ЧАСТ 1 Приготвяне и оценка на базирано на микроемулсия трансдермално доставяне на фенилетаноидни гликозиди на Cistanche Tubulosa

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

JIANHUA YANG1*, HUANHUAN XU1-3* и др.

Резюме.

Основната цел на настоящото изследване беше да се разработи нова микроемулсионна (ME) формулировка, която да се доставяфенилетаноиден гликозид от цистанхе(PG) за използване в изсветлители на кожата и слънцезащитни продукти. Маслената фаза беше избрана на базата на разтворимостта на лекарството, докато повърхностно активното вещество и коповърхностно активното вещество бяха скринирани и избрани на базата на техния капацитет за разтваряне и ефективността, с която те образуват ME. Псевдо тройните фазови диаграми бяха конструирани за оценка на ME региони и пет формулировки на масло във вода MEs бяха избрани като носители. Проведени са in vitro експерименти за проникване на кожата, за да се оптимизира ME формулировката и да се оцени нейната пропускливост в сравнение с тази на физиологичен разтвор. Физикохимичните свойства на оптимизирания ME и проникващата способност на PG(фенилетаноиден гликозид от цистанхе) доставени от този ME също бяха изследвани. Оптимизираният ME състав се състои от изопропил миристат (7 процента, w/w), Cremorphor EL (21 процента, w/w), пропилей гликол (7 процента, w/w) и вода (65 процента, w/w). Кумулативното количество PG(фенилетаноиден гликозид от цистанхе) който прониква през изрязаната кожа на мишка, когато се пренася от ME, е ~1,68 пъти по-голям от този, когато PG се пренася само от физиологичен разтвор. Кумулативното количество PG в микроемулсията (4149.650±37.3 µg·cm-2) е значително по-голямо от това на PG във физиологичния разтвор (2288.63±20.9 µg· cm-2 ). Освен това, коефициентът на пропускливост показва, че оптимизираната микроемулсия е по-ефективен носител за трансдермално доставяне на PG, отколкото контролния разтвор (8,87±0,49 cm/hx10-3 спрямо 5,41±0,12 cm/hx10-3). Взети заедно, пропускливата способност на PG, пренасяна от ME, е значително повишена в сравнение с физиологичен разтвор.

цистанче

Въведение

Herba cistanche,тонизираща билка, често разпространена в пустинните райони, често се използва в традиционната китайска медицина. Към днешна дата са проведени множество проучвания за изследване на неговите биофармацевтични свойства, включително подобряване на паметта, сексуалната потентност, отстраняването на свободните радикали и активността против стареене (1). Основният компонент на H. cistanche ефенилетаноиден гликозид (PG). Предишни проучвания разкриха, че PG инхибира активността на тирозиназата, ензима, ограничаващ скоростта на синтеза на меланин в човешкото тяло (2). В допълнение, PG(фенилетаноиден гликозид от цистанхе) се съобщава, че е отговорен за отстраняването на 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил радикали (3) и защитава кератиноцитите от ултравиолетова (UV) радиация. Следователно този компонент може да има потенциал за депигментация на кожата. Локалните медикаменти се използват често в козметичните области, като лекарството се доставя директно върху повърхността на тялото (4). Микроемулсиите (МЕ) са нова система за доставяне на лекарства, конвенционално съставена от масло, повърхностно активно вещество, ко-повърхностно активно вещество и водна фаза (5) и се съобщава, че подобряват скоростта и абсорбцията на липофилни лекарства (6). В допълнение, поради неговата задоволителна разтворимост, слабо дразнене на кожата и висока пропускливост, се очаква да се използва за локално доставяне на лекарства (7,8). Доколкото ни е известно, са проведени няколко проучвания, при които PG е доставен чрез локално лекарство с помощта на микроемулсия. В настоящото проучване беше установена система за доставяне на наноемулсия масло във вода (O/W) за трансдермално приложение и PG беше включен в наноемулсията (9, 10). Междувременно, подготовката и характеризирането на базираната на PG наноемулсия бяха извършени чрез изследване на трансдермалното освобождаване in vitro.

Материали и методи Реактиви.

Cremorphor EL и изопропил миристат (IPM) са закупени от Sigma Aldrich; Merck Millipore (Дармщат, Германия). Етанол, олеинова киселина (OA) и Tween-80 са закупени от Guangcheng Chemical Reagent Co., Ltd. (Тиендзин, Китай). Етил олеатът е закупен от Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Всички използвани химикали и разтворители са с клас аналитичен реагент. Приготвяне и оценка на базирано на микроемулсия трансдермално доставяне на фенилетаноидни гликозиди на Cistanche tubulosa JIANHUA YANG1*, HUAN HUAN XU1-3*, SHANSHAN WU2, BOWIE JU2, DANDAN ZHU2, YAO YAN1, MEI WANG2 и JUMPING HU{{9} } Катедра по фармация, Първа присъединена болница; 2 Катедра по естествени лекарства, Колеж по фармация, Медицински университет Синдзян, Урумчи, Синдзян 830011; 3 Department of Pharmacy, Kanghua Hospital, Dongguan, Guangdong 523003, PR China Получено на 2 декември 2015 г.; Прието на 29 ноември 2016 г., DOI: 10.3892/MMR.2017.6147 Кореспонденция до: д-р Джунпин Ху, Катедра по естествени лекарства, Колеж по фармация, Медицински университет Синдзян, 393 Xinyi Road, Урумчи, Синдзян 830011, НР Китай E-mail: hujp0551 @yeah.net * Допринесе еднакво Ключови думи: фенилетаноиден гликозид, микроемулсия, трансдермално доставяне, изсветляващо средство за кожата, слънцезащитен крем yang et al: PG ЗА КОЗМЕТИЧНО ПРИЛОЖЕНИЕ НА БАЗАТА НА ME 1110 Приготвяне на PhGs. PhG(фенилетаноиден гликозид от цистанхе) се приготвя, както е описано рутинно (11).

Изсушените на въздухC. tubulosaсе захранва и екстрахира чрез перколация с 80 процента EtOH. Перколатът се изпарява под налягане, последвано от филтруване на остатъчната течност. Филтратът се концентрира и се хроматографира върху SP-825 колона с макропореста смола, като се използват 0, 30, 50, 70 и 90 процента EtOH във вода като елуанти. 30-50 процента EtOH елуенти бяха концентрирани и изсушени до получаване на богата на PhG фракция. UV спектрофотометрията показва съдържанието на PhG(фенилетаноиден гликозид от цистанхе) е 87,6 процента. Скрининг на масла, повърхностно активни вещества и допълнителни повърхностно активни вещества за ME. Бяха проведени тестове за разтворимост, за да се изберат подходящи компоненти за приготвяне на ME формулировка с висок капацитет за зареждане с лекарство. В този процес се добавя излишно количество PG към 4 ml от всеки от следните реагенти: IPM, течен парафин, OA, Cremophor EL, Tween‑80, абсолютен етанол, пропилей гликол, глицерин и PEG400 , съответно. След това, получената смес се разклаща реципрочно при 37°C в продължение на 72 часа, последвано от центрофугиране при 12,830 xg в продължение на 10 минути. Впоследствие утайката се ресуспендира в метанол и PG се определя с помощта на UV спектрофотометрия при 333 nm. Подходящи разредени разтвори на масла, повърхностноактивни вещества и съразтворители в метанол служат като празна контрола. Построяване на фазова диаграма. За да се получи обхват на концентрация на компоненти за съществуващата граница на микроемулсията, бяха конструирани псевдотройни фазови диаграми, като се използва метод за титруване на вода, както е описано по-горе (12). Бяха изготвени трифазови диаграми с 1:3, 1:1 и 3:1 тегловни съотношения на повърхностно активното вещество към коповърхностно активното вещество. След това маслената фаза и повърхностноактивната смес се смесват в тегловни съотношения 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 и 9:1 . Сместа от масло и повърхностно активно вещество се смесват хомогенно и се разреждат на капки с пречистена вода при магнитна бъркалка (300 rpm) при стайна температура, докато се получи прозрачен ME. Концентрацията на компонентите беше записана, за да се завърши псевдо тройната фазова диаграма. Въз основа на тези диаграми бяха избрани подходящите концентрации на материали за получаване на ME на базата на PG. Приготвяне на ME и водния разтвор на PG. Общо 5 MEs (ME1-5) бяха избрани съгласно фазовите диаграми с тегловно съотношение повърхностноактивно вещество: косурфактант 3:1 (Таблица I). Микроемулсионните системи бяха приготвени чрез смесване на масло със сместа от повърхностно активно вещество и помощно повърхностно активно вещество и вода беше добавена точно в маслените фази с магнитно разбъркване (300 r/min) при 37˚C. Системите бяха уравновесени с помощта на леко магнитно разбъркване в продължение на 30 минути, последвано от разтваряне на подходящото количество PG при ултразвукова обработка. Водният разтвор се приготвя със същото съдържание на PG, разтворено в пречистена вода. Характеристика на микроемулсията. Средният размер на капките и индексът на полидисперсност на MEs бяха оценени чрез фотонна корелационна спектроскопия (Malvern Instruments, Ltd., Malvern, UK). Всички проби се разреждат с вода в съотношение 1:5 и се филтруват през 0,22 µm филтър. Тестът се провежда в термостатна камера при 25˚C в три екземпляра. Морфологията на PG микроемулсиите се наблюдава с помощта на трансмисионна електронна микроскопия (JEM-100CXII; JEOL Ltd., Токио, Япония). Накратко, една капка разредена проба се отлага върху покрита с филм медна решетка, последвано от оцветяване с една капка 2 процента воден разтвор на фосфорноволфрамова киселина.

Средните диаметри на капките на микроемулсиите бяха определени чрез апарат за фотонна корелационна спектроскопия (BI{{0}}SM; Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, USA) при стайна температура. Вискозитетът на ME превозните средства беше измерен при 25˚C, като се използва цифров вискозиметър NDJ-8S (Shanghai Precision and Scientific Instrument Co., Ltd., Шанхай, Китай) с номер. 1 ротор, настроен на 60 об./мин. определяне на pH. Стойностите на pH на MEs бяха определени при 25˚C с помощта на цифров ацидиметър Phs-3C (Shanghai REX Instruments Factory, Шанхай, Китай). Индексите на пречупване бяха измерени с термостатичен рефрактометър Abbe (фабрика за оптични инструменти, Шанхай, Китай). Подготовка на кожни тъкани. Мъжки мишки Kunming с тегло 20 g бяха закупени от Центъра за експериментални животни на Медицинския университет в Синдзян (Синдзян, Китай). 10 мишки (на възраст 6 седмици) бяха подложени на адаптивно хранене за 1 седмица при цикъл 12 часа светлина/12 часа тъмнина, при стайна температура (24±2˚C), с влажност от 50±15 процента. Всички животни имаха достъп до стандартна диета и вода. Косата е премахната с електрическа машинка. След крайна анестезия с хлоралхидрат (10 процента) чрез подкожна инжекция, кожните тъкани бяха изрязани от коремната област и подкожната мазнина и съединителната тъкан бяха отстранени. Тъканите се поставят в хладилник при 4˚C за една нощ. Протоколите от изследването са одобрени от Комитета по етика на Медицинския университет в Синдзян (Синдзян, Китай). In vitro изследване на проникването. Експериментите за проникване бяха проведени, както е описано по-горе (12). Изрязаната кожа се захваща между донора и рецепторната камера на вертикална дифузионна клетка с ефективна дифузионна площ от 2,8 cm2. Рецепторната камера се напълва с пресен нормален физиологичен разтвор. Дифузионната клетка се поддържа при 37°C, като се използва рециркулираща водна баня и разтворът в рецепторните камери се разбърква непрекъснато при 200 rpm. След това тестовият състав (1,0 ml) се поставя внимателно в донорната камера. Впоследствие 3 ml от разтвора в рецепторната камера се отстраняват и се заменят с равен обем пресен нормален физиологичен разтвор на предварително определени интервали (0, 2, 4, 6, 8, 10 и 24 часа). Пробата, получена от рецепторната камера, се използва за определяне на PG(фенилетаноиден гликозид от цистанхе)нива с помощта на UV спектроскопия при дължина на вълната 333 nm. Кумулативното количество PG, което прониква през изрязаната кожа на мишка, се изчислява съгласно следната формула:

Където Qn е натрупаното количество в даден момент t, Cn е концентрацията на лекарството в приемния разтвор при всяко време на вземане на проба, Ci е концентрацията на лекарството в пробата, S е ефективната дифузионна площ (S{{0 }}.8 cm2 ), а V0 и Vi са съответно обемите на приемния разтвор и пробата. Кумулативното количество (Qn) на PG(фенилетаноиден гликозид от цистанхе)проникнал се нанася като функция на времето (t) за всяка формулировка. Скоростта на проникване на PG в стационарно състояние (Jss, µg/cm-2 /h-1) през кожата на мишката се изчислява от наклона на линейната част на графиките на Qn спрямо времето. Коефициентът на пропускливост (Kp, cm/h) се изчислява по следната формула:

Където Kp е коефициентът на пропускливост, Jss е ефлуксът, изчислен в стационарно състояние, а C0представлява концентрацията на лекарството, която остава постоянна в носителя. Проучване за задържане на кожата. Следващите раздели описват подробно сравнението на поведението на проникване ex vivo, кумулативното количество, скоростта на проникване, коефициента на пропускливост и характеристиките на задържане в кожата между оптимизирани ME формулировки (съдържание на PG, 2 процента, w/w) и водния разтвор. В края на експеримента за проникване, нивото на остатъчното лекарство в кожата се определя с помощта на метод на хомогенизиране. След измиване с нормален физиологичен разтвор, кожата се нарязва на малки части и се поставя в стъклена епруветка, съдържаща 3 ml метанол в ледена баня. Пробата се хомогенизира със скорост от 12000 r/min. rpm за 2 минути и след това се центрофугира при 12,830 xg хоризонтално за 30 минути при 25˚C. Супернатантът се прекарва през микропорест филтър (0.45 цт) и PG(фенилетаноиден гликозид от цистанхе)нивата в супернатантата се определят чрез UV спектроскопия при дължина на вълната 333 nm. Проучване на стабилността. Физическата стабилност на ME, зареден с PG, беше изследвана чрез яснота, анализ на размера на частиците и разделяне на фазите, което беше наблюдавано при 2-8˚C и при стайна температура в продължение на 3 месеца. Центрофугирането се извършва при 12,830 xg за 30 минути при 25˚C, за да се оцени физическата стабилност на ME. Разделянето на фазите и концентрацията на PG се изследват ежемесечно, за да се прецени оптималната температура на съхранение. Химическата стабилност беше оценена на състави, заредени с лекарство, съхранявани при 2-8˚C и при стайна температура, като съдържанието на PG беше определено чрез UV спектрофотометрия при 333 nm. Тест за чувствителност на кожата. Бяха проведени тестове за кожна чувствителност върху зайци (с тегло 2,02,5 kg), за да се оцени потенциалът на дразнене при локално приложение на разработения състав, както е описано по-горе (13). Девет холандски заека (на 16 седмици; с тегло 2.0-2.5 kg; 5 мъжки и 4 женски) бяха получени от Центъра за експериментални животни на Медицинския университет в Синдзян. Животните бяха подложени на адаптивно хранене за 1 седмица при цикъл 12 часа светлина/12 часа тъмнина, при стайна температура (24±2˚C), с влажност от 50±15 процента. Всички животни имаха достъп до стандартна диета и вода. За жертвоприношението е използвана въздушна емболия. Протоколите, използвани в настоящото проучване, бяха одобрени от Комитета по етика на Медицинския университет в Синдзян (Синдзян, Китай). Космите на гърба бяха отстранени ~ 24 часа преди прилагането на ME съставите. Животните бяха разделени на следните групи: Оптимизирана ME група (n=3), с локално приложение на оптимизиран ME, съдържащ 2 процента (w/w) PG; група PG физиологичен разтвор (n=3), с локално приложение на физиологичен разтвор, съдържащ 2 процента (w/w) PG; и контролна група с физиологичен разтвор (n=3), предмет на локално приложение на нормален физиологичен разтвор. Приложението се извършва два пъти дневно в продължение на 5 дни. Животните са наблюдавани за признаци на сърбеж или промени в кожата, включително еритема, папула, лющене и сухота (14). След спиране на лекарството, наблюдението за еднократно или многократно прилагане продължава 3 дни. Резултатите за дразнене на тестовата зона бяха оценени чрез преценка на степента на еритема и оток съгласно следните критерии: 1, без видима реакция; 2, лека реакция; 3, умерена реакция и 4, тежка реакция (15,16). И накрая, общите резултати за дразнене за всяко състояние бяха изчислени с помощта на следното уравнение:

Статистически анализ. Данните са представени като средно ± стандартно отклонение. Анализът на данните беше извършен с помощта на еднопосочен анализ на дисперсията, последван от тест за най-малко значима разлика. Данните бяха анализирани с помощта на SPSS софтуер версия 19.0 (IBM SPSS, Armonk, NY, USA). П<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Резултати и дискусия

Скрининг на масла, повърхностно активни вещества и ко-повърхностно активни вещества за ME. PG(фенилетаноиден гликозид от цистанхе)е почти неразтворим в течен парафин и олеинова киселина, но се наблюдава умерена разтворимост в IPM (Таблица II). IPM повишава коефициента на дифузия в кожата и води до увеличаване на коефициента на проникване (17,18). В допълнение, IPM обикновено се избира за приготвяне на MEs поради неговите добре известни свойства за подобряване на проникването и биосъвместимост. Изборът на повърхностно активно вещество е от решаващо значение за успешната формулировка на MEs, тъй като допринася за намаляване на напрежението между повърхностите чрез образуване на филм на повърхността масло-вода (19). В настоящото проучване PG показва по-висока разтворимост в Cremophor-EL (40,193 mg/ml; Таблица II) в сравнение с Tween-80 (28,051 mg/ml; Таблица II). Поради това CremophorEL беше избран за използване в по-нататъшни проучвания поради неговия профил на разтворимост и ниското ниво на токсичност като нейонно повърхностноактивно вещество. Освен това неговият воден разтвор демонстрира добра разтворимост на PG. Най-високата разтворимост на PG сред коповърхностноактивните вещества се наблюдава в пропилей гликол (48,714 mg/ml; Таблица II). В допълнение, пропилей гликолът има способността да образува ME с IPM и CremophorEL. Взети заедно, IPM, CremophorEL и пропилей гликол бяха използвани съответно като маслена фаза, повърхностноактивно вещество и помощно повърхностноактивно вещество за формулирането на PG-заредени ME. Изграждане на псевдо-троични фазови диаграми. В настоящото изследване бяха конструирани фазови диаграми, за да се избере обхватът на концентрация на компонентите за микроемулсиите, а маркираните области показват ясния O/WMEрегион (фиг. 1). Тясна връзка между ефекта на хидратация на роговия слой и дермалната пермеация е докладвана по-рано (20), а термодинамичната активност на лекарствата в ME е значителна движеща сила зад освобождаването и проникването на лекарства в кожата (20,21 ). Термодинамичната активност на лекарства в ME с по-ниско съдържание на смес от повърхностно активни вещества беше доказано, че е важна движеща сила за освобождаването и проникването на лекарството в кожата (22, 23).

The decreased concentration of surfactant in dispersed systems may also increase the rate of drug release and its permeation in the skin (24,25). Thus, the water content ranged between 50 and 70%, while that of the surfactant and cosurfactant ranged between 20 and 45%. The microemulsion domain was determined by visual inspection for clarity and fluidity. The rest of the region in the phase diagrams represents turbid and conventional emulsions based on visual observation (Fig. 1). No liquid crystalline structure was observed using the cross polarizer. The area of the O/W ME region was expanded following the increase of the Km value (Fig. 1). These findings were consistent with previous studies, which demonstrated that a higher level of surfactant reduces interfacial tension of the colloidal solution more effectively, thereby improving the fluidity of the interface and increasing the entropy of the system (21,24). Thus, it is reasonable to speculate that the effect of CremophorEL on ME regions depends on the other ME components, especially the cosurfactant. The combination of short to medium carbon chain length alcohols, including propylene glycol, with single-chain surfactants, may lower interfacial tension due to increased fluidity at the interface. Additionally, medium carbon chain length alcohols may induce elevation of miscibility of the aqueous and oily phases due to the partitioning behavior between the two phases. Finally, in the presence of a Km ratio of 3:1, the ratio of the surfactant mixture to oil was 1:9 or 2:8. MEs prepared with a ratio of surfactant mixture to oil >2:8 бяха мътни и нестабилни (фиг. 2).

Окончателните състави на ME1-5 са изброени в Таблица I. Приготвяне и характеризиране на ME. Физическите свойства на ME1-5 са изброени в таблица III. Дисперсните системи са макроскопски идентични, хомогенни и прозрачни, без никакви утайки. Средните размери на капките на тези ME варират между 30.56 и 79.21 nm (фиг. 3; таблица III), със стойности на индекса на полидисперсност в диапазона между 0.187 и 0.321 (Таблица III). Това показва еднакъв ME с тясно разпределение на размера. В допълнение, размерът на капките се увеличава пропорционално на съдържанието на масло, но намалява със съдържанието на смес от повърхностноактивни вещества. Това явление може да се отдаде на разширяването на ME масленото ядро ​​и високата концентрация на повърхностноактивно вещество, което силно намалява междинното напрежение масло-вода, за да намали размера на капките. Освен това вискозитетът на ME беше повишен в резултат на повишено ниво на повърхностноактивно вещество и намалена вода. Стойностите на pH на всички ME попадат в подходящия диапазон от 5.0-7.5 (Таблица III) и така са съвместими с тези на кожните тъкани. По отношение на физическата стабилност, не се наблюдава разделяне на фазите, счупване или утаяване на лекарството в нито един от тестваните МЕ, което показва, че МЕ притежават задоволителна термодинамична стабилност срещу центрофугиране. Тестът за разтворимост на багрилото разкри, че водоразтворимото багрило (метилоранж) се разпределя равномерно в системата ME, което предполага, че образуваният ME е от тип O/W (данните не са показани). Микрографиите разкриват отделни единични ME5 капчици със сферичен контур (фиг. 4). Exvivo изследване на проникването на кожата. Профилите на проникване на всички тествани носители следват кинетика на освобождаване от нулев порядък (26, 27) и ME5 осигурява най-високия трансдермален поток на PG (86.795±0.23 µg/cm{{28 }} /h-1; Фиг. 5; Таблица III). В настоящото изследване бяха определени ефектите на съдържанието на масло и сместа от повърхностноактивни вещества върху проникването на PG в кожата. Резултатите показват, че повърхностно активните вещества подобряват проникването на кожата чрез увеличаване на течливостта на мембраната, разтварянето на лекарството и извличането на липиди от роговия слой. Степента на проникване на ME5 (86.795±0.23µg/cm-2 /h-1) е значително увеличена в сравнение със скоростите на проникване на ME1 (69.57±{ {48}}.78, P=0.0094), ME2 (44.326±0.84, P{{50}} .0052), ME3 (79,859±0,12, P=0.039) и ME4 (58,332±0,39 µg/cm-2 /h-1 , P=0.0063, Фиг. 5; Таблица III) Това е в съответствие с резултатите от предишно проучване, при което термодинамичната активност на ME лекарствения товар може да намалее с повишаването на нивата на повърхностно активното вещество (12,28 ). Вискозитетът на ME5 (30,43±0,12 mPa.s) е по-нисък в сравнение с другите ME1 (80,51±0,87 mPa.s, P=0.0076), ME2 (47,52±0,54 mPa.s, P{{88 }}.0089), ME3 (60,49±1,34 mPa.s, P=0.0094) и ME4 (43,27±0,21 mPa.s, P=0.0059).