Част 1: Фенилетаноидните гликозиди на Cistanche Tubulosa индуцират апоптоза на клетки от хепатоцелуларен карцином и засилват антитуморния ефект
Mar 25, 2022
Контакт: ali.ma@wecistanche.com
Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, Lijie Xia, PhD1, и Jinyao Li, PhD1
Резюме
Cistanche tubulosa е вид китайска билкова медицина и упражнява различни биологични функции. Предишни проучвания са доказали, чеCistanche tubulosa фенилетаноидни гликозиди(CTPG) проявяват антитуморни ефекти върху различни туморни клетки. Въпреки това, антитуморните ефекти на CTPG върху клетките на HepG2 и BEL-7404 хепатоцелуларен карцином (HCC) все още са неуловими. Нашето проучване показа, че CTPG значително инхибира растежа на HepG2 и BEL-7404 клетки чрез индуциране на спиране на клетъчния цикъл и апоптоза, което е свързано с активирането на MAPK пътища, характеризиращи се с повишено фосфорилиране на p38, JNK, и ERK1/2 и митохондриално-зависим път, характеризиращ се с намаляване на потенциала на митохондриалната мембрана. Освобождаването на цитохром с и разцепването на каспаза-3, -7, -9 и PARP впоследствие се увеличават чрез лечение с CTPG. Освен това, CTPG значително потиска миграцията на HepG2 чрез намаляване на нивата на матриксната металопротеиназа-2 и васкуларните ендотелни растежни фактори. Интересно е, че CTPG не само засилва пролиферацията на спленоцити, но също така намалява апоптозата на спленоцитите, индуцирана от цисплатин. В H22 туморен миши модел, CTPG, комбиниран с цисплатин, допълнително инхибира растежа на H22 клетки и намалява страничните ефекти на цисплатина. Взети заедно, CTPG инхибира растежа на HCC чрез директен антитуморен ефект и индиректен ефект на имуноусилване и подобрява антитуморната ефикасност на цисплатина.
Ключови думи Cistanche tubulosa фенилетаноидни гликозиди, апоптоза, MAPK път, митохондриално-зависим път, цисплатин, имуноусилване
Цистанче има противотуморен ефект.
Кликнете върху продуктите на Cistanche и Cistanches
Въведение
Предвижда се ракът на черния дроб да бъде шестият най-често диагностициран рак и четвъртата водеща причина за смърт от рак в света през 2018 г. с около 841 000 нови случая и 782 000 смъртни случая годишно в Югоизточна Азия (Монголия, Камбоджа и Виетнам) .1 В Китай ракът на черния дроб е бил третата водеща причина за смърт, свързана с рака през 2015 г.2 Повече от 90 процента от първичните ракови заболявания на черния дроб са хепатоцелуларен карцином (HCC) в целия свят. Понастоящем хепатектомията, чернодробната трансплантация и перкутанната аблация са основните методи за лечение на HCC. За съжаление, тези лечения са ефективни при 30 процента от пациентите, диагностицирани с ранен рак на черния дроб, докато пациентите, диагностицирани с напреднал рак на черния дроб (представляващи 40 процента), трябва да разчитат на палиативно лечение, за да удължат времето си на преживяемост.3,4 Сорафениб в комбинация с чернодробни артериалната хемоемболия е важна и обичайна палиативна терапия за повечето пациенти с напреднал HCC в Азиатско-Тихоокеанския регион.5 Сорафениб, одобрен от FDA през 2006 г. за лечение на напреднал рак на черния дроб, е множествен киназен инхибитор, който инхибира пролиферацията на туморни клетки и съдовата производство и насърчава апоптозата на туморните клетки. Сорафениб значително удължава времето за оцеляване на пациента с 3 до 5 месеца, но има сериозни странични ефекти и е тясно свързан с появата на лекарствена резистентност.6 Поради това е спешно да се разработят нови лекарства или стратегии за HCC.
Традиционната китайска медицина (ТКМ) самостоятелно или в комбинация с други стратегии е била използвана за лечение на HCC и е показала клинични ползи, включително удължено време на преживяемост, подобрено качество на живот, намалени нежелани реакции и т.н.7,8.Цистанчее TCM, съдържащ фенилетаноидни гликозиди (PhGs), иридоиди, лигнин и полизахариди, който има различни биологични функции, като антиоксидантни, противовъзпалителни, анти-стареене, подобряване на паметта и функции за подобряване на имунитета.9 PhGs се считат за основните активни компоненти на Cistanche и имат множество функции, включително антиоксидантна, противовъзпалителна, антиапоптозна, хепатопротекция и невропротекция.10-12 Нашата група съобщи, чеЦистанчеtubulosa фенилетаноидни гликозиди(CTPG) може да инхибира растежа на меланомни B{0}}F10 клетки, езофагеален карцином Eca-109 клетки и HCC H22 клетки чрез външни или вътрешни сигнални пътища in vitro или in vivo; освен това CTPG има имуностимулиращ ефект.13-15
В това проучване изследвахме антитуморния ефект и механизма на CTPG върху HepG2 и BEL{1}} клетки in vitro, анализирахме имуномодулаторната функция на CTPG in vitro и in vivo и допълнително оценихме терапевтичния ефект на CTPG, комбиниран с химиотерапия лекарство цисплатин върху HCC H22 туморни мишки in vivo. Открихме, че CTPG може да инхибира растежа на HepG2 и BEL-7404 клетки чрез митохондриално-зависима апоптоза и MAPK сигнален път. CTPG значително инхибира миграцията на HepG2 клетки чрез намаляване на нивата на матриксната металопротеиназа-2 (MMP-2) и васкуларен ендотелен растежен фактор (VEGF). В допълнение, CTPG насърчава пролиферацията и активирането на имунните клетки и повишава имунитета на мишките. Важно е, че CTPG, комбиниран с цисплатин, може допълнително да инхибира растежа на H22 клетки in vivo и да намали страничните ефекти на цисплатина.
Цистанче повишава имунитета.
Материали и методи
Животни
Мъжки мишки BALB/c, Kunming и женски мишки C57BL/6 на възраст около 6 до 8 седмици бяха закупени от Лабораторния център за животни, Медицински университет в Синдзян (Урумчи, Синдзян, Китай) и настанени в животновъдно съоръжение на университета в Синдзян със стайна температура (RT) от 25±3 градуса и 12/12 часа светло-тъмен период.
Клетъчни линии и клетъчна култура
Мишите H22 клетки са закупени от Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Ухан, Хубей, Китай), а човешки HCC HepG2 и BEL-7404 клетки са получени от Синдзянската ключова лаборатория за биологични ресурси и генно инженерство, Xinjiang University (Urumqi, Xinjiang, Китай) и култивирани в среда RPMI 1640 (Gibco, САЩ) или модифицирана среда на Dulbecco Eagle (DMEM) (Gibco), съдържаща 10 процента топлинно инактивиран фетален говежди серум (MRC, Китай), 1 процент L- глутамин (100mM), 100U/mL пеницилин и 100ug/mL стрептомицин при 37 градуса във влажна атмосфера с 5 процента CO2.
Високоефективна течна хроматография (HPLC)
Основните съединения на CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Шанхай, Китай) са квалифицирани и количествено определени чрез HPLC, както беше съобщено по-рано.13 Използвана е колона ZORBAX SB-C18 (250×4,6 mm; 5 μm). и подвижната фаза се състои от 0,2 процента разтвор на мравчена киселина и метанол с градиент от 23 процента до 31 процента. Общо 10 μL проба се инжектира и се открива при 330 nm. Стандартите за ехинакозид и актеозид (Yuanye, Shanghai, China) бяха използвани за анализ на компонентите на CTPG.
ехинакозид
Анализ на клетъчната жизнеспособност
Антитуморните ефекти на CTPG върху HepG2 и BEL-7404 клетки бяха оценени с помощта на MTT (3-(4, 5-диметил-2-тиазолил)-2, {{7 }}дифенил-2-Н-тетразолиев бромид). Клетките HepG2 и BEL-7404 се поставят в 96-плаки с ямки (5 × 104 клетки/ямка) и се третират с 0, 200, 400 и 600 ug/mL CTPG за 24 и 48 часа, съответно, след 24 часа инкубация при 37 градуса. Около 35 ug/mL цисплатин (Yuanye) се използва като положителна контрола. След това 100 μL MTT (0,5 mg/mL, разреден със среда без FBS среда) се добавят към всяка ямка и се култивират в продължение на 3 часа при 37 градуса и 5 процента CO2. След инкубиране, плаките се центрофугират при 1200 rpm за 7 минути, средата се отстранява и към всяка ямка се добавят 200 ug/mL DMSO за разтваряне на образуваните формазанови кристали. Стойностите на OD490 бяха измерени с 96-четец за микроплаки (Bio-Rad Laboratories, Калифорния, САЩ). За да се оценят ефектите на CTPG върху спленоцитите, клетките се изолират от C57BL/6 мишки и се поставят в 96-плаки с ямки при плътност от 1 × 105 клетки/ямка. Спленоцитите бяха третирани съответно с 0, 200, 400 и 600 ug/mL за 24, 48 и 72 часа. Клетъчната жизнеспособност се изчислява по следната формула: Клетъчна жизнеспособност (проценти)=(ODтретирани/ODнетретирани) × 100 процента.
Откриване на Ki-67
Откриването на Ki{{0}} беше направено съгласно нашето предишно проучване.16 Накратко, BEL-7404 клетки бяха третирани с различни концентрации (0, 200, 400 и 600ug/mL) на CTPG или цисплатин (35 ug/mL). След 24 часа клетките бяха събрани и промити с PBS, след това фиксирани и пермеабилизирани с Foxp3 Staining Buffer Set (eBioscience, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. Вътреклетъчното оцветяване се извършва с помощта на FITC конюгирано Ki-67 антитяло (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) за 15 минути при RT. Пробите бяха анализирани чрез поточна цитометрия (BD FACSCalibur, Калифорния, САЩ).
Анализ на клетъчната апоптоза и клетъчния цикъл
HepG2 и BEL-7404 клетки се посяват при плътност от 2,5 × 105 клетки/блюдо и се инкубират при 37 градуса за една нощ. Клетките се трипсинизират и се събират чрез центрофугиране след третиране с различни концентрации на CTPG или предварително третирани с инхибитор на каспаза (Z-VAD-FMK) или инхибитор на каспаза-3 (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Китай) за 2 часа преди това CTPG лечение. След 24 часа апоптозата беше открита чрез поточна цитометрия. Накратко, събраните клетки бяха промити със студен PBS (Gibco) и ресуспендирани в анексин-свързващ буфер с 2,5 μL анексин V-FITC и 5 μL PI-PE оцветяващ разтвор (Solarbio, Пекин, Китай) и след това клетките бяха инкубирани при RT на тъмно за 15 минути. За анализ на разпределението на клетъчния цикъл клетките се събират след третиране с CTPG и се фиксират в студен 70 процента етанол при 4 градуса за 30 минути. Клетките се оцветяват с PI (BD Biosciences) на тъмно в продължение на 30 минути. Пробите се анализират с поточен цитометър (BD FACSCalibur). Нивата на експресия на клетъчна апоптоза и протеини, свързани с цикъла, бяха открити чрез Western blot.
Western Blot
Уестърн блот беше направен съгласно нашето предишно проучване. 17HCC бяха третирани с CTPG в продължение на 24 часа. След промиване с ледено студен PBS два пъти, всички прилепнали и плаващи клетки бяха събрани и лизирани в RIPA лизисен буфер (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) за 2 0 минути върху лед. След центрофугиране при 12000rpm 4 градуса за 10 минути, концентрацията на протеин се определя с помощта на комплект за анализ на бицинхонинова киселина (Thermo Fisher Scientific, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. Същата концентрация на протеини се разделя с 12 процента SDS-PAGE и се прехвърля към PVDF мембрани. След промиване с PBST буфер (PBS с 0,05 процента Tween-20), мембраните се блокират с 5 процента обезмаслено мляко при 37 градуса за 1 час и след това се инкубират с първичните антитела (Cell Signaling Technology, MA, USA) при подходящи разреждания за една нощ при 4 градуса. След промиване 3 пъти с PBST, мембраната се инкубира със съответните HRP-конюгирани вторични антитела (eBioscience) в продължение на 2 часа при 37 градуса. Целевите протеини бяха открити с помощта на комплект за анализ ECL (Beyotime). Данните за сканиране в сивата скала са получени от Image J.
Анализ на потенциала на митохондриалната мембрана (Δψm)
Δψm се определя чрез мембранно пропускливо JC-1 багрило (Beyotime). Накратко, HepG2 и BEL-7404 клетки бяха третирани с различни концентрации на CTPG (0, 200, 400 и 600 ug/mL) в продължение на 24 часа. Всички клетки бяха събрани и промити с JC-1 измиващ буфер. Клетките се оцветяват с JC-1 флуоресцентна сонда съгласно инструкциите на производителя за 20 минути при RT. След промиване с PBS два пъти, всички проби бяха анализирани чрез поточна цитометрия (BD FACSCalibur).
Hoechst 33342 Оцветяване
Оцветяването с Hoechst 33342 беше извършено съгласно нашето предишно проучване.16 Морфологичните промени на ядрата бяха изследвани с помощта на мембранно пропускливо ДНК-свързващо багрило Hoechst 33342 (Beyotime). Накратко, клетките бяха инокулирани в 6-ямкова плака при концентрация от 1 × 105 клетки/ямка в 2 mL среда. При достигане на 70 процента до 80 процента сливане, клетките се третират с 200, 400 и 600 ug/mL CTPG или цисплатин за 24 часа. Клетките се промиват с PBS и се фиксират с 4 процента леденостуден параформалдехид при 4 градуса за 10 минути. След промиване с PBS, клетките се оцветяват с Hoechst 33342 при 4 градуса за 10 минути. Пробите се наблюдават чрез флуоресцентен обърнат микроскоп (Nikon Eclipse Ti-E, Япония).
екстракт от цистанче
Тест за миграция
HCC клетъчната миграция беше открита чрез теста за зарастване на рани. Накратко, HepG2 клетки (2×104/ямка) се посяват в 24-плака с ямки. След достигане на 80 процента сливане, центърът на всяка ямка беше надраскан веднъж с върха на пипета от 20 μL. След промиване с PBS, клетките се третират с цисплатин (35 ug/mL) или различни концентрации (0, 200, 400 и 600 ug/mL) CTPG при 37 градуса. След 24 часа изображенията на всяка проба бяха направени под микроскоп (Nikon Eclipse Ti-E). Средните разстояния на клетъчна миграция бяха анализирани чрез Изображение J. Процентът на зарастване на рани беше изчислен по уравнението: заздравяване на рани (проценти)=(1−зона на драскотина в посочената времева точка/площ на драскотина на 0 часа)×100 процента . Нивата на експресия на свързаните с клетъчната миграция протеини MMP-2 и VEGF бяха открити чрез Western blot.
Пролиферация и апоптоза на спленоцити
За анализ на пролиферация, спленоцитите се изолират от 3 C57BL/6 мишки и се оцветяват с CFSE (eBioscience). Маркираните с CFSE клетки се инокулират в 24-плаки с ямки при плътност 2 × 106 клетки в 1 mL среда на ямка и се третират с различни концентрации на CTPG (200, 400 и 600 ug/mL) или се комбинират с 35 ug /ml цисплатин за 72 часа. Беше извършен анализ на поточна цитометрия след оцветяване с CD3-APC и CD19-PE (BD Biosciences). За анализ на апоптоза, спленоцитите се инокулират в 24-плаки с ямки при плътност от 2 × 106 клетки в 1 mL среда на ямка и се третират с различни концентрации на CTPG (200, 400 и 600 ug/mL) или се комбинират с цисплатин за 24 часа. Анализът на поточната цитометрия се извършва след оцветяване с 2,5 μL анексин V-FITC и 5 μL PI-PE разтвор.
Оценка на безопасността и имуностимулиращи дейности на CTPG In Vivo
За оценка на in vivo имуностимулиращите активности на CTPG, 6 до 8 седмични мъжки мишки Kunming бяха разделени на случаен принцип в 7 групи (5 мишки/група). Подкожно инжектиране (sc, 200, 400 mg/kg), интраперитонеално инжектиране (ip, 200, 400 mg/kg) и интрагастрално приложение (ig, 200, 400 mg/kg) се прилагат на всеки 2 дни за общо 7 пъти , докато контролната група не е получила никакво лечение. Мишките се претеглят през ден и състоянието на мишките се наблюдава всеки ден. След третиране с CTPG, органите на мишките се отделят и претеглят. Органните индекси се изчисляват по формулата: органен индекс=органно тегло (mg)/телесно тегло (g). Спленоцитите бяха събрани, преброени и оцветени с анти-CD3-APC, анти-CD19-PE, анти-CD49b FITC или анти-CD4-APC, анти-CD{{ 22}}PE, анти-CD8-FITC (BD Biosciences). Пробите бяха открити чрез поточна цитометрия (BD FACSCalibur).
Антитуморна ефикасност на CTPG, комбиниран с цисплатин при H22 мишки, носещи тумор Около 6 до 8 седмични мъжки BALB/c мишки бяха инжектирани подкожно с H22 клетки (1.0 × 106 на мишка в 100 μL PBS). Когато обемът на тумора достигне приблизително 60 mm3, мишките, носещи тумор, бяха произволно разделени на 4 групи (6 мишки/група) и третирани с цисплатин (4 mg/kg), CTPG (400 mg/kg), цисплатин (4 mg/kg) плюс CTPG ( 400 mg/kg), или без лечение (контролна група), съответно. Туморните мишки бяха интраперитонеално инжектирани с CTPG съответно на 5-ия, 7-ия, 9-ия, 11-ия и 13-ия ден. Цисплатин се инжектира интравенозно на 7-ия и 11-ия ден. Обемът на тумора и телесното тегло се измерват през ден. Обемът на тумора се изчислява по следния начин: Обем на тумора (V)=a × b2/2, в който a и b представляват най-дългия и най-късия диаметър на тумор, измерен съответно с нониус. На 20-ия ден органите и туморите бяха изолирани и претеглени. Спленоцитите бяха събрани, преброени и оцветени с анти-CD3-APC и анти-CD19-PE или анти-CD4-FITC и анти-CD8-APC или анти-CD11b-PE и анти-Gr{42}}APC или анти-CD4-FITC, анти-CD25-APC и анти-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Впоследствие честотите и броят на клетките бяха анализирани чрез поточна цитометрия (BD FACSCalibur).
Цистанче засилва противотуморния ефект и повишава имунитета.
За повече информация, моля щракнете върху снимката.
Статистически анализ
Всички данни бяха изразени като средна ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Статистическият анализ беше проведен с помощта на едно-/двупосочен анализ на дисперсията (ANOVA) с помощта на софтуера Prism5.0. П<.05 was="" considered="" statistically="">
