ЧАСТ 1 Антиоксидантни и антикоагулантни ефекти на фенилпропаноидните гликозиди, изолирани от Broomrapes (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria и P. Ramosa)

Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,

Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*

a University of Ło´d´z, Катедра по обща биохимия, Факултет по биология и опазване на околната среда, 90-236 Ł´od´z, Полша

b Департамент по биохимия и качество на културите, Институт по почвознание и отглеждане на растения, Държавен изследователски институт, 24-100 Пулави, Полша

Център за изследване и опазване на биоразнообразието, Департамент по биология на околната среда, Институт по биология, Университет Ян Кохановски, 25-406 Киелце, Полша

Резюме

Холопаразитни растения от Orobanchaceae, включителноЦистанче, Orobanche и Phelipanche spp, са известни със своето богатство на фенилпропаноидни гликозиди (PPG). Установено е, че много PPG съединения притежават широк спектър от дейности, като антимикробни, противовъзпалителни, антиоксидантни и подобряващи паметта. За да проучим по-добре потенциала за биоактивност на европейските метлачи (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) и десет единични изолирани фенилпропаноидни съставки, ние изследвахме тяхното антирадикално действие, защитен ефект срещу окисление в плазмата in vitro система и влияние върху коагулационните параметри. Тестваните екстракти показват очистваща активност от 50-70 процента от мощността на Trolox. Екстрактът от OC, богат наактеозид, имаше над 20 процента по-добър антирадикален потенциал от PR екстракта, който беше единственият, съдържащ PPGs без B-пръстен катехолна част в ацилната единица. Освен това беше установено, че само осем тествани PPG демонстрират антиоксидантен потенциал в човешка плазма, третирана с H2O2/Fe; въпреки това, трите тествани PPG притежават антикоагулантен потенциал в допълнение към антиоксидантните свойства. Изглежда, че структурата на PPG, особено наличието на ацилни и катехолови части, е свързана главно с техните антиоксидантни свойства. Антикоагулантният потенциал на тези съединения също е свързан с тяхната химична структура. Избрани PPG показват потенциал за лечение на сърдечно-съдови заболявания, свързани с оксидативен стрес.

За повече информация моля свържете се с:Joanna.jia@wecistanche.com

Цистанчеtubulosa има много ефекти

1. Въведение

Оксидативният стрес е широко известен с отрицателното си въздействие върху здравето на живите организми, включително ускореното стареене и някои видове рак. Появата на оксидативен стрес е свързана с нарушен баланс между оксидативните и антиоксидантните механизми (включително ензимна (каталаза, глутатион пероксидаза) и неензимна (глутатион) защита) в клетките на тялото [1]. Свръхпроизводството на реактивни кислородни видове (ROS), включително окислителни радикали и видове със затворена обвивка, е един от основните механизми зад образуването на оксидативен стрес. Въпреки това, биологичният ефект, причинен от ROS, зависи до голяма степен от концентрацията, времето на експозиция и местоположението. При нормални условия (ниска концентрация) кислородните/азотните радикали могат да играят ролята на вторични вестители, но на по-високо ниво те могат да започнат да реагират с биологични структури, като клетъчни мембрани [2]. Сред всички видове ROS, хидроксилният радикал (HO.) причинява едно от най-големите щети на био-макромолекулите: протеини, липиди и ДНК. Известно е, че оксидативният стрес играе важна роля в редица заболявания, включително сърдечно-съдови. Нарушенията на кръвоносната система са свързани и/или предшествани от промени в различни параметри на хемостазата и плазмените биомаркери [1,3].

От друга страна, много природни вещества, като полифеноли и полиненаситени мастни киселини, са идентифицирани като мощни антиоксиданти, способни да предотвратят образуването и/или да намалят реактивните кислородни видове. Съединения с такива свойства се намират в много хранителни продукти и фармацевтични препарати от растителен произход. Следователно диета, обогатена с пресни зеленчуци и плодове, и антиоксидантни терапии, базирани на естествени антиоксиданти, се препоръчват широко, тъй като те могат да намалят нивото на оксидативен стрес и да предотвратят различни патофизиологични процеси [4,5]. Растителните полифеноли са разнообразна група от вторични метаболити, сред които фенолните киселини заемат важно място, тъй като са широко разпространени и проявяват различни биологични ефекти, като антимикробни, антиоксидантни и противовъзпалителни. Фенилпропаноидните гликозиди (PPGs) са естерни де-роднини на хидроксиканелената киселина и те са основният/единственият клас вторични метаболити, присъстващи в холопаразитните растения Orobanchaceae, включителноЦистанче, Orobanche и Phelipanche spp. Няколко вида от това семейство са сериозни вредители по културите, от които фермерите искат да се отърват в полетата (пример Phelipanche ramosa), малко се използват във фармакологията, докато повечето са от малко значение за хората. HerbaЦистанчесе използва широко в азиатската традиционна медицина при лечение на бъбречна недостатъчност и като средство за подобряване на имунитета и паметта, против стареене и умора [6]. Фитохимичните анализи на различни изследователски групи са показали, че фенилпропаноидните гликозиди, като ацетонид, ехинакозид и подиум, са едни от основните активни съставки на Herba Cistanche [7]. Неотдавнашно проучване на няколко вида метла, открити в Полша от Jedrejek et al. [8] показва, че този растителен материал има подобен качествен състав (доминиране на PPG), освен това е равен или дори надвишаваЦистанчеspp. по отношение на съдържанието на активни вещества [8].

Cistanche deserticola има много ефекти, щракнете тук, за да научите повече

Настоящото изследване беше насочено към оценка на антирадикалния и антиоксидантния потенциал, както и влиянието върху параметрите на хемостазата на трите екстракта от метлица (Orobanche Caryophyllaceae – OC, Phelipanache Arenaria – PA и P. ramosa – PR), богати на различни фенилови групи. -

простаноиди, както и техните отделни PPG съставки. Антирадикалният капацитет беше измерен с помощта на 2,2'-азинобис-3-етилбензтиазолин-6-сулфонова киселина/Тролокс еквивалент (ABTS/TE) и 2,2-дифенил-1-пикрилхибразил (DPPH ) тестове. Оксидативният стрес в системата за плазмен тест беше предизвикан с помощта на хидроксилен радикал (H2O2/Fe), след това липидна пероксидация (тест за реактивни видове с тиобарбитурова киселина (TBARS)) и бяха измерени нивото на протеиновите карбонилни и тиолни групи. Сред определените параметри на хемостазата са: активирано парциално тромбопластиново време (APTT), протромбиново време (PT) и тромбиново време (TT).

2. Материали и методи

2.1. Химикали

2,2-дифенил-1-пикрилхидразил радикал (DPPH), 2,2'-азинобис-3-етилбензтиазолин-6-сулфонова киселина (ABTS), калиев персулфат, {{9 }}хидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксилна киселина (Trolox), диметилсулфоксид (DMSO), тиобарбитурова киселина (TBA), мравчена киселина (LC-MS клас), и H2O2 са закупени от Sigma-Aldrich (St. Louis, MO., USA). Метанол (градиент на HPLC) и ацетонитрил (LC-MS клас) бяха получени от Merck (Darmstadt, Германия). Десет фенил-

пропанови съединения, тествани в тази работа, включително 2′-O-ацетилактеозид (97 процента), 2′-O-ацетилполиумозид (98 процента), 3-O-метилполиумозид (96 процента), ацетонид (99 процента), арена вътре (97 процента), кренатозид (98 процента), тенипозид (99 процента), полиумозид (99 процента), тубулозид А (96 процента) и видеманиозид D (96 процента) бяха предварително изолирани от нас от посочения по-долу растителен материал [ 8]. Чистотата на съединенията се оценява с помощта на UHPLC-PDA-MS анализ. Свръхчистата вода беше приготвена вътрешно с помощта на система за пречистване на вода Milli-Q (Millipore Co.). Други реагенти са с аналитичен клас и са предоставени от местни търговски доставчици.

2.2. Растителен материал

Цъфтящи растения от три вида метла, включително Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel и P. Ramos (L.) Pomel, бяха идентифицирани от проф. Renata Piwowarczyk (Университет Ян Кохановски, Киелце, Полша) и събрани от естествен източник в Полша.

Ваучерни екземпляри (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), ксеротермични пасища, паразитиращи Galium boreale, май 2014 г.; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◦N, 22.5801◦E), псамомни и пасища угар, паразитира Artemisia campestris, юни 2014 г.;

P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), поле, паразитизира Solanum Lycopersicum, септември 2014 г.) са депозирани в Хербариума на Университета Ян Кохановски в Киелце (KTC). Растителният материал е лиофилизиран и фино смлян преди екстракция.

2.3. Приготвяне на екстракти от метла

Прахообразен растителен материал (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 g, P. Arenaria (PA) – 3 g и P. ramosa (PR) – 3 g) се екстрахира с 80 процента МеОН при 40 ◦C и 1500 psi (налягане на разтворителя ) с помощта на ускорен ASE 200

екстрактор с разтворител (Dionex, Сънивейл, Калифорния, САЩ). Екстрактите бяха изпарени и изсушени чрез замразяване (сушилня за замразяване Gamma 2–16 LSC, Christ, Германия). Ефективността на екстракцията за OC, PA и PR е съответно 55 процента, 37 процента и 43 процента спрямо теглото на растителния материал. Поради високото съдържание на въглехидрати (данните не са показани), суровите екстракти бяха допълнително пречистени чрез твърдофазова екстракция (SPE) на микроколона Oasis HLB (500 mg; Waters, Milford, MA, USA). Захарите се отстраняват с 1% МеОН, след това съединенията, представляващи интерес, се елуират с 80% МеОН. След отстраняване на разтворителя, OC, PA и PR екстрактите се лиофилизират (Gamma 2–16 LSC сушилня за замразяване) и добивите от SPE пречистване са 53 процента (OC), 67 процента (PA) и 51 процента (PR) .

2.4. Фитохимични характеристики на екстракти от метла

Бяха извършени качествени и количествени анализи на екстракти от метлица, използвайки система ACQUITY UPLC (Waters), свързана с фотодиоден детектор (PDA) и тандемен квадруполен масспектрометър (TQD-MS/MS). Лиофилизирани OC, PA и PR екстракти се разтварят в 50 процента метанол при концентрация 0,50 mg/mL и след това

хроматографиран върху BEH C18 колона (100 × 2.1 mm, 1.7 µm, Waters). Хроматографските условия са както следва: температура на пещта – 25 ◦C,

линеен градиент 10→25 процента подвижна фаза B (0.1 процента мравчена киселина в ацетонитрил) в подвижна фаза A (0.1 процента мравчена киселина в H2O) над 12 min, скорост на потока – 0,4 mL/min, инжекционен обем – 2 μL, UV обхват – 190–490 nm (3,6 nm резолюция). MS анализът се извършва в режим на отрицателни йони с йонизация с електроспрей (ESI), като се използват следните настройки: обхват на сканиране 100–1200 m/z; капилярно напрежение 2,8 kV; напрежение на конуса 35 V;

температура на източника 150 ◦C; температура на десолватация 450 ◦C; опустошаване

газов поток 900 L/h и конусен газов поток 100 L/h. Събирането и обработката на данни бяха извършени с помощта на софтуер Waters MassLynx 4.1.

Пиковете на фенилпропаноидния гликозид (PPG) бяха идентифицирани чрез сравнение на получените LC-MS данни с тези на преди това изолирани съединения [8]. Количественото определяне на PPG в екстракти от метла се основава на метода UPLC-UV с откриване при 330 nm и външно стандартно калибриране с използване наактеозид(Sigma-Aldrich, 99 процента, HPLC) като

групов стандарт. Беше изготвена линейна калибровъчна крива в шест концентрации в диапазона от 1–200 ug/mL и показа добра линейност (R2

0.999). Количествените резултати представляват средната SD стойност от три инжекции и са изразени в милиграмиактеозидеквиваленти (eq) на грам екстракт (mgактеозидeq/g).

2.5. Антирадикална активност in vitro

2.5.1. ABTS анализ за отстраняване на радикали

ABTS антирадикален тест се провежда по метода, описан от Kontek et al. [9], с леки модификации, както следва: 20 процента МеОН се използва за приготвяне на реагенти (7 mM ABTS и 4,9 mM калиев пер-

сулфат); с 50 процента МеОН. Съотношението на пробата към работния разтвор на ABTS беше 1:25 (v/v). Абсорбцията при 734 nm се измерва след 30 минути инкубация

на тъмно с помощта на UV-vis спектрофотометър (Evolution 260 Bio,

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, САЩ).

Инхибирането на абсорбцията (проценти) се изчислява, както следва: [(Absecon-

trol–Absample)/Abscontrol] ×100.

Изчислени са тролокс еквивалентите (TE) на екстракти от метла

използвайки формула TE=msample/mstandard, където m е наклонът на правата

линейни криви (инхибиране на абсорбция спрямо концентрация). Стойността на TE на

пробата описва нейната нормализирана активност срещу Trolox (TEstandard =

1.0). Стойностите на IC50 за OC, PA и PR екстракти и Trolox бяха

достигнати експериментално, след което бяха изчислени от тяхната права линия

криви (инхибиране на абсорбция спрямо концентрация) и се изразяват в

ug/mL.

Анализът е извършен в три екземпляра и резултатите са представени

като средно ± стандартни отклонения (SD).

2.5.2. DPPH анализ за отстраняване на радикали

DPPH антирадикален тест се провежда по метода, описан от Jedrejek et al. [8] и Brand-Williams et al. [10], с леки модификации, както следва: разтворите на OC, PA и PR екстракти, при четири нива на концентрация в диапазона от 50▽ 250 ug/mL, и разтвори на Trolox, при шест нива на концентрация в диапазона от 10▽ 250 ug/mL, се приготвят с 50 процента МеОН. Съотношението на пробата към DPPH беше 1:19 (v/v). Абсорбцията при 517 nm се измерва след 30 минути инкубиране на тъмно с помощта на UV-vis спектрофотометър (Evolution 260 Bio). Инхибирането на абсорбцията (проценти) се изчислява, както следва: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] ×100. Стойностите на Тролокс еквивалент (TE) и IC50 на тестовите проби бяха изчислени по същия начин, както при ABTS теста (раздел 2.5.1). Анализът се извършва в три екземпляра и резултатите са представени като средни стойности ± SD.

2.6. Основни разтвори на тествани растителни съединения и екстракти за експерименти с човешка плазма

Изходни разтвори на тестваните съединения и растителни екстракти се приготвят в 50 процента DMSO. Крайната концентрация на DMSO в тестваните проби е по-ниска от 0,05 процента и неговите ефекти са определени във всички експерименти.

2.7. Изолиране на човешка плазма

Човешка кръв или плазма е получена от шест редовни донора (мъже и жени непушачи) в кръвна банка (Лодз, Полша) и медицински център (Лодз, Полша). Кръвта се събира като CPD разтвор (цитрат/фосфат/декстроза; 9:1; v/v кръв/CPD) или CPDA разтвор (цитрат/фосфат/декстроза/аденин; 8.5:1; v/v; кръв/CPDA). Донорите не са приемали никакви лекарства или пристрастяващи вещества (включително тютюн, алкохол и добавки с антиоксиданти) най-малко две седмици преди дарението. Нашият анализ на кръвните проби беше извършен съгласно насоките на Хелзинкската декларация за изследване на хора и одобрен от Комитета по етика на изследванията в експериментите с хора към Университета в Лодз. Плазмата се приготвя чрез центрофугиране на прясна човешка кръв при 4500x g за 25 минути при стайна температура. Концентрацията на протеин се изчислява чрез измерване на абсорбцията на изследваните проби при 280 nm, съгласно процедурата на Whitaker и Granum [11].

2.8. Маркери на оксидативен стрес в човешка плазма

2.8.1. Измерване на липидната пероксидация

Плазмената липидна пероксидация се определя количествено чрез измерване на концентрацията на реактивни вещества с тиобарбитурова киселина (TBARS). Концентрацията на TBARS се изчислява с помощта на моларния коефициент на екстинкция (ε=156, 000 M 1 cm 1). Методът е описан по-подробно [12,13]. 2.8.2. Измерване на карбонилни групи Нивото на карбонилните групи се изчислява с помощта на моларния коефициент на екстинкция (ε=22, 000 M 1 cm 1) и се изразява като nmol карбонилни групи/mg плазмен протеин, според Bartosz [ 13] и Levine et al. [14]. 2.8.3. Определяне на тиолова група Съдържанието на тиолова група в плазмените протеини се измерва спектрофотометрично с помощта на SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, Германия) чрез абсорбция при 412 nm с 5,5′-дитиол-бис-(2- нитробензоена киселина). Методът е описан по-подробно другаде [15–17].

2.9. Параметри на хемостазата

2.9.1. Измерване на протромбиновото време (PT)

PT се определя коагулометрично с помощта на оптична коагулация

Буквите показват резултатите от теста на Tukey (p < 0.05), стойностите със същите

буква в ред не се различава значително.

2.9.2. Измерване на тромбиновото време (ТТ)

TT се определя коагулометрично с помощта на оптичен коагулационен анализатор (модел K-3002, Kselmed, Grudziadz, Полша), съгласно метода, описан от Malinowska et al. [18].

2.9.3. Измерване на активираното парциално тромбопластиново време (APTT)

APTT се определя коагулометрично с помощта на оптичен коагулационен анализатор K-3002 (Kselmed, Grudziadz, Полша) съгласно Mali now ska et al. [18].

2.10. Анализ на данните Тестът Q-Dixon беше извършен за елиминиране на несигурни данни.

Данните бяха тествани за нормално разпределение с теста на Shapiro-Wilk и равенство на дисперсията с теста на Levene. Статистически значими разлики бяха идентифицирани с помощта на ANOVA, последвано от теста за множество сравнения на Tukey или теста на Kruskal-Wallis. Сравненията се считат за значими при p < 0.05.="" стойностите="" са="" представени="" като="" средни="" стойности="" ±="">