ЧАСТ 1 Полизахаридът Cistanche Deserticola инхибира OVX-индуцираната костна загуба при мишки и RANKL-индуцираната остеокластогенеза

1. Въведение

Остеопорозата - заболяване, характеризиращо се с намалена костна маса, анормална микроструктура на костната тъкан, повишена чупливост на костите и фрактури (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, & Ginaldi, 2006) - понастоящем засяга повече от 200 милиона души по света и представлява значителна медицинска и социално-икономическа тежест върху съвременното общество (Strom et al., 2011). Клиничното лечение на остеопорозата се фокусира главно върху хормонална заместителна терапия, терапия с бифосфонати или денозумаб. Тези методи са ефективни, но водят до дългосрочни странични ефекти, като потенциален риск от рак на гърдата и атипични фрактури на бедрената кост (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof-Bauer, 2011). Следователно има спешна нужда да се изследват лекарства, които могат не само да инхибиратостеопорозано също така притежават по-малко нежелани странични ефекти.

Cistanche deserticola(CD), тонизираща и лечебна храна, широко използвана в Китай, известна като "пустинен женшен", е изсушеното сочно стъбло с люспест лист отC. deserticolaYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) и има разнообразни и ефективнифармакологичендейности, като имунна регулация, антиокисление и анти-остеопорозасвойства (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Предишни проучвания върху активните вещества на CD при лечение на остеопороза се фокусираха главно върхуфенилетаноидгликозиди(Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). CD обаче съдържа и други ефективни компоненти като иридоиди, лигнани,полизахариди(Wang, Zhang, & Xie, 2012). Клиничното приложение на традиционната китайска медицина (ТКМ) е основно отваряване с вода.полизахаридиса водоразтворими компоненти и е най-вероятно да бъдат основните фармакодинамични компоненти на TCM. Смята се, че полизахаридите, извлечени от TCM, имат анти-остеопорозаефект и няколко нежелани странични ефекти, които обикновено се използват в клиниките (напр. полизахариди, извлечени от Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018) и Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Следователно ние предположихме, чеCistanche deserticolaполизахарид(CDP), извлечен от CD, може да бъде потенциално безопасно лекарство за лечение на остеопороза.

Обикновено костната резорбция и костното образуване поддържат динамичен баланс по време на костно ремоделиране в координация с няколко типа клетки, включително остеокласти, остеобласти, клетки на костната обвивка и остеоцити (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). Нарушаването на този баланс може да доведе до различни костни метаболитни заболявания, като напростеопороза(Zhu et al., 2018) и остеосклероза (Ihde et al., 2011). Остеокластите, като крайно диференцирани клетки, получени от мононуклеарната/макрофагалната линия, са единствените клетки с костна резорбционна функция (Teitelbaum, 2000). Има два ключови цитокина, които участват в диференциацията и съзряването на остеокластите (Koga et al., 2004): фактор, стимулиращ колонията на макрофагите (M-CSF) и рецепторен активатор на лиганда на ядрения фактор κB (NF-κB) (RANKL). M-CSF медиира диференциацията на хемопоетичните стволови клетки в остеокластите прогенитори и насърчава диференциацията на остеокластите чрез регулиране на експресията на RANK рецептора (Takayanagi, 2007). Свързването на RANKL и RANK върху остеокластната клетъчна повърхност води до следното: (1) набиране на сигнални адапторни молекули като TNF рецептор-свързан фактор 6 (TRAF6); (2) активиране на множество цели надолу по веригата, включително NF-kB и митоген-активирани протеин кинази (MAPKs); и (3) повишаване на нивата на експресия на ядрен фактор на активирани Т-клетки, цитоплазмени 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Активирането на тези сигнални пътища директно регулира експресията на остеокластни гени, включително кисела фосфатаза 5 (Acp5) [кодираща устойчива на тартарат кисела фосфатаза (TRAcP)], матрична металопротеиназа 9 (MMP9) и катепсин К (CTSK) (Boyle, Simonet , & Лейси, 2003). Следователно, инхибирането на RANKL-индуцираните сигнални пътища, свързани с остеокластната диференциация, е потенциален терапевтичен метод за остеопороза.

В това проучване ние имахме за цел да определим ефектите от лечението с CDP върху овариектомираните (OVX)-индуцираниостеопорозамиши модел in vivo и върху RANKL-индуцирана остеокластна активност in vitro, с фокус върху експресията на остеокласти-специфични гени и активирането на NFATc1 и NF-κB и MAPKs сигналните пътища. Нашите открития могат да предоставят нови прозрения за потенциала на CDP като безопасно и ефективно лекарство за лечение на остеопороза.

За повече информация моля свържете се с:Joanna.jia@wecistanche.com

Полизахаридът Cistanche deserticola има много ефекти при остеопороза, щракнете тук, за да научите повече

2. Материали и методи

2.1. Химикали и вземане на проби

Компактдиск (№ 180801) е закупен от Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Анхуей, Китай) и е идентифициран от професор Haibo Huang от Училището по фармацевтични науки, Гуанджоуски университет по китайска медицина, Гуанджоу, Китай. Таблетките естрадиол валерат са закупени от Bayer (Леверкузен, Северен Рейн-Вестфалия, Германия). Алфа-модифицирана минимална основна среда

(-MEM) и фетален говежди серум (FBS) са получени от Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Пеницилин/стрептомицин и комплектът за оцветяване с TRAcP са придобити от Solarbio (Пекин, Китай). Рекомбинантен миши M-CSF и рекомбинантен миши RANKL бяха осигурени от R&D Systems (Минеаполис, Минесота, САЩ). Покрити с хидроксиапатит плаки бяха закупени от Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). Първичните антитела за NFATc1 и CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния, САЩ); IkB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK и P-JNK (технология за клетъчно сигнализиране, Danvers, MA, САЩ); и -актин (CWBIO, Пекин, Китай) също беше получен. Другите реагенти, използвани в това изследване, са с аналитичен клас и водата е пречистена от системата за пречистване на вода Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA).

2.2. CDP извличане

CD се смила на фин прах и се смесва с петролев етер три пъти, за да се победи. Твърдият остатък се събира чрез филтруване и след това се суши при стайна температура. Theполизахаридисе екстрахират от предварително обработените проби три пъти с вода в продължение на 2 часа, концентрират се, утаяват се чрез добавяне на безводен етанол до крайна концентрация от 80 процента (v/v) и се съхраняват при 4 ◦C в продължение на 24 часа. Утайките се събират чрез центрофугиране при 3000 rpm за 20 минути, разтварят се в дестилирана вода и се пречистват (отстраняване на свободни протеини) с помощта на метода Sevag (Zhao et al., 2019). Възстановенитеполизахаридибяха диализирани, изсушени и съхранени до следваща употреба. Освен това, резултатите от химичния състав показват, че общото съдържание на захар, уронова киселина, сулфат и протеин в CDP е 67.63 0.98 процента, 21.05 0.49 процента, 1.{{7 }}.24 процента и 8.{10}}.36 процента.

Монозахаридният състав и инфрачервеният анализ на трансформацията на Фурие на CDP са показани на допълнителна фигура 1 и 2.

2.3. OVX-индуциран миши модел на остеопороза

Всички експерименти с животни бяха одобрени от Комитета по етика на животните към Университета по китайска медицина в Гуанджоу (одобрен SYXK 2019-0202). Тридесет 6-седмични женски мишки C57BL/6 бяха доставени от Центъра за експериментални животни към Университета по китайска медицина в Гуанджоу. След аклиматизация в продължение на 1 седмица, една група мишки беше подложена на фиктивна операция (Sham group), докато останалите мишки бяха подложени на операция за овариектомия (OVX група). След операцията мишките бяха оставени да се възстановят за 1-седмица. След това успешно моделираните мишки бяха разделени на случаен принцип в 5 групи, с 6 мишки на група:

(1) Фиктивна група: третирана с дестилирана вода, (2) OVX група: третирана с дестилирана вода, (3) OVX E2 група (E2): третирана с 0.13 mg/kg естрадиол валерат таблетки, (4 ) OVX CDP група с ниска доза (CDP-L): третирана с 300 mg/kg CDP, (5) OVX CDP група с висока доза (CDP-H): третирана с 600 mg/kg CDP. Дестилирана вода, E2 или CDP се прилага чрез сонда веднъж дневно. Всички мишки бяха умъртвени след 12--седмичния период на лечение (Фиг. 1А). Матките бяха събрани и претеглени, а левите пищяли бяха събрани за последващи изследвания. Бяха събрани проби от цяла кръв и центрофугирани при 5000 rpm за

15 минути при 4 ◦C. Серумните супернатанти се аспирират и съхраняват при

—80 ◦C до следващ анализ.

2.4. Анализ с микрокомпютърна томография (микро-КТ) и костна хистоморфометрия

Левите пищяли се фиксират с 4 процента параформалдехид за 48 часа и след това се поставят в центрофужни епруветки, съдържащи нормален физиологичен разтвор. Фиксираните проби бяха сканирани с апарат Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Белгия), използвайки следните настройки: напрежение, 80 kV; ток на източника, 100 μA; Al, 0,5 mm филтър; пиксел

размер, 9,76 μm; и стъпка на въртене, 0.6◦. Няколко параметъра на

трабекуларна кост, включително костна минерална плътност (BMD), костна обемна фракция (BV/TV), костна повърхност спрямо общ обем (BS/TV), трабекуларен брой (Tb. N) и трабекуларно разстояние (Tb. Sp) бяха измерени с помощта на Софтуер CT-Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Триизмерни изображения бяха генерирани с помощта на софтуер CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan).

След микро-КТ анализ левите пищяли бяха декалцифицирани в 14% разтвор на EDTA и поставени в парафин за нарязване. Пробите бяха нарязани на 5 µm секции с помощта на микротом преди експериментите за оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) и TRAcP. Оцветените срезове бяха изследвани и документирани с помощта на микроскоп Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Токио, Япония).

Цистанчеможе да увеличи костната плътност и да облекчи остеопорозата

2.5. Анализ на серума

Концентрациите на калций (Ca) и фосфор (P) се определят съгласно инструкциите на комплекта, разработени от Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Китай). Нивата на TRAcP-5b и RANKL в серума бяха анализирани с помощта на TRAcP-5b ELISA комплект (CUSABIO, Ухан, Китай) и RANKL ELISA комплект (Cloud-CloneCorp., Ухан, Китай), съответно.

2.6. In vitro анализ на остеокластогенезата

BMM бяха изолирани от тибията и бедрената кост на 6-седмични женски C57BL/6 мишки. Изолираните клетки се култивират в -MEM среда, съдържаща 25 ng/mL M-CSF, 10 процента FBS и 1 процент пеницилин/стрептомицин. При достигане на сливане, BMMs (1 104 клетки/ямка) се посяват в 96-плаки с ямки и се третират с CDP в присъствието на 50 ng/mL RANKL. Средата и CDP се сменят на всеки 2 дни. След 7 дни клетките се фиксират с 4% параформалдехид и се оцветяват за наличието на TRAcP. Броят на остеокластите, определени като TRAcP-положителни клетки с три или повече ядра, се преброява и документира с помощта на светлинен микроскоп.

2.7. Анализ на клетъчна пролиферация

BMMs (1 × 104 клетки/ямка) се посяват в 96-плака с ямки и се инкубират за една нощ. След това клетките бяха третирани с различни концентрации на CDP (0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 и 40 µg/mL) в продължение на 48 часа. Клетъчното сливане беше открито и анализирано с помощта на IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA), дългосрочна динамична система за изображения на живи клетки в реално време.

2.8. Тест за резорбция на хидроксиапатит

BMM ({{0}} клетки/ямка) се посяват в покрита с хидроксиапатит плака, третират се с CDP при посочените концентрации (0, 5 и 10 µg/mL) и се култивират в пълна -MEM съдържащ 25 ng/mL M-CSF и 50 ng/mL RANKL. След 7 дни клетките се промиват с 10% разтвор на белина, за да се отстранят клетъчните компоненти. Изображенията на областите на резорбция на хидроксиапатит бяха заснети с помощта на IncuCyte ZOOM® и анализирани с помощта на софтуер ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003).

2.9. Изолиране на РНК и обратна транскрипция-количествен PCR (RT-qPCR) анализ в реално време

BMMs ({{0}} клетки/ямка) се посяват в 6-плака с ямки и се стимулират с RANKL и M-CSF в присъствието на CDP при различни концентрации (0, 5 и 10 µg/mL) за 5 дни. Общата РНК се изолира от клетките или костната тъкан на мишки с помощта на TRIzol реагент (Sigma-Aldrich). Допълнителна ДНК се синтезира от 2 µg обща РНК с помощта на комплект за обратна транскриптаза (TransGen Biotech, Пекин, Китай). RT-qPCR реакциите бяха приготвени с помощта на PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) и открити от ABI 7500 система (Applied

Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, САЩ). Параметрите на цикъла за PCR бяха зададени както следва: 95 °C за 5 минути, последвани от 40 цикъла от 95 °C за 15 s и 60 °C за 30 s. Използваните специфични праймери са показани в таблица 1 и количеството на всеки целеви ген се нормализира до GAPDH (вътрешен контрол).

2.10. Western blot анализ

BMMs ({{0}} клетки/ямка) се посяват в 6-плака с ямки. За експерименти с кратък период от време клетките бяха предварително инкубирани с различните концентрации на CDP (0, 5 и 10 µg/mL) за 1 час и след това третирани с 50 ng/mL RANKL за 30 минути . За дълго време клетките бяха стимулирани с 50 ng/mL RANKL на дни 3, 5 и 7 в присъствието на CDP (0, 5 и 10 ug/mL). Общите протеини се екстрахират с помощта на RIPA лизисен буфер (CWBIO). Протеините бяха разделени с 10 процента SDS-PAGE и прехвърлени към PVDF мембрани. Мембраните бяха блокирани с 5 процента обезмаслено мляко при стайна температура в продължение на 2 часа, инкубирани с първично

антитела за една нощ при 4 ◦C и след това със съответните вторични

антитела за 1,5 часа. Мембраните са разработени с помощта на ECL реагенти (Millipore Corp., Billerica, Масачузетс, САЩ), а изображенията са направени с помощта на Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, China).

Цистанчеможе да увеличи костната плътност

2.11. Откриване на NFATc1 транслокация с помощта на имунофлуоресцентен тест

BMM се посяват върху покривни стъкла на {{0}}ямки, стимулирани с RANKL и M-CSF и третирани с 10 µg/mL CDP в продължение на 5 дни. Клетките се фиксират с 4 процента параформалдехид за 15 минути, промиват се три пъти с PBS и се пропускат с 0,1 процента Triton X -100 за 10 минути. Клетките се смесват с 10% кози серум (CWBIO) и се инкубират в продължение на 2 часа. Впоследствие клетките се инкубират с първичното антитяло за една нощ при 4 ◦C и след това с Alexa Fluor 488 козе анти-мише вторично антитяло (Abcam, Cambridge, MA, USA) на тъмно за 1 час. Покривните стъкла бяха промити с PBS, монтирани в реагент Prolong Gold Antifade с 4', 6-диамидино-2-фенил индол (DAPI) (Solar) и

инспектирани с помощта на Zeiss LSM 800 с конфокален микроскоп Airyscan (Carl Zeiss, Oberkochen, Германия).

2.12. Статистически анализ

Всички експериментални данни бяха анализирани с помощта на SPSS 25.0 статистически софтуер (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Данните за изследвания върху животни и клетки са изразени съответно като средно ± SEM и средно ± SD. Резултатите се използват с еднопосочен дисперсионен анализ или t-тест на Student. Стойностите на p < 0.05="" се="" считат="" за="" статистически="">

Цистанчеможе да намалиапоптозаи укрепване на коститеплътност