТР (Beyotime, Китай). Накратко, културалната среда на BV-2 клетки от различни групи беше изхвърлена и клетките бяха хомогенизирани с лизисен буфер върху лед. Супернатантата, получена след центрофугиране (12,000 g,

5 минути) се използва за определяне на концентрацията на АТФ. Луминесценцията беше открита от EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Управление на(Болест на Алцхаймер)

Измерване на ниво на вътреклетъчни реактивни кислородни видове

Комплектът за анализ на реактивни кислородни видове (ROS) (Beyotime, Китай) беше използван за измерване на нивото на ROS. Клетките от различни групи се инкубират с DCFH-DA (10 uM) в продължение на 20 минути при 37°C. След зареждане на сондата, клетките се промиват три пъти с DMEM. След това, флуоресцентни сигнали бяха открити чрез поточна цитометрия (BD Accuri C6).

Трансмисионна електронна микроскопия

BV{0}} клетки се посяват в блюдо с шест ямки. Средата се отстранява и 1 ml от 2,5 процента глутаралдехид се добавя бързо към всяка ямка. След това клетките се събират и фиксират с нов 2,5 процента глутаралдехид при 4oC за една нощ. След фиксация, дехидратация и вграждане, клетките се наблюдават с трансмисионен електронен микроскоп HT7800 (Hitachi, Токио, Япония).

RNA-Seq и биоинформационен анализ на данни

Общата РНК от BV{{{{10}}} клетки се екстрахира с помощта на Trizol реагент (Vazyme Biotech, Китай). Всички аналитични проби бяха изпратени до Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) за анализ на РНК последователността. Данните бяха анализирани на онлайн платформата на Majorbio Cloud Platform10. RSEM11 беше използван за количествено определяне на изобилието на ген. По същество, диференциално изразяване Необработените данни бяха обработени под софтуера MassHunter Workstation версия B.07.00 (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, Съединени щати). Суровите данни бяха предварително обработени от платформата XCMS. Анализ на главните компоненти (PCA) и частичен дискриминантен анализ на най-малките квадрати (PLS-DA) на нормализирания анализ беше извършен с помощта на DESeq2/DEGseq/EdgeR с Q стойност 0,05; DEG с|log2FC| > 1 и Q стойност 0,05 (DESeq2 или EdgeR)/Q стойност 0,001 (DEGseq) се считат за значително различни експресирани гени. В допълнение, беше извършен анализ на функционално обогатяване, включително GO и KEGG, за да се идентифицират кои DEGs са значително обогатени в термините и пътищата на GO при p-стойност, коригирана с Bonferroni 0,05 в сравнение с фона на целия транскриптом. Оригиналните данни за последователността са изпратени в базата данни на NCBI Sequence Read Archive.

Количествена полимеразна верижна реакция в реално време

Общата РНК на BV{0}} клетки беше събрана с помощта на RNA-easyTM Isolation Reagent (Vazyme Biotech, Китай) и реакцията на обратна транскрипция беше проведена с FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Китай). Реакциите се извършват съгласно протокола на производителя. cDNA беше подложена на количествени анализи на полимеразна верижна реакция в реално време (qRT-PCR) със специфични праймери и TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Китай). Праймерите са изброени в допълнителна таблица 1 и -актинът е използван като вътрешен контрол. Методът 2-AA CT беше използван за количествен анализ.

Уестърн блот анализ

Клетките на BV-2 бяха лизирани от буфер за лизис RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Китай), съдържащ 1% коктейл от протеазен инхибитор (Thermo Fisher), за да се получи общ протеин. Протеините бяха разделени с 10 процента SDS-PAGE и прехвърлени към NC мембрани. След блокиране с 5 процента обезмаслено мляко/BSA, мембраните се инкубират с AMPKa (Proteintech), p-AMPKa (Affinity Biosciences), PGC-1a (Proteintech), NF-kB (Proteintech), p-NF- kB (ABclonal) или GAPDH (ABclonal) антитела в 5 процента TBST при 4oC за една нощ. Мембраните се инкубират с вторично антитяло, конюгирано с пероксидаза от хрян (ABclonal) при стайна температура в продължение на 1 час. Субстратът ECL Western blotting с висок знак (Tanon, Китай), системата за гел изображения (Tanon, Китай) и софтуерът ImageJ бяха използвани за визуализация и количествено определяне.

Молекулярен докинг

Молекулярният докинг анализ беше извършен с помощта на софтуер Autodock (Версия 4.2). Афинитетът между ACT и протеините се наблюдава от софтуера AutodockTools. Триизмерните (3D) протеинови структури на AMPKa (PDB ID: 5g5j) и NF-kB (PDB ID: 4q3j) бяха извлечени от Protein Data Bank12.

Статистически анализ

Всички данни са изразени като средно стандартно отклонение и са анализирани от GraphPad Prism Software (Версия 8.0.1). Разликите между групите бяха анализирани чрез еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA), последван от теста за множествено сравнение на Tukey. p < 0.05="" се="" счита="" за="" статистически="">

Добавка Cistanche за болестта на Алцхаймер

РЕЗУЛТАТИ

ACT-AD е насочена към мрежа за взаимодействие и прогнозиране на пътя

Чрез консолидирането на множество бази данни бяха получени 253 цели на ACT, докато бяха събрани общо 1697 цели, свързани с AD. След картографиране на целевата мрежа, общо 70 цели бяха абсорбирани в мрежата за целево взаимодействие ACT-AD (Фигура 1А). Анализът на обогатяване на KEGG предполага, че ACT може да има широкоспектърен и многоцелеви ефект (Фигура 1B). Той също така предполага, че ACT има множество пътища, целеви точки и елементи в AD(Болест на Алцхаймер)лечение. Класифицирайте тези пътища, за да получите точна интерпретация на механизмите. ACT може главно да корелира със сигналната трансдукция, ендокринната система, имунната система и клетъчния растеж и смъртта, за да играе конфронтационна роля срещу AD(Болест на Алцхаймер)(Фигура 1C). Струва си да се отбележи, че по-голямата част от тези пътища са свързани с възпалителна реакция. Спекулира се, че противовъзпалителното действие на ACT може да бъде неделима част от неговата конфронтационна роля срещу AD(Болест на Алцхаймер).

ACT облекчава дискинезията и подобрява функцията на холинергичната система при AD(Болест на Алцхаймер)Ларви на зебра

За да се провери мрежовият модел, AlCl3-индуцирана AD(Болест на Алцхаймер)модел в ларви на рибка зебра беше използван за демонстриране на ефекта на ACT. Наблюдавано е движението на ларвите на зебрата в рамките на циклите светлина/тъмнина и техните плувни пътеки са записани (Фигура 1D). Резултатите показват, че ACT ефективно повишава AS и AS на рибките зебра и синергичният ефект се увеличава с увеличаването на дозите (Фигура 1E). DRR и RE разкриха по-интуитивно сравнение на ACT и DPZ (Фигура 1F). Съответно, ACT облекчава дискинезията, проявявайки подобни ефекти като DPZ.

Общоприето е, че холинергичната система играе важна роля в процесите на учене и памет. По този начин дейностите на AChE и ChAT бяха използвани за разкриване на ефекта от ACT. Излагането на AlCl3 в рибка зебра беше изобразено с мозъчна холинергична промяна (Фигура 1G). Важно е, че лечението с ACT потиска активността на AChE. В допълнение, активността на ChAT показва намаление след лечение с ACT. Следователно, ACT показа дълбоко въздействие при AlCl3-индуцирана AD(Болест на Алцхаймер)ларви на рибка зебра.

ACT потиска M1 поляризацията и насърчава M2 поляризацията в LPS-индуцирани BV-2 клетки

За по-нататъшно потвърждаване на мрежата, противовъзпалителният ефект на ACT беше изследван in vitro с помощта на BV-2 микроглиални клетки. След третиране с LPS в продължение на 24 часа, жизнеспособността на BV-2 клетките намалява значително. За щастие, ACT повишава клетъчната жизнеспособност на LPS-индуцирани BV-2 клетки (Фигура 2А). Освен това се наблюдава морфологията на BV-2 клетките. След 24 часа LPS стимулация, това показа, че BV-2 клетките са претърпели M1 поляризационно състояние. Морфологичните промени бяха предотвратени чрез съвместно лечение с ACT (Фигура 2В).

Освен това, резултатите показват, че за разлика от BV-2 клетките, стимулирани от LPS, BV-2 клетките, третирани съвместно с ACT, значително потискат TNF-a, IL-1 и NO (Фигура 2C) експресии в клетъчния супернатант. Това са класически провъзпалителни цитокини като индикатори за M1 поляризация на микроглия. Подобно на резултатите от ELISA, резултатите от qPCR откриха, че TNF-a, азотен оксид синтаза (iNOS),

Експресиите на IL-1 и CD86 mRNA бяха значително инхибирани от лечението с ACT в сравнение с LPS групата (Фигура 2D).

Освен това, ние измерихме нивото на поляризация на M2 микроглия чрез ELISA (Фигура 2C) и qPCR (Фигура 2E) и резултатите показват, че ACT значително повишава нивата на експресия на маркер, свързан с M2 микроглия (IL-10, CD206, TGF- и Arg-1). С една дума, тези резултати показват, че ACT потиска M1 поляризацията на микроглията и насърчава M2 фенотипа.

ACT регулирана M1/M2 поляризация чрез инхибиране на NF-kB пътя

Транскриптомният анализ беше извършен от RNA-seq за изследване на механизма на ACT в BV-2 клетки от цялостно ниво. PCA илюстрира, че контролните, LPS и ACT групите могат да бъдат добре разграничени (Фигура 3A). Той разкрива 899 диференциално експресирани гени (DEG) между контролната група и LPS групата и 49 DEG между LPS групата и ACT

група (Фигура 3B). Последователно анализът на обогатяване с GO (Фигура 3C) и KEGG (Фигура 3D) разкри, че ефектът на ACT е включен в пътя на NF-kB. Наборът от гени, свързани с пътя на NF-kB, беше допълнително потвърден и тяхната хомеостаза със сигурност беше повлияна от LPS. Както се очакваше, ACT значително повлия на техните изрази (Фигура 3E).

Пътят на NF-kB е класически път за регулиране на прогресията на възпалението, което в крайна сметка води до освобождаване на провъзпалителни фактори. За да се получи механична подкрепа, ключовият протеин на NF-kB пътя беше оценен чрез Western blot. Стимулирането на LPS доведе до активиране на NF-kB, свързано с насърчаване на М1 поляризацията. В съответствие с RNA-seq анализа, ACT инхибира LPS-стимулираното NF-kB фосфорилиране (Фигура 3F). Следователно ACT може да облекчи LPS-индуцираната M1 поляризация чрез NF-kB пътя в BV-2 клетки.

ACT Нарушен биосинтез на аргинин, както и биосинтез на пантотенат и CoA

Мрежовото прогнозиране на ACT разкрива, че е свързано с метаболизма на аргинин (Arg) и пролин (Фигура 1B). RNA-seq показа, че пътищата, повлияни от ACT, включват също биосинтеза на Arg, както и биосинтеза на пантотенат и CoA (Фигура 3D). Предполага се, че метаболитните нарушения на BV-2 клетките, индуцирани от LPS стимулация, са свързани с М1 поляризация (Orihuela et al., 2016). По този начин,

ненасочен клетъчен метаболом чрез HPLC-Q-TOF-MS беше използван за идентифициране на ефекта на ACT върху клетъчния метаболизъм. PCA и PLS-DA (Фигура 3G) показват, че контролните, LPS и ACT групите могат да бъдат добре разграничени въз основа на вътреклетъчни метаболити. Нивата на различни метаболити в LPS-индуцирани BV-2 клетки бяха променени след лечение с ACT (Фигура 3H). В сравнение с контролната група, имаше 11 метаболита, които се промениха значително в групата на LPS (допълнителна таблица 2), докато 14 метаболита бяха отчетливо променени след лечението на ACT (допълнителна таблица 3), включвайки 11 метаболитни пътя (фигура 3I). Ефектът от ACT се състои главно в регулиране на метаболизма на аминокиселините, метаболизма на нуклеотидите, енергийния метаболизъм и метаболизма на кофакторите и витамините. Интересно е, че метаболитните пътища, получени от метаболома, са в съответствие с прогнозирането на мрежата и RNA-seq, включително биосинтеза на Arg, както и биосинтеза на пантотенат и CoA. Горното показа, че ACT може да регулира биосинтезата на Arg, както и биосинтезата на пантотенат и CoA в LPS-стимулирани BV- 2 клетки.

Екстракт от цистанче противБолест на Алцхаймер

Моля, щракнете тук за част 2