Част 1 Cistanches облекчава индуцираната от севофлуран когнитивна дисфункция чрез регулиране на PPAR- -зависим антиоксидант и противовъзпалително действие при плъхове

Повече информация, моля свържете се с:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola има много ефекти, щракнете тук, за да научите повече

Резюме

Това проучване имаше за цел да проучи защитните ефекти и основните механизми нацистанчевърху модела на плъх с възрастова когнитивна дисфункция, предизвикана от севофлуран. Възрастни (24 месеца) мъжки SD плъхове бяха разпределени на случаен принцип в четири групи: контролна група, група със севофлуран, контрола плюс цистанхе и севофлуран плюсцистанчегрупа. Впоследствие нивата на възпалителни цитокини бяха измерени чрез ELISA и когнитивната дисфункция на плъхове беше оценена чрез тест с воден лабиринт, тест в открито поле и тест за кондициониране на страха. Три дни след анестезията, плъховете бяха убити и хипокампусът беше събран за анализ на относителните биомолекули. Нивото на оксидативен стрес беше посочено като концентрация на нитрит и MDA, заедно с SOD и CAT активността. Накрая, PPAR-антагонист беше използван за изследване на механизма нацистанчеin vivo. Резултатите показват, че след вдишване на севофлуран, 24-, но не и 3-месечни мъжки SD плъхове са развили очевидни когнитивни увреждания при поведенческия тест 3 дни след анестезията. Интраперитонеално инжектиране нацистанчепри доза от 50 mg/kg в продължение на 3 последователни дни преди анестезията облекчава предизвиканото от севофлуран повишаване на нивата на невровъзпаление и значително отслабва зависимите от хипокампуса нарушения на паметта при 24-месечни плъхове.Цистанчесъщо намалява оксидативния стрес чрез намаляване на нитритите и MDA, като същевременно повишава активността на SOD и CAT. Освен това, такова лечение също инхибира активирането на микроглия. В допълнение, ние демонстрирахме, че инхибирането на PPAR обратно облекчавацистанче-предизвикан защитен ефект. Взети заедно, ние демонстрирахме, че цистанхата може да упражнява антиоксидантни, противовъзпалителни, анти-апоптозни и анти-активиращи ефекти на микроглията върху развитието на индуцирана от севофлуран когнитивна дисфункция чрез активиране на PPAR-сигнализиране.

КЛЮЧОВИ ДУМИ

цистанче, постоперативна когнитивна дисфункция (POCD), PPAR- , севофлуран

Цистанчехранителните добавки повишават имунитета

1|ВЪВЕДЕНИЕ

Следоперативната когнитивна дисфункция (POCD) е опустошително усложнение с дълготрайни последици и се дефинира като увреждане на паметта, вниманието, концентрацията и обработката на информация, възникващи след операция и анестезия. Изследванията показват, че около 10 процента от хирургичните пациенти и почти 40 процента от възрастните пациенти на възраст 65 и дори повече ще получат POCD.1 Пациентите с POCD показват поразително по-висока смъртност, намалено качество на живот и повишена зависимост от социално осигуряване в сравнение с тези без POCD.2,3 Въпреки че през последните десетилетия бяха направени многобройни изследователски усилия, патогенезата на POCD остава до голяма степен неизвестна.

Добре известно е, че невровъзпалението и оксидативният стрес в мозъка играят решаваща роля в инициирането и развитието на POCD.4,5 Въпреки че индуцираното от операция възпаление или оксидативен стрес може да причини невровъзпаление и увреждане в мозъка и в крайна сметка да допринесе за когнитивно разстройство , последните доклади показват, че анестетиците, използвани по време на операцията, също могат да предизвикат когнитивно увреждане.3,6,7

Севофлуран обикновено се използва в клинична анестезия за пациенти от всички възрасти поради ниския си коефициент на разпределение кръв-газ и ниския метаболитен разпад.8 Няколко доказателства обаче показват, че севофлуран може да доведе до невровъзпаление и да наруши когнитивната функция. Например, Makaryus съобщава, че севофлуранът има невротоксични ефекти върху развитието на мозъка.9 Доказано е, че намалената свързаност между възбуждащите неврони в префронталния кортекс е свързана с когнитивните увреждания, предизвикани от севофлуран.10 Хомопластично, севофлуранът улеснява когнитивния спад чрез влошаване на микроглията -регулирано невровъзпаление в модел на плъх чрез понижаваща регулация на активността на PPAR в хипокампуса.1 След като хирургичният метод бъде определен, степента на травмата и възпалителният отговор не могат да бъдат променени. Следователно намаляването на когнитивното увреждане от гледна точка на анестезията може да се превърне в осъществим подход. Theцистанчевид („Rou Cong Rong“ на китайски) се използва като тоник в Китай от много години. Съвременните фармакологични изследвания показват, че цистанхите притежават широки лечебни функции, особено върху централната нервна система (ЦНС), включително антиапоптоза, антиоксидация, против стареене, против умора, имуномодулиращо противовъзпалително и неврозащита.{{5 }} Deng et al установиха, че ехинакозидът, едно от основните активни съединения на цистанхата, показва защитни ефекти върху TNF- -индуцираната SH-SY5Y клетъчна апоптоза.14 Фенилетаноидни гликозиди, друго основно активно съединение на цистанхе, което осигурява изобилие фенолен хидроксил, може да служи като донор на водород за редуктивните радикали и по този начин да ги изчисти. Има два основни потока, чрез коитоцистанчетапречистване на свободните радикали, а именно директно участие в отстраняването на свободните радикали или блокиране на тяхното производство и регулиране на антиоксидантните ензими, свързани с метаболизма на свободните радикали in vivo, като SOD, CAT и GPX.15 Приложението на Cistanches допринася за забавяне на стареенето фенотипове и облекчаване на когнитивния спад при мухи чрез намаляване на оксидативния стрес.16 Например, Zhang et al изследват една от екстракциите на цистанхи и потвърждават функцията й за удължаване на продължителността на живота.17 Към днешна дата обаче нито едно проучване не изследва ефектите на цистанхите върху когнитивните дисфункция при животински модели или хора при условия на севофлуран.

Въз основа на горните констатации, ние предложихме товацистанчетаможе да намали когнитивното увреждане, предизвикано от севофлуран. За да проверим тази хипотеза, използвахме 24-месечни SD плъхове, за да получим модел на когнитивно увреждане чрез вдишване на севофлуран. Впоследствие проучихме фармакологичната функция нацистанчетаекстракт за противовъзпалително, антиоксидантно и невропротективно действие. Изследван е и механизмът на действие на цистантите върху когнитивното увреждане, предизвикано от севофлуран.

2|МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

2.1|Приготвяне на екстракт от Cistanches Herba и стандартизация

Извличането нацистанчетабеше според предишни работи.18,19 Накратко,цистанчииЕкстрактът от Herba се екстрахира с 95% етанол във вода и се лиофилизира до прах. Екстрактът при 10 mg/ml се прилага при количествен химичен анализ на ехинакозид чрез обратнофазова високоефективна течна хроматография (HPLC). Стандартното съединение, ехинакозид, е получено от Haoxuanbio (Xi'an, Shaanxi, Китай).

2.2|Плъх модел на индуцирана от севофлуран когнитивна дисфункция и лечение с цистанче

Мъжки плъхове Sprague Dawley (SD) на възраст 3 и 24 месеца бяха закупени от Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Плъховете бяха отгледани в чисти акрилни клетки със свободен достъп до вода и храна при 12-часова светлина /цикъл на тъмнина при постоянна температура от 21 градуса ± 1 градус и влажност (45 процента -65 процента) за 1 седмица преди експеримента за настаняване. Експерименталните процедури върху животни бяха разрешени от Комитета за грижа за животните на Седма народна болница на Шанхайския университет на TCM. Всички поведенчески тестове бяха проведени в стая с контролирана температура (21 градуса ± 1 градус) и влажност (45 процента -65 процента).

В първия набор от експерименти in vivo бяха използвани мъжки SD плъхове на възраст 3- и 24- месеца. Шестнадесет 3-месечни плъхове с тегло 200- 250 g и шестнадесет 24-месечни плъхове с тегло 240-300 g бяха разпределени на случаен принцип за инжектиране на севофлуран (Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. , Lianyungang, Китай) или газ-носител (n=8 за всяка група). Животните в групите за анестезия (SEVO) бяха подложени на 2,6 процента концентрация на севофлуран, доставен от овлажнен 30 процента O2 газ-носител за 4 часа при скорост на потока 2 L/min, като се използва анестетичен апарат с мулти-газ монитор (Prisma SP Alpa, Оксън, Обединеното кралство). Плъховете в контролната група бяха подложени на газ-носител без севофлуран за същото време.

за 4 часа (n=8 за всяка група). Поведенческите тестове бяха проведени на ден 1 и ден 3 след анестезията. След това животните бяха умъртвени веднага след оценка на поведението на ден 3 и хипокампусът в мозъците беше използван за молекулярни анализи. В третия набор от експерименти, всички анестезирани плъхове бяха разделени на случаен принцип в четири групи (n=8 за всяка група): (a) SEVO група; (b) SEVO плюс GW9662 (антагонист на PPAR-, 30 ng всеки път) група;

в) SEVO плюсцистанчегрупа; и (г) SEVO плюсцистанчеплюс GW9662 група. Последвалите експерименти бяха подобни на описанието във втория набор от експерименти.

2.3|Поведенчески тестове

Тестът за воден лабиринт на Морис беше извършен, както е описано по-рано с лека модификация, за да се оцени пространствената памет и способностите за учене на плъхове в настоящото изследване. 8,20 Резервоарът беше напълнен до дълбочина 40 cm с вода и направен непрозрачен чрез добавяне на нетоксична бяла темперна боя. Температурата на водата се поддържа на 22 ± 1 градуса, за да се предотврати изплуването на мишката. Кръгла платформа за евакуация (радиус 11 cm) беше поставена на 0.5-1 cm под водната повърхност в един от четирите квадранта. В три времеви точки плъховете бяха тествани за референтна памет след тренировка в продължение на 5 дни и всяка тренировъчна пробна секция се състоеше от четири опита с интервал от 15 минути. Във втората и третата времева точка платформата беше отстранена от басейна, след което беше проведено измерване на пространствената и работната памет. Времето, прекарано от всеки плъх в търсене на платформата, беше записано като латентност на бягство. След опити плъховете бяха поставени в отопляеми клетки, преди да се върнат в клетката си.

Тестът в открито поле беше проведен на ден 1 и ден 3 след анестезията, както е описано от Fricano et al21. Накратко, плъховете бяха тествани в квадратна арена с размери 27,5 cm × 27,5 cm. Средата, 66 процента от арената, беше озаглавена като „център“. Времето, прекарано в центъра, беше записано като параметър за оценка на анксиолитичното поведение.

Тестът за кондициониране на страха беше извършен, както е описано по-рано с лека модификация, за да се изследват пространствената памет и способностите за учене на плъхове в настоящото проучване. 22, 23 Обучението беше извършено един ден след анестезията. Всеки плъх беше оставен да се адаптира към камерата за 12 0 s, последвано от излагане на звуков стимул (20 s, 80 dB) и след това електрически удар на крака (2 s, 0,75 mA) 25 s след звука стимулът приключи. Експозициите бяха повторени два пъти, с интервали от 60- s между втората и третата експозиция. Контекстният тест е извършен на втория и третия ден след операцията. Всяка мишка беше поставена в една и съща камера, използвана за обучение, последвано от никакъв стимул и без удар на краката за същия интервал, използван за обучение на животното. Резултатите бяха записани и процентът на времето на замръзване (без движение) беше събран.

2.4|Събиране на тъкани

След поведенчески анализ на ден 3 след анестезията, експерименталните плъхове бяха убити; след това мозъчните тъкани бяха отстранени незабавно и хипокампусът беше внимателно дисектиран. За анализа на протеини, РНК и цитокини, хипокампусът се замразява незабавно в течен азот и се съхранява при -80 градуса. За имунохистохимичен анализ тъканите се фиксират с 4% параформалдехид за 72 часа и след това се прехвърлят в 20% захароза за още 72 часа.

2,5|Имунособентен анализ, свързан с ензимите

Всички плъхове бяха убити след поведенческия тест на ден 3. Хипокампалните тъкани бяха дисектирани върху лед веднага и хомогенизирани във физиологичен разтвор чрез ултразвук. След това се извършва центрофугиране при 10 000 × g при 4 градуса за 15 минути. Нивата на IL-1, TNF- и IL-6 се определят чрез комплекти за ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) (eBioscience, Сан Диего, Калифорния, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. Границите на откриване бяха 8.0 pg/mL за IL{{10}}, 8.0 pg/mL за TNF- и 4,0 pg/mL за IL{{16} }. Плазмените концентрации на IL-1, TNF- и IL-6 на ден 1 и ден 3 също бяха измерени с помощта на ELISA.

2.6|Определяне на нитрити/нитрати и окислително увреждане на липиди и протеини

Концентрацията на нитрит/нитрат (NO2−) в събрания супернатант се измерва чрез реакцията на Griess (Sigma, St. Louis, MO, USA), която се показва като индикатор за производството на азотен оксид (NO). Накратко, 100 μL от Griess реактив се добавя към 100 μL от супернатантата. Общото съдържание на протеин в супернатантата се измерва с комплект реагенти за анализ на протеин BCA (KeyGEN, Китай) след инкубиране при стайна температура за един час и абсорбцията се измерва с помощта на спектрофотометър при 550 nm. Резултатите са nmol NO − на mg протеин.

Нивото на малондиалдехид (MDA) в хипокампуса се определя от комплекта за анализ на MDA (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Китай) след събиране чрез хомогенат и центрофугиране. Окислителното увреждане на липидите се определя чрез анализ на реактивни вещества с тиобарбитурова киселина (TBARS). Накратко, пробите от супернатанта се утаяват с 10 процента трихлороцетна киселина. След това се добавя тиобарбитурова киселина (0,67 процента) и абсорбцията се тества при 535 nm. 1,1,3,3-тетра метокси пропанът като външен стандарт и данните бяха изразени като nmol еквиваленти малондиалдехид на mg протеин.

2.7|Откриване на антиоксидантна ензимна активност

За измерване на активността на супероксид дисмутаза (SOD), 1{{10}} μL супернатанти, получени чрез тъканно хомогенизиране и центрофугиране (10 000 × g, 15 минути) при 4 градуса се добавя към 2 00 μL реакционен разтвор (50 μL тетразолий плюс 19,95 mL буфер за анализ, включително 50 mM Tris-HCl, 0,1 mmol/L хипоксантини и 0,1 mmol/L диетилен триамин пероцетна киселина, pH 8,0). След това към смесите се добавят 20 μL ксантин оксид, за да се инициира реакцията. След разклащане и инкубиране в продължение на 20 минути, промените в абсорбцията при 450 nm се записват с помощта на спектрофотометър. Дейностите на SOD бяха изчислени с помощта на формулата, доставена с комплекта за откриване (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA).

CAT активността в супернатантата на хипокампалната тъкан се определя спектрофотометрично чрез изчисляване на скоростта на разлагане на водороден пероксид (H2O2) при 240 nm. Накратко, аликвотна част от 100 μL от супернатанта (20 μL) се добавя към субстратната смес (1000 μL), съдържаща 0,3 ml H2O2 в 50 mL 0,05 mol/L PBS (pH 7.0). Абсорбциите се записват 1 минута след началото на реакцията. Резултатите бяха изчислени с помощта на външни стандарти и изразени като U на mg протеин.

2.8|Изолиране на РНК и количествена PCR

Тъканите на хипокампа се хомогенизират, за да се получат общи РНК с помощта на TRIzol (Invitrogen), и след това амплификацията на транскрипт се прилага с помощта на iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Получената cDNA се амплифицира чрез qPCR, като се използва iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) с ген-специфични праймери и относителната експресия на всеки ген се изчислява с помощта на метода 2−ΔΔCt и се нормализира към GAPDH контрола. Праймерните последователности са представени в Таблица S1.

2.9|Western blot

Тъканите на хипокампа се хомогенизират в буфер за клетъчен лизис (50 mmol/L Tris, pH 7,5, 1 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl, 0,5 процента Triton X-100 , 0,5 процента NP-40, 1 mmol/L фенилметилсулфонил флуорид, 5 mmol/L натриев ванадат, 1 mmol/L натриев флуорид, 1 ug/mL апротинин, пепстатин и леупептин). Протеините бяха разделени чрез SDS-PAGE гелове и след това протеините в геловете бяха прехвърлени към PVDF мембрани (Millipore). Мембраните бяха блокирани с 5 процента мляко и след това инкубирани със специфични първични антитела, включително анти- -АРР (ab76763, разреждане 1:1000), анти-BDNF (ab108319, разреждане 1:1000), анти-GFAP (ab68428 , разреждане 1:1000), анти-Iba-1 (ab178847, разреждане 1:1000), анти-PPAR- (ab209350, разреждане 1:1000), анти-NF-κB (ab32360, разреждане 1:1000) и анти-GAPDH (ab181602, 1:1000 разреждане). Впоследствие TBST се използва за промиване на мембраните и след това се инкубира с HRP-конюгирани вторични антитела (Santa Cruz, CA, USA). И накрая, съответният протеин беше наблюдаван от системата ECL (PerkinElmer) в светлината на обяснението на производителя. И ImageJ беше приложен за количествен анализ на относителната протеинова експресия.

2.10|Анализ на флуоресцентно активирано сортиране на клетки (FACS).

За FACS анализ, клетките на хипокампа се събират веднага след изолиране. След това клетките се промиват с леденостуден фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и се ресуспендират в PBS, съдържащ 2 процента FBS. За всеки анализ, 1 × 105 клетки в 100 µL PBS-FBS бяха оцветени с флуоресцентно конюгирани CD11b (BD PharMingen, каталожен #554982, 1:250) и CD45 (BD PharMingen, каталожен #554878, 1:250) антитела върху лед за 2 часа на 4 градуса на тъмно. След промиване със студен PBS, клетките се ресуспендират в 300 uL PBS-FBS. И поточен цитометричен анализ беше извършен на FACSAria I поточен цитометър (BD Biosciences). Резултатите бяха анализирани с помощта на FlowJo (версия 7.6.1).

2.11|Оцветяване по Nissl

Събраният хипокампус беше вграден в OCT съединение и след това нарязан на {{0}} μm коронални срезове с помощта на замразяващ микротом (Leica). След размразяване върху заредени слайдове, срезовете се промиват с 0.01 mol/L PBS три пъти за общо 15 минути и след това се инкубират в разтвор на крезил виолет (0,5 процента, съдържащ няколко капки ледена оцетна киселина киселина) за 10-15 минути при стайна температура. След промиване с дестилирана вода два пъти, срезовете се дехидратират постепенно в етанол (70 процента, 85 процента, 95 процента и 100 процента). След дехидратиране те се поставят в ксилен и се покриват с помощта на монтираща среда. Накрая, оцветяването по Nissl се наблюдава под микроскоп (Leica).

2.12|Анализ на данни

Данните бяха анализирани с помощта на софтуера GraphPad Prism 6.0. Данните от проучванията на поведението са анализирани в различни моменти от време (ден 1 или ден 3) след анестезия със севофлуран, като се използва двупосочен анализ на дисперсията (ANOVA) с повтарящи се измервания. Други данни бяха анализирани с помощта на еднопосочен ANOVA преди теста на Bonferroni. Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра и резултатите бяха изразени като средна стойност ± SEM P <.05 се="" счита="" за="" статистически="">

3|РЕЗУЛТАТИ

3.1|Cistanche предотвратява необичайно невровъзпаление при възрастни плъхове

За да се изследва разликата в когнитивната функция между възрастни и стареещи плъхове, севофлуран е използван за предизвикване на анестезия при плъхове на възраст 3- и 24- месеца. След това поведението, зависимо от хипокампуса, беше оценено на ден 1 и ден 3 (Фигура S1A). Както е показано на фигура S1B, няма разлика в латентността на бягство за четири експериментални групи на ден 1. Освен това, времето, прекарано в центъра, и процентът на замръзване са подобни на плъхове, които са получили носител и севофлуран на ден 1 (Фигура S1C, Д). Въпреки това, плъховете на възраст 3- и 24- месеца имаха значителни разлики в латентността на бягство, времето, прекарано в центъра и процента на

замразяване след индукцията със севофлуран на ден 3, което предполага, че севофлуранът е променил значително когнитивната функция на възрастни животни (Фигура S1B-D). По този начин възрастните плъхове бяха използвани за следващите експерименти.

За да изследваме ефектите на цистанхе върху невровъзпалението при възрастни плъхове, подложени на експозиция на севофлуран, ние оценихме нивата на провъзпалителния цитокин. Доказателството за невровъзпаление се наблюдава 24 часа след анестезията със севофлуран, както се демонстрира от висока концентрация на провъзпалителни цитокини IL-1, IL-6 и TNF- в плазмида на ден 1 и ден 3 (Фигура 1А, 1), а невровъзпалението е показано от повишените иРНК на провъзпалителни цитокини в хипокампуса до 3 дни (Фигура 1С-Е). За всеки от провъзпалителните фактори лечението с цистанче елиминира разликите в предизвиканите от севофлуран промени в провъзпалителните медиатори. Cistanche значително отслабва повишените провъзпалителни цитокини в севофлуран

3.2|Лечението с екстракт от Cistanches Herba отслабва индуцирания от севофлуран оксидативен стрес в хипокампуса на възрастни плъхове

След това изследвахме ефектите на цистанхата върху оксидативния стрес, предизвикан от севофлуран. Както е илюстрирано на Фигура 2А, ние открихме, че лечението с цистанхе предотвратява предизвикания от севофлуран оксидативен стрес, както се предполага от значително намалената концентрация на нитрит/нитрат в хипокампуса. Ние също така наблюдавахме, че групата SEVO плюс цистанче представя по-ниски нива на MDA еквиваленти, индекс на окислителното увреждане на липидите, в хипокампуса три дни след инхалирането на севофлуран, в сравнение със SEVO

група (Фигура 2B). В допълнение, плъхове, подложени на анестезия със севофлуран (група SEVO), показват значително намаляване на активността на SOD и CAT на ден 3 след анестезия в хипокампуса. Въпреки това, хипокампалната активност на тези ензими е значително повишена в групата SEVO плюс цистанче, в сравнение с групата SEVO (Фигура 2C, D).

ЦистанчеХранителната добавка облекчава антиоксидантния стрес

3.3| Лечението с екстракт от Cistanches Herba намалява микроглиалното активиране

Микроглиалните клетки се активират по време на лабораторно или предизвикано от анестезия възпаление в хипокампуса, което след това допринася за патологичния прогрес. За да проучим дали цистанхата може да предотврати активирането на микроглия, ние измерихме популацията от активирани клетки на микроглия и нейните относителни маркери. Микроглията в покой експресира CD11b и ниска експресия на CD45, докато активираната микроглия експресира CD11b и високо ниво на CD45. Както е представено на Фигура 3А, резултатите от анализ на поточна цитометрия потвърждават, че процентът на CD45 е значително по-нисък при плъхове, третирани с цистанхи, отколкото при SEVO-индуцирани плъхове (0.495 ± 0.{{15} }51 процента след лечение с цистанхи срещу 1,127 ± 0,032 процента в групата SEVO). Впоследствие измерихме глиалните маркери чрез qRT-PCR. След анестезия със севофлуран иРНК

3.4|Лечението с екстракт от Cistanches Herba намалява индуцираната от севофлуран невронална апоптоза

Невронната апоптоза се задвижва частично от активирана микроглия и оксидативен стрес и ние потвърдихме, че цистанхата може да предотврати активирането на микроглията и оксидативния стрес in vivo. За по-нататъшно изследване на фармакологичните ефекти на цистанхата, тествахме за невронална апоптоза с оцветяване с TUNEL и разцепена каспаза 3 и Bax/Bcl-2 имуноблот. Както е представено на Фигура 4А, севофлуран повишава клетъчната апоптоза в областите на хипокампа. Приложението на Cistanche намалява клетките TUNEL plus след анестезия със севофлуран. Ние също така илюстрирахме забележителните високи нива на каспаза 3 и Bax, докато ниските нива на Bcl-2 в хипокампуса на анестезирани възрастни плъхове. Плъхове, които са получили приложение на цистанхе преди анестезия, показват значително намаляване на активността на каспаза 3 (Фигура 4В), разцепена каспаза 3 и Bax протеин (Фигура 4C, D), което е в съответствие с намалената невронална апоптоза, наблюдавана при оцветяване с TUNEL.

3.5|Лечението с екстракт от Cistanches Herba облекчава когнитивната дисфункция и увреждането на хипокампалната тъкан след индуцирана от севофлуран анестезия

За по-нататъшно изследване на ролята на цистанхата върху когнитивната функция, плъховете бяха подложени на 50 mg/kg цистанхе перорално в продължение на три последователни дни преди анестезията. В групата, лекувана с цистанче (група SEVO плюс цистанче), латентността на бягство е значително съкратена, времето, прекарано в центъра, е по-дълго и процентът на замръзване е увеличен на 3-ия ден след анестезията в сравнение с групата SEVO (Фигура 5A- ° С). Тези резултати показват, че цистанхата може поне частично да спаси когнитивните увреждания. Освен това оценихме степента на невронна смърт в хипокампуса на плъхове в четири групи чрез оцветяване по Nissl. Изображенията показват, че клетките нямат очевидна аномалия в груповия контрол и груповия контрол плюс цистанче. Въпреки това, броят на невроните за оцеляване в CA1 регионите е значително намален при SEVO-индуцираните плъхове в сравнение с този в контролната група на ден 3. Лечението с цистанхе обръща този ефект на SEVO и значително насърчава невронното оцеляване в сравнение със SEVO-индуцираните самостоятелно (Фигура 5D).

3.6|Лечението с екстракт от Cistanches Herba намалява индуцираното от севофлуран производство на провъзпалителни цитокини по PPAR- -чувствителен начин

След това проучихме дали ефектът на цистанхата върху производството на цитокини е PPAR{0}}чувствителен. Лечението с GW9662 (група SEVO плюс GW9662) повишава нивата на IL-1, IL-6 и TNF- в сравнение с групата SEVO. Въпреки това, лечението с цистанхе намалява SEVO-индуцираното производство на провъзпалителни цитокини. за отбелязване,

3.7| Лечението с екстракт от Cistanches Herba инхибира индуцирания от севофлуран оксидативен стрес чрез PPAR-

Беше съобщено, че севофлуран преувеличава когнитивната дисфункция в модел на плъх, индуциран от хронична интермитентна хипоксия, чрез инхибиране на експресията на PPAR в хипокампуса.1 След това се чудехме дали ефектът нацистанчевъзникна по PPAR- -зависим начин. За тази цел GW9662, селективен и необратим антагонист на PPAR-, беше използван за по-нататъшно изследване. Третирането с GW9662 при 30 ng стимулира оксидативния стрес, както се вижда от повишените нива на нитрит/нитрат и MDA. Въпреки това, антиоксидантните маркери SOD и CAT в хипокампуса на ден 3 са повишени в сравнение с SEVO-оперирани плъхове. Лечение съсцистанченамалява индуцираното от SEVO свръхпроизводство на маркери за оксидативен стрес и улеснява активността на SOD и CAT (Фигура 7A-D). Освен това, тези ефекти, произведени отцистанчебяха върнати от GW9662, както се наблюдава чрез увеличаване на производството на нитрит/нитрат (Фигура 7A) и MDA (Фигура 7B). В допълнение, на

ефектите на цистанхата върху активността на SOD и CAT също бяха върнати от GW9662 (Фигура 7C, D), което показва участието на PPAR-.

3.8|Лечението с екстракт от Cistanches Herba инхибира микроглиалното активиране и апоптозата на невроцитите и подобрява когнитивния спад по PPAR{2}} чувствителен начин

Следващата стъпка беше да се проучи дали ефектите отцистанчевърху активирането на микроглията и апоптозата на невроцитите са PPAR- -чувствителни. Лечението с GW9662 повишава нивата на mRNA на CD68 (Фигура 8A), GFAP (Фигура 8B) и Iba-1 (Фигура 8C). Трябва да се отбележи, че тези ефекти, произведени от GW9662, бяха ефективно възстановени отцистанче, както се наблюдава чрез намаляване на същите тези маркери (Фигура 8A-C). Освен това, протеиновата експресия на GFAP и Iba-1, продуцирана от GW9662, също беше възстановена от цистанхе, което показва, че цистанхите инхибират активирането на микроглията и поне частично зависи от PPAR-. В допълнение, ефектът на цистанхата върху експресията на -APP и BDNF протеин се инхибира от GW9662 (Фигура 8D, E). За да се изследва дали цистанхата може да инхибира невроцитната апоптоза по PPAR- -чувствителен начин, бяха открити протеини, свързани с апоптозата. Както е показано на Фигура 8F, G, цистанхе при 50 mg/kg намалява експресията на проапоптозния протеин (разцепена каспаза 3 и Bax). Въпреки това, тези ефекти бяха до голяма степен спасени от GW9662.

Цистанчеекстрактът може да облекчи клетъчната апоптоза

Тъй като нивата на оксидативен стрес и възпаление са тясно свързани с когнитивната функция при плъхове след анестезия, ние допълнително определихме дали ефектът нацистанчевърху когнитивната дисфункция е PPAR- -зависим. Както е показано на фигура 8H-J, в сравнение с плъхове