ЧАСТ 1 Ехинакозидът предизвиква вазорелаксация на белодробната артерия на плъх чрез отваряне на каналите NO-cGMP-PKG-BKCa и намаляване на вътреклетъчните нива на Ca2 плюс

Как ехинакозидът предизвиква венозна релаксация?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri- li GE1, 2, * 1 Катедра по фармакология, Училище по наука за живота и биофармацевтика, Фармацевтичен университет в Шенянг, Шенянг 110016, Китай; 2 Изследователски център за медицина на голяма надморска височина, Медицински колеж на университета Цинхай, Сининг 810001, Китай; 3 Факултет по фармация, Цинхайски университет за националности, Сининг 810007, Китай; 4 Qinghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xining 810001, Китай

Цел:Продължителната белодробна вазоконстрикция, наблюдавана на голяма надморска височина, може да доведе до белодробна хипертония (PH). Основната цел на това изследване е да се изследва вазорелаксиращият ефект наехинакозид(ECH), фенилетаноиден гликозид от тибетската билка Lagotis brevituba Maxim иCistanche tubulosa, върху белодробната артерия и нейния потенциален механизъм.

Методи:Белодробни артериални пръстени, получени от мъжки плъхове Wistar, се суспендират в камери на органи, напълнени с разтвор на Krebs-Henseleit, и изометричното напрежение се измерва с помощта на преобразувател на сила. Вътреклетъчните Ca2 плюс нива бяха измерени в култивирани белодробни артериални гладкомускулни клетки на плъх (PASMCs) с помощта на Fluo 4-AM.

Резултати: ECH(30–300 μmol/L) отпуснати белодробни артерии на плъхове, предварително свити от норадреналин (NE) по зависим от концентрацията начин и този ефект може да се наблюдава както при интактния ендотел, така и при оголените от ендотел пръстени, но със значително по-нисък максимален отговор и по-висок EC50 в оголени от ендотел пръстени. Този ефект беше значително блокиран от L-NAME, TEA и BaCl2. Въпреки това, IMT, 4-AP и Gli не инхибиратECH- предизвикана релаксация. При извънклетъчни условия без Са2 плюс, максималната контракция е намалена до 24,54 процента ±2,97 процента и 10,60 процента ±2,07 процента в пръстени, третирани съответно със 100 и 300 μmol/L ECH. При условията на извънклетъчен приток на калций, максималната контракция беше намалена до 112,42 процента ±7,30 процента, 100,29 процента ±8,66 процента и 74,74 процента ±4,95 процента в пръстени, третирани съответно с 30, 100 и 300 μmol/L ECH. След като клетките бяха заредени с Fluo 4-AM, средният интензитет на флуоресценция беше по-нисък в клетките, третирани сECH(100 μmol/L), отколкото при NE.

Заключение: ECHпотиска NE-индуцираното свиване на белодробната артерия на плъхове чрез намаляване на вътреклетъчните нива на Са2 плюс и индуцира нейното отпускане чрез NO-cGMP пътя и отваряне на K плюс канали (BKCa и KIR).

Ключови думи:Тибетска билка;ехинакозид; белодробна хипертония; голяма надморска височина; вазорелаксация; НЕ; BKCa; KIR; артериален пръстен; гладкомускулни клетки на белодробната артерия.

За повече информация моля свържете се с:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola има много ефекти, щракнете тук, за да научите повече

Въведение

Продължителната белодробна вазоконстрикция, наблюдавана на голяма надморска височина, може да доведе до белодробна хипертония (PH) и медиална хипертрофия [1], които са идентифицирани като основната причина за хипертрофия на дясната камера и сърдечна недостатъчност [2]. Индивидите, живеещи на голяма надморска височина, временно или постоянно, могат да имат лека до умерена белодробна хипертония, а тези с по-голяма чувствителност към хипоксия може да имат прекомерна белодробна вазоконстрикция, водеща до различни заболявания на голяма надморска височина, които са свързани със значителна заболеваемост и смъртност, като напр. височинен белодробен оток и сърдечни заболявания[3].Ехинакозид(ECH) (Фигура 1) е aфенилетаноиден гликозидоткрит в различни китайски билки като тибетската билка Lagotis brevituba Maxim иCistanche tubulosa[4, 5]. Lagos brevituba Maxim е вид Lagotis spp, принадлежащ към Scrophulariaceae и расте широко на надморска височина над 3000 метра в Цинхай-Тибетското плато.ECHима различни желани фармакологични характеристики, като антиоксидантни, противовъзпалителни, невропротективни, хепатопротективни и азотен оксид (NO) радикални свойства [6]. Може също така да предизвика ендотелиум-зависима релаксация в пръстените на торакалната аорта на плъхове и да лекува сърдечно-съдови заболявания[7]. Въпреки това, доколкото ни е известно, не е имало проучване, изследващо ефектите му върху съдовия тонус в белодробните артерии. Целите на това проучване са следните: (1) да се проучи дали ECH индуцира in vitro вазорелаксация в белодробни артерии на плъхове, предварително свити с норадреналин (NE), и дали този ефект, ако има такъв, е ендотелиум-зависим или действа директно върху съдовата гладка мускулатура ; (2) за изследване на ефекта на ECH върху извънклетъчния приток на калций и вътреклетъчното освобождаване на калций в гладкомускулните клетки на белодробната артерия на плъх (PASMCs); и (3) за идентифициране на възможни пътища и K плюс канали, включени в ECH-индуцираната релаксация.

Материали и методи

Реактиви

ECH беше любезно предоставен от д-р Peng-fei TU от Пекинския университет (Пекин, Китай), с чистота над 98 процента, както е определено чрез високоефективна течна хроматография. Диметил сулфоксид (DMSO) е закупен от Solar Science & Technology Co, Ltd (Пекин, Китай); NE, ацетилхолин (ACh, по-голямо или равно на 99 процента), индометацин (IMT), Nω -нитро-L-аргинин метилов естер хидрохлорид (L-NAME), тетраетиламониев хлорид (TEA), бариев хлорид (BaCl2), {{ 9}}аминопиридин ({{10}}AP) и глибенкламид (Gli) от Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA); модифицирана среда на Eagle с високо съдържание на глюкоза на Dulbecco (DMEM), фетален волски серум (FBS) и трипсин от Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, USA); миши анти-миши първичен гладкомускулен актин (-SMA) антитяло и козе анти-мише вторично антитяло от Boshide Biotech Co, Ltd (Wuhan, Китай); Fluo калциеви индикатори (Fluo 4-AM) от Invitrogen Corp (Карлсбад, Калифорния, САЩ); и всички неорганични соли от Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Пекин, Китай). IMT се разтваря в DMSO и 5 процента NaH2PO4, Gli, Fluo 4-AM и ECH се разтварят в DMSO, а всички други реагенти се разтварят в разтвор на Krebs-Henseleit (KH) или PBS. Предварителните експерименти показват, че DMSO при по-малко от 0,1 процента (v/v) няма ефект върху развитието на напрежението на изолирани белодробни артериални пръстени.

Опитни животни

Всички процедури и протоколи бяха одобрени от Комитета за грижа и използване на животните към Медицинския колеж на университета Цинхай. Мъжки плъхове Wistar, на възраст 6–8 седмици, 250–300 g телесно тегло, бяха закупени от Центъра за животни на университета в Ланджоу (Ланджоу, Китай) и държани на стандартна лабораторна диета и чешмяна вода ad libitum при температура на околната среда 22± 2 градуса и относителна влажност от 45 процента –55 процента по време на експериментите.

Ин витро перфузия на белодробна артерия

Приготвяне на белодробни артериални пръстени на плъх

Плъхове с тегло 250–300 g бяха анестезирани чрез интраперитонеално инжектиране на натриев пентобарбитал (40 mg/kg), след което сърцата и белите им дробове бяха отстранени и незабавно потопени в леденостуден разтвор на KH, съдържащ (в mmol/L) : 118 NaCl, 4.7 KCI, 2.5 CaCl2, 1.2 MgSO4·7H2O, 1.2 KH2PO4, 25 NaHC03 и 11.1 глюкоза (рН 7.4). Вътребелодробните артерии (0,7–1,5 mm в диаметър) се отрязват без околната съединителна тъкан и адвентиция и след това се нарязват на пръстени с дължина приблизително 2–3 mm. Пръстените бяха суспендирани в камери за органи, напълнени с 10 mL разтвор на KH при 37 градуса и обгазени с 95 процента O2–5 процента CO2 [8], и изометричното напрежение беше измерено с помощта на преобразувател на сила (JH-2, Space Medico -Инженерен институт, Пекин, Китай)

Оценка на активността на съдовия пръстен и оценка на ендотелната функция

Пръстените на съдовете се оставят да се уравновесят в продължение на 2 часа при базално напрежение от 400 mg, през което време разтворът на KH се сменя на всеки 15 минути; след това 1 μmol/L NE се добавя в камерата, за да се оцени активността на всеки пръстен чрез откриване на процента на свиване. Преди и след експерименталния протокол беше измерен процентът на свиване (Фигура 2A и 2B). Ендотелът беше отстранен в някои пръстени чрез внимателно триене на повърхността на интимата с фина стоманена жица и целостта беше оценена качествено чрез степента на релаксация, причинена от ACh (10 μmol/L) в процента на контрактилния тонус, индуциран от NE (1 μmol/L). Ако релаксацията с ACh е по-голяма от 80 процента, ендотелиумът остава в добро състояние; ако отпускането е по-малко от 30 процента, ендотелиумът е разрушен (Фигура 2A и 2B)[9].

Изолиране и култура на PASMCs на плъхове

Дисталните белодробни артерии се изолират от белодробните лобове на плъхове и ендотелиумът и адвентицията се отстраняват внимателно. След като тъканите бяха смлени на {{0}} mm парчета, те бяха добавени незабавно към колбите, поддържани при 37 градуса и 5 процента CO2 във влажен инкубатор за приблизително четири часа и след това култивирани с DMEM с високо съдържание на глюкоза допълнен с 20 процента FBS, 100 U/mL пеницилин и 100 U/mL стрептомицин за приблизително пет дни. Половината от културалната среда беше заменена със свежа среда, когато клетките се появиха. Когато клетките достигнат 80 процента сливане, те се събират с 0,125 процента трипсин и се посяват в колби (съотношение 1:2), съдържащи DMEM с високо съдържание на глюкоза, допълнен с 10 процента FBS, 100 U/mL пеницилин и 100 U/mL стрептомицин . За всички експерименти бяха използвани клетки с три до осем пасажа.

Идентифициране на PASMC чрез имунохистохимия

PASMCs са положителни за имунохимично оцветяване, когато се наблюдават типични характеристики на "хълм и долина". Клетките се посяват в 6-ямкови плаки със стъклени покривни стъкла. Когато клетките достигнат 80 процента сливане, те се фиксират в 4 процента параформалдехид, блокират се с 3 процента водороден пероксид за 15 минути и след това се инкубират с мише анти-плъхово първично -SMA антитяло за една нощ при 4 градуса. След промиване три пъти в PBS за 10 минути, клетките се инкубират с козе анти-мише вторично антитяло при стайна температура за 45 минути, промиват се отново три пъти в PBS за 10 минути и се визуализират с диаминобензидин.

Откриване на вътреклетъчната концентрация на калций в PASMCs на плъхове

PASMC бяха посяти в {{0}}плаки с ямки със стъклени покривни стъкла. Когато клетките достигнат 80 процента сливане, културалната среда се заменя с DMEM без серум. Двадесет и четири часа по-късно клетките бяха заредени със 7 μmol/L Fluo 4-AM при 37 градуса за 30 минути във влажна атмосфера с 5 процента CO2. Остатъчното багрило се промива с разтвор на балансиран солев разтвор на Ханкс (HBSS), съдържащ следното (в mmol/L): 1,26 CaCl2, 0.49 MgCl2·6H2O, 0.41 MgSO4·7H2O, 5,33 KCl, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHCO3, 137,93 NaCl, 0,34 Na2HPO4 и 5,56 D-глюкоза, без фенолно червено. Клетки, заредени с Fluo 4-AM, бяха изложени на едно от трите условия на лечение: (1) контролна група (против група), в която клетките бяха инкубирани с DMEM без серум; (2) групата NE, в която клетките се инкубират с DMEM без серум, допълнен с 1 μmol/L NE за 10 минути; и (3) групата NE плюс ECH (100 μmol/L) (група NE плюс ECH100), в която клетките се инкубират с DMEM без серум, допълнен с 1 μmol/L NE за 10 минути и 100 μmol/L ECH за 20 мин. Интензитетът на флуоресценция беше наблюдаван и фотографиран чрез флуоресцентна микроскопия (IX71, Olympus, Токио, Япония) [11]. За всяка проба бяха събрани шест зрителни полета (200 ×). Вътреклетъчната концентрация на калций се определя количествено чрез измерване на средния интензитет на флуоресценция с помощта на софтуера Image Pro-Plus 6.0.

Статистически анализ

Данните бяха изразени като средна стойност ± SD. Когато подходяща, значителна разлика е оценена чрез теста на Dunnett или теста Student-Newman-Keuls за множество сравнения след еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA). Ниво на вероятност от P<0.05 was="" considered="">

Резултати Вазорелаксантни ефекти на ECH върху изолирана белодробна артерия

В началото на експеримента кумулативното добавяне на ECH от 30 до 300 μmol/L няма значителен ефект върху базалното напрежение на белодробната артерия. След като индуцираната от NE вазоконстрикция достигне плато, ECH се добавя кумулативно (30–300 μmol/L) към непокътнатия ендотел (E плюс, Фигура 2C) или оголените от ендотел пръстени (E–, Фигура 2C). В непокътнати ендотелни пръстени, кумулативното добавяне на ECH разширява съдовете по зависим от концентрацията начин, с максимален

майчински процент на релаксация от 89,22 процента ±0.32 процента при 300 μmol/L и EC50 от 51,60±0,57 μmol/L (Фигура 2A и 2C). По подобен начин, в оголени от ендотел пръстени, ECH също разширява съдовете по зависим от концентрацията начин, но със значително по-нисък максимален отговор от 67,72 процента ±1,69 процента (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Ефекти на ECH върху вътреклетъчното освобождаване на калций и извънклетъчния приток на калций

Оголените от ендотел пръстени бяха изложени на 1 μmol/L NE до достигане на максималната контракция. При екстрацелуларни условия без Ca2 плюс, пръстените бяха уравновесени в свободен от Ca2 разтвор на KH, съдържащ 0.2 mmol/L EGTA преди започване на експериментите. След три промивания с разтвор на KH без Ca2 plus и без EGTA, пръстените се инкубират предварително с ECH (30, 100 и 300 μmol/L) за 20 минути и след това отново се излагат на 1 μmol/L NE. Произведените пръстени

непродължителни контракции, които бързо се връщат към изходното ниво, в сравнение с първоначалните контракции, предизвикани от NE, която служи като референтна стойност. Максималната контракция на контролата беше 33,27% ±2,94% (Фигура 3A и 3E), но беше значително намалена до 24,54% ±2,97% и 10,60% ±2,07% в пръстени, предварително третирани съответно със 100 и 300 μmol/L ECH (P<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Роли на различни инхибитори в ECH-индуцирана вазорелаксация на белодробната артерия на плъх

Индуцираната от ECH вазорелаксация на белодробната артерия на плъх е изследвана в присъствието или отсъствието на следните инхибитори: L-NAME (инхибитор на eNOS), IMT (инхибитор на циклооксигеназа), TEA (инхибитор на Ca2 плюс -активиран К плюс канал с голяма проводимост), BaCl2 ( вътрешен токоизправител K плюс инхибитор на канала), 4-AP (зависим от напрежението K плюс инхибитор на канал) и Gli (ATP-чувствителен K плюс инхибитор на канал). Пръстените бяха максимално свити с 1 μmol/L NE и след това L-NAME (100 μmol/L), IMT (10 μmol/L), TEA (1 mmol/L) бяха добавени съответно BaCl2 (1 mmol/L), 4-AP (1 mmol/L) или Gli (10 μmol/L). След като се достигне ново плато, ECH се добавя кумулативно от 30 до 300 μmol/L. Кривите концентрация-отговор в присъствието на различни инхибитори са показани на Фигура 4. Вазорелаксантният ефект на ECH върху белодробни артериални пръстени, свити с 1 μmol/L NE, е значително блокиран от L-NAME (100 μmol/L), TEA ( 1 mmol/L) и BaCl2 (1 mmol/L), с максимални релаксации съответно от 64,41 процента ±3,20 процента, 84,38 процента ±0,70 процента и 75,27 процента ±0,93 процента (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Идентифициране на PASMCs на плъхове

At low magnification, spindle cells were densely packed, and almost all the cells were stained positively for PASMCs (the PASMC purity was >95 процента) (Фигура 6А). Кафяво оцветени миофиламенти се наблюдават ясно в цитоплазмата при голямо увеличение (Фигура 6В).

Цистанчеехинакозидможе да устоиапоптоза

Ефект на ECH върху вътреклетъчната концентрация на калций в PASMCs на плъхове

NE (1 μmol/L) значително повишава вътреклетъчната концентрация на калций (n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">