Част 1 Откриване на лекарствени продукти Cistanches Herba (Rou Cong Rong) с помощта на специфични за вида нуклеотидни сигнатури

За повече информация моля свържете се с:Joanna.jia@wecistanche.com

Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1*, Zheng Zhang 1* и Shi-lin Chen 3

1 Ключова лаборатория за използване на биоактивни вещества и ресурси на китайската билкова медицина, Министерство на образованието, Институт за развитие на лечебни растения, Китайска академия по медицина и Медицински колеж на Пекинския съюз, Пекин, Китай, 2 Изследователски алианс на NHP, Институт по биоразнообразие на Онтарио (BIO ), University of Guelph, Guelph, ON, Канада,

3 Ключова лаборатория на Пекин за идентификация и оценка на безопасността на китайската медицина, Институт по китайска материя медика, Китайска академия на китайските медицински науки, Пекин, Китай

Cistanche deserticola има много ефекти, щракнете тук, за да научите повече

Cistanches Herbaе лечебно растение, което има детоксикиращи свойства и се използва често в Азия. Поради дисбаланса между търсенето и предлагането, фалшификати често се добавят с цел печалба. Няма обаче регулаторен надзор, тъй като инструментите за контрол на качеството не са достатъчни за идентифициране на силно преработени продукти. По този начин беше разработен нов молекулярен инструмент, базиран на нуклеотидни подписи и специфични за вида праймери. Регионите ITS2 от 251Cistanches Herbaи проби от фалшифициране бяха секвенирани. На базата на SNP сайтове бяха разработени четири нуклеотидни сигнатури в рамките на 30 ~ 37 bp и шест видово-специфични праймера и те бяха валидирани чрез изкуствени експериментални смеси, състоящи се от шест различни вида и различни съотношения. Този метод е приложен и за откриване на 66Cistanches Herbaпродукти на пазара, включително екстракти и китайски патентовани лекарства. Резултатите демонстрираха полезността на нуклеотидните сигнатури при идентифициране на подправки в смеси. Проучването на пазара разкрива 36,4 процента фалшифициране: 19,7 процента включват фалшифициране с Cynomorium songaricum илиЦистанчеSinensis, а 16,7 процента включват заместване с Cy. songaricum, Ci. sinensis, или Boschniakia rossica. Резултатите също разкриха, че Cy. songaricum беше най-разпространеният фалшификат на пазара. Поради това препоръчваме използването на специфични за вида нуклеотидни сигнатури за регулиране на подправянето и проверка на осигуряването на качеството на веригите за доставка на лекарствени продукти, особено за преработени продукти, чиято ДНК е разградена.

Ключови думи: Cistanches Herba, китайска патентована медицина, нуклеотиден подпис, разградена ДНК, контрол на качеството на лекарствата

ВЪВЕДЕНИЕ

Cistanches Herba(Rou Cong Rong) е добре известно лекарство, записано във Фармакопеята в Азия (Комисия по китайската фармакопея, 2015 г.; Японска фармакопейна конвенция, 2016 г.); това лекарство се получава от изсушени сочни стъбла наCistanche deserticolaYC Ma илиCistanche tubulosaтоник, тъй като не е токсичен и може да се приема продължително време (Li et al., 2016). Освен това,цистанчииХерба беше удостоена с честта да бъде наречена „Пустинен женшен“ поради голямата си медицинска стойност, особено за укрепване на мъжката сексуална функция (Zhang and Su, 2014; Gu et al., 2016). Има повече от 100 китайски патентовани лекарства, записани в Комисията по китайската фармакопея (2015 г.) и в други местни официални обнародвани стандарти (Wang et al., 2012). Тъй като населението на възрастните хора се увеличава, има значително търсене наCistanches Herbaи неговите лекарствени продукти. Суровинните ресурси обаче стават все по-оскъдни. Всъщност двата оригинални вида наCistanches Herbaса добавени в Червената книга на растенията в Китай като защитени от държавата диви растения (категория II) (Fu, 1991). Лечебните материали на пазара се отглеждат главно в северозападен Китай.

Поради значителния дисбаланс между търсенето и предлагането нацистанчииHerba, на пазара са навлезли много фалшификати; тези подправки не са в съответствие със стандартите и могат да застрашат сигурността на лекарствата. Известните подправки включват изсушените сочни стъбла на Cynomorium songaricum Rupr. (Cynomorii Herba, Suo Yang на китайски),Цистанчеsinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan и Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch. et Flerov (Sun et al., 2012). Тези подправки имат морфологични характеристики, подобни на тези нацистанчииHerba, което затруднява традиционната таксономична идентификация, особено след като материалът се преработи в лекарствени продукти. Микроскопската идентификация не е налична, защотоцистанчииHerbaняма окончателни или уникални микроскопични характеристики. Настоящите инструменти за аналитична химия не са достатъчни за откриване на фалшифициране на Cistanches Herba, тъй като подобни съединения съществуват и в рамките на известните фалшиви добавки Ci. салса (Lei et al., 2001; Chen et al., 2007) и Ci. sinensis (Liu et al., 2013). Следователно разработването на бърз молекулярен метод за удостоверяване на Cistanches Herba и неговите продукти е спешно необходимо за правилните системи за контрол на качеството в китайската патентна медицина и други индустрии за лекарствени продукти.

Чен и др. за първи път предложи вътрешен транскрибиран спейсър 2 (ITS2) като универсален баркод за лечебни растения (Chen et al., 2010). Сън и др. потвърди ITS2 региона като предпочитан ДНК баркод за идентифициранецистанчииХерба и нейните примеси (Sun et al., 2012). Въпреки това, ITS2 не може да се използва за разграничаване на китайската патентована медицина от разградената ДНК. Напоследък нарастващ брой проучвания показват, че „мини баркодът“ е полезен метод за усилване на разградена ДНК (Hajibabaei et al., 2006; Meusnier et al., 2008; Dubey et al., 2011; Lo et al., 2015 г.). Въпреки това, нуклеотидните сигнатури са по-подходящи от мини баркодовете, тъй като първите се отнасят до един или повече нуклеотиди, които са уникални за един вид и могат да бъдат ефективно използвани от много молекулярни техники, като ДНК сонди, микрофлуиди и изотермична амплификация, медиирана от бримка ( de Boer et al., 2015). Хан и др. разработиха нуклеотидни подписи за Panax ginseng, Angelica Sinensis и Lonicera japonica и успешно идентифицираха свързаните китайски патентовани лекарства (Liu et al., 2016; Wang et al., 2016a; Gao et al., 2017).

функционални продукти, съдържащицистанчииHerba. По-конкретно, ние (1) разработихме четири нуклеотидни сигнатури и шест специфични двойки праймери за диференциране на автентичницистанчииHerba и известни фалшифицирани вещества, (2) потвърдиха четирите нуклеотидни сигнатури в експерименти, включително смеси от известни таксономични ваучери, използвани за приготвяне на продукти Cistanches Herba, които съдържат както автентични, така и фалшифицирани съставки, и (3) извършиха пазарно проучване на 66цистанчииПродуктите на Herba чрез техните нуклеотидни сигнатури.

Цистанчеима много ефекти и може да подобри функцията на бъбреците

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Вземане и подготовка на проби

Общо 251 проби са събрани от Вътрешна Монголия, Синдзян и Нинся, наред с други области; тези проби включват 214Cistanches Herbaи 37 подправки и са подробно описани в допълнителна таблица S1. Съответните проби от ваучери бяха валидирани от таксономисти и депозирани в Хербариума на Института за развитие на лечебните растения, Китайската академия на медицинските науки, Пекин, Китай. Общо 35 партиди прахове, подправки и екстракти отцистанчииHerba са закупени от онлайн магазини и физически аптеки в Пекин и Чънду (Таблица 1). Общо 31 партиди китайско патентовано лекарство, съдържащоцистанчииHerba са закупени от различни аптеки (Таблица 2), а декларираните състави на различни китайски патентовани лекарства са показани в допълнителна таблица S3. Различните морфологични характеристики на различните лекарствени форми са показани на фигура 1.

Смесени проби: Прахове от Ci.deserticola, Ci.tubulosa, Cy. songaricum, Ci. sinensis, B. rossica и O. coerulescens бяха изкуствено смесени в различни комбинации (в съотношение 1:1) преди екстракция. Подробностите за тези смесени проби са показани в легендата на Фигура 3. В допълнение, праховете от четири фалшиви добавки бяха смесени с оригиналния Ci. deserticola в различни тегловни съотношения: 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 и 60000:1 (Таблица 3). И двата оригинални продукта се смесват в същите пропорции.

Отвара: резени Ci. deserticola и Cy. за приготвяне на отвара се е използвал songaricum. Резените (10 g) се варят в 300 mL двойно дестилирана вода за 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 и 240 минути и след това се използват за екстракция на ДНК.

Екстракция на ДНК, амплификация с полимеразна верижна реакция (PCR) и секвениране

Образци, отвара и смесени проби: Пробите (40–50 mg) се смилат на фини прахове чрез лабораторна смесителна мелница Retsch MM400 (Retsch Co., Германия) при честота 30 Hz. Впоследствие геномната ДНК се екстрахира с Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co., China) съгласно инструкциите на производителя. ITS2 беше амплифициран от универсалните праймери 2F/3R (Chen et al., 2010).

паралелно на партида. Прахът на китайското патентовано лекарство се промива със 700 µL буфер за предварително промиване [100 mM Tris-HCl, рН 8.0; 20 тМ етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA), рН 8.0;

700 mM NaCl; 2 процента поливинилпиролидон (PVP) -40; и 0,4 процента -меркаптоетанол] няколко пъти, докато супернатантата стане бистра и безцветна, след което сместа се центрофугира при 7500 × g за 5 минути при стайна температура. Утайката впоследствие се използва за извличане на геномната ДНК чрез Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co.) съгласно инструкциите на производителя. В крайна сметка ДНК от всяка партида се концентрира в една епруветка. Шест видово-специфични двойки праймери - SYF1/SYR1, HMRCF/HMRCR, GHRCF/GHRCR, CCRF/CCRR,

SCRF/SCRR и LDF/LDR—са проектирани чрез Primer Premier

6.0 софтуер (Premier Co., Канада) за амплифициране на Cistanches Herba и нейните подправки (подробностите са показани в таблица 4). PCR се извършва в реакция с обем 50 µL, съдържаща 1 µL от

KOD FX (Toyobo Co., Япония), 25 µL от 2 × PCR буфер, 10 µL от dNTPs (2 mM), 1,5 µL от всеки праймер (10 µM) и 4 µL (~50 ng) от ДНК матрица; останалият обем се състои от двойно дестилирана вода. Реакциите са извършени от

термичен цикъл (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., САЩ); термичните програми са изброени в таблица 4. PCR продуктите се изследват чрез електрофореза с 3 процента агарозен гел и се пречистват за двупосочно секвениране с ABI 3730XL секвенсер (Applied Biosystems Co.) в съответствие с метода за секвениране на Sanger. След това чувствителността на шестте праймера беше тествана чрез количествен PCR в реално време (qRT-PCR) анализ с CFX96 система в реално време (Bio-rad Lab., САЩ). Праговете на цикъла бяха изчислени автоматично от системата чрез модела "PCR Baseline Subtracted Curve Fit". qRT-PCR се извършва в реакция от 15 µL-обем, съдържаща 7,5 µL от SYBRⓍR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)

(Takara Bio Co., Япония), 1.0 µL от всеки праймер (10 µM) и 1,0 µL ДНК матрица, като останалият обем се състои от двойно дестилирана вода. QRT-PCR беше извършен с три технически повторения, въз основа на които беше изчислена стандартната грешка.

Анализ на последователността: Последователностите бяха редактирани и ръчно сглобени чрез CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., САЩ).

ITS последователностите от GenBank бяха анотирани чрез Hidden Markov model (HMM), за да се получат ITS2 последователностите (Keller et al., 2009). След това последователностите бяха подравнени от софтуера MEGA 5.0 чрез метода за подравняване "Muscle" (Edgar, 2004; Tamura et al., 2011).

Цистанчеима много ефекти и може да подобрибъбрекфункция

РЕЗУЛТАТИ

Разработване на нуклеотидни сигнатури и специфични за вида двойки праймери за Cistanches Herba и Adulterants

Успехът на PCR амплификацията и секвенирането на 251 проби е 100 процента, когато се използва праймерната двойка 2F/3R. Подравнената дължина на Cy. songaricum ITS2 последователностите бяха 229 bp (допълнителна фигура S1). Анализът на последователностите от хербарийните видове и тези на тясно свързани видове, извлечени от GenBank (допълнителна таблица S2), разкрива две места за единичен нуклеотиден полиморфизъм (SNP) за Cy. songaricum. На базата на SNP, един Cy. Беше разработен специфичен за songaricum 30- bp нуклеотиден подпис (5′-caattatttg aggtgcattg taagaagcgt-3') (Фигура 2А). Резултатите от инструмента за търсене на основно локално подравняване (BLAST) в NCBI показаха, че този нуклеотиден подпис е уникален за Cy. songaricum (Таблица 5). С подобен анализ на последователностите от тясно свързани видове, един до два SNP бяха открити от Ci. sinensis, B. rossica и O. coerulescens. На базата на SNPs, нуклеотидните сигнатури за другите три превратни вещества също са разработени по подобен начин, включително 34 bp сигнатура (5′-cgatggtctc ccgtgcgcga,ggatgcacgg ccgg-3′) за Ci. Sinensis, сигнатура от 37 bp (5′- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtc-3') за B. rossica и сигнатура от 31 bp (5′-gtctgtcgtg tcggatggtg ttgcttgttg g-3′) за O. coerulescens (Фигури 2BD). BLAST анализът в NCBI също разкри, че тези нуклеотидни сигнатури са специфични и не присъстват в други видове (Таблица 5).

Cistanches Herbaи неговите примеси могат да бъдат амплифицирани едновременно от смеси чрез 2F/3R универсална праймерна двойка. По този начин ние проектирахме специфични за вида праймери за амплификация на нуклеотиден подпис чрез подравняване на ITS2 последователностите. Четири специфични двойки праймери — SYF1/SYR1, CCRF/CCRR, SCRF/SCRR и LDF/LDR — са проектирани да усилват нуклеотидните сигнатури на Cy. songaricum, B. rossica, Ci. sinensis и O. coerulescens, съответно (Таблица 4). Дължините на ампликоните са съответно 123, 72, 131 и 71 bp.

Освен това бяха анализирани общо 214 ITS2 последователности от експериментални материали на Cistanches Herba. Два къси специфични праймера - HMRCF/HMRCR и GHRCF/GHRCR за Ci. deserticola и Ci. tubulosa, съответно - са предназначени да усилят късите области на разградените проби (Таблица 4). Дължините на ампликоните са съответно 132 и 134 bp.

Валидиране на нуклеотидната сигнатура и метода на специфичния за вида праймер, базиран на изкуствени смеси и отвара

Ефективността на усилване на новите двойки праймери беше валидирана от сместа. PCR продуктите бяха получени чрез всяка двойка праймери за всеки целеви вид, както е показано

cq стойности на B. rossica или O. coerulescens могат да бъдат получени дори съотношението на пробите да е 30000:1 или 40000:1, а резултатите от амплификацията на Ci. sinensis, Ci.tubulosaи Ci deserticola могат да бъдат открити, когато съотношението е 20000:1. Но не могат да бъдат получени откриваеми резултати за Cy. songaricum, когато представлява пропорция 20 000:1.

За да се провери дали методът на нуклеотидния подпис функционира с обработени материали, отвари от Ci. deserticola и Cy. бяха приготвени songaricum. Резултатите показаха, че краткият баркод от Ci. deserticola може да бъде усилен, дори след като пробите са били варени в продължение на 210 минути. В допълнение, нуклеотидният подпис на Cy. songaricum може да бъде амплифициран след варене на пробите в продължение на 150 минути, докато не са открити PCR продукти след варене на пробите в продължение на 210 или 240 минути (Фигура 4). Резултатите от секвенирането показват, че краткият нуклеотиден подпис е успешно получен от отварата.

Пазарно проучване на подправяне чрез нуклеотиден подпис и специфични праймери

Горният метод беше приложен за откриване нацистанчииПродуктите на Herba на пазара. Тридесет и пет партиди отцистанчииСрезове, прахове и екстракти от Herba бяха амплифицирани и секвенирани чрез използване на шест проектирани специфични праймера (резултатите от електрофорезата в агарозен гел са показани на допълнителна фигура S2 и последователностите са изброени в допълнителен лист с данни 1). Анализът на последователностите чрез техните нуклеотидни сигнатури разкрива, че пет партиди срезове са автентични. Една партида от парчета и една партида от прах бяха заменени с Cy. songaricum и един екстракт бяха заменени с Ci. sinensis. Другите шест партиди прахове бяха смеси: пет бяха подправени с Cy. songaricum и Ci. sinensis и един е фалшифициран с Cy. songaricum (Таблица 1). В допълнение, една партида от резени беше заменена със Salvia miltiorrhiza.

Cistanches Herba в китайските патентовани лекарства се подлага на различни процеси, които затрудняват удостоверяването. Тествана е способността на шестте двойки праймери да амплифицират специфичните за видовете нуклеотидни сигнатурни области от китайските патентовани лекарства (резултатите от електрофорезата в агарозен гел са показани на допълнителна фигура S2). Повечето китайски патентовани лекарства съдържат компоненти от различни видове видове. Например хапчетата Shihu Yeguang (ZCY34) съдържат 25 съставки, включително Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu) и Ginseng Radix et Rhizoma (Ren Shen). От тези съставки Cistanches Herba може да се усили специално чрез двойката праймери GHRCF/GHRCR. Директното секвениране на PCR продуктите разкри много чисти следи. Въпреки това, видима лента не може да бъде получена с двойката праймери HMRCF/HMRCR.

Друг пример са хапчетата Kangguzhi Zengsheng (ZCY44). Има осем съставки в допълнение къмцистанчииHerba в това китайско патентовано лекарство, но нямаше видими ивици, получени нито от GHRCF/GHRCR, нито от HMRCF/HMRCR, което означаваше, че неCistanches Herbaприсъстваше. Въпреки това, прелюбодейният регион на Cy. songaricum беше успешно амплифициран от специфичната праймерна двойка SYF1/SYR1. Резултатите от секвенирането демонстрират късата нуклеотидна сигнатура на Cy. songaricum беше успешно получен.

Цистанчеима много функции и имапротивовъзпалителноефекти