Част 1: Вербаскозид защитава клетките на панкреаса срещу ER-стрес
Mar 05, 2022
Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com
Алесандра Гали 1, плюс , Паола Марчиани 1, плюс , Алгерта Марку 1, Силвия Гисланцони 1, Федерико Бертуци 2, Рафаела Роси 3, Алесия Ди Джанкамило 3, Микела Кастаня 1 и Карла Перего 1,*
Резюме:
Съществени епидемиологични доказателства сочат, че диета, богата на полифеноли, предпазва от развитие на диабет тип 2. Фенилетаноиден гликозидвербаскозид/актеозид, широко разпространено полифенолно растително съединение, има няколко биологични свойства, включително силно антиоксидантно, противовъзпалително и невропротективно действие. Целта на това изследване беше да се тестват възможните ефекти отвербаскозидвърху клетките на панкреаса, цел, която никога не е била тествана преди. Миши и човешки клетки се инкубират свербаскозид(0.8–16 uM) за до пет дни и комбинация от биохимични и образни техники бяха използвани за оценка на оцеляването и функционирането на клетките при нормални условия или условия, предизвикващи стрес на ендоплазмения ретикулум (ER). Открихме дозозависим защитен ефект навербаскозидсрещу оксидативен стрес в клонални и човешки клетки. Механистичните проучвания разкриха, че полифенолът предпазва клетките от дисфункции, медиирани от ER-стрес, модулирайки активирането на протеин киназа РНК-подобен ендоплазмен ретикулум киназа (PERK) клон на разгънатия протеинов отговор и насърчаване на митохондриалната динамика. В резултат на това в тези клетки бяха открити повишена жизнеспособност, митохондриална функция и съдържание на инсулин. Тези проучвания предоставят доказателства, чевербаскозидповишава способността на -клетките да се справят с ER-стрес, важен фактор за дисфункция и неуспех на -клетъчните клетки при диабетни състояния и поддържа терапевтичния потенциал на вербаскозид при диабет.
Ключови думи:
вербаскозид; полифеноли; клетки, произвеждащи инсулин; диабет; UPR; оксидативен стрес; ER-стрес; ПЕРК; противовъзпалително; митохондриите
1. Въведение
Диабетът е хронично заболяване, което засяга стотици милиони хора [1]. Различна етиология характеризира диабет тип 1 (T1D) и тип 2 (T2D), като и двата се характеризират с липса на инсулин [2]. Инсулинът регулира концентрацията на глюкоза в плазмата, като стимулира усвояването на глюкозата в мускулните и мастните клетки и модулира метаболизма на глюкозата в черния дроб. Наличността на хранителни вещества, хормоните и невронните входове регулират секрецията на инсулин от панкреаса и поддържат концентрациите на кръвната захар в рамките на физиологичен диапазон [3–5]. Следователно, клетъчната дисфункция води до диабет, характеризиращ се с хипергликемия на гладно.
T2D е прогресивно състояние, при което инсулиновата резистентност и неправилното функциониране на -клетките са свързани помежду си и последните доказателства повишиха интереса към критичната основна роля на -клетките за хипергликемичния статус [6,7]. При пациенти без диабет със затлъстяване - клетките компенсират инсулиновата резистентност с повишена секреция на хормона. Въпреки това, при някои субекти, когато състоянието им се влоши, инсулинемията спада и нивото на глюкозата се покачва до хипергликемия [8,9].
Глюкозата е най-важният модулатор на клетъчните функции. Стимулирането на глюкозата засяга регулирането на гените и експресията на протеини, участващи в много клетъчни функции като гликолиза, синтез и секреция на инсулин [10]. Индуцираната от глюкоза секреция на инсулин разчита на окислителния метаболизъм, за да се произведе аденозин трифосфат (ATP) и ниско ниво на реактивни кислородни видове (ROS) се произвежда физиологично. Въпреки това, -клетките не са много добре оборудвани с ензими за почистване и тази слабост ги прави много податливи на оксидативен стрес [11,12]. С нарастването на оксидативния стрес -клетъчното производство на инсулин намалява и -клетките произвеждат цитокини, които предизвикват увреждане на клетките чрез възпаление и апоптоза [13]. Интересното е, че въпреки че намалената клетъчна маса преди това е била приписвана на клетъчната смърт, последните проучвания предполагат основна роля на клетъчната дедиференциация [14,15]. Стана ясно, че няколко етапа водят до T2D. Метаболитните и оксидативни инсулти причиняват стрес на ендоплазмения ретикулум (ER), което води до намаляване на синтеза и секрецията на инсулин, възпалителни процеси следват освобождаването на цитокини и загуба на клетки може да настъпи чрез апоптоза и дедиференциация. Това знание е фундаментално, за да се разработят подходящи стратегии за лечение, тъй като оксидативният стрес и възпалението могат да бъдат противодействани, а пластичността на клетките на панкреаса позволява възможността да се върнат стволовите клетки в -клетки, както е доказано при мишки [16].
Напоследък уязвимостта на -клетките към оксидативен стрес успешно подтикна употребата на диетични антиоксиданти за предотвратяване на диабет [17]. Сред най-интересните антиоксидантни храни, зехтинът е известен със своите полезни свойства още от древните гърци. Зехтинът съдържа добро количество мононенаситени мастни киселини (MUFA) и няколко полифенола като тирозол, хидрокситирозол, олеуропеин и вербаскозид.
Вербаскозид, известен също като актеозид, е фенилетаноиден гликозид, извлечен от Olea europea, растения от вида Verbascum и 23 други семейства растения [18–20]. Може също да се получи от странични продукти от зехтин (обогатен е в отпадъчни води от мелница за маслини, получени от преработката на маслинови плодове) или да бъде произведен чрез подходи на метаболитно инженерство и синтетична биология [21].
Все още не са докладвани данни за бионаличността на вербаскозид при хора. Проучванията, проведени върху мишки, клетки SKBR3 и Caco-2 предполагат, че може да е възможно неметаболизираният вербаскозид да премине през чревната бариера, да циркулира в кръвната плазма и да упражнява антиоксидантни ефекти [20,22,23]. За разлика от повечето растителни полифеноли, вербаскозидът действа главно върху клетките чрез модулиране на генната транскрипция на различни ензими и регулаторни фактори, с антиоксидантни и противовъзпалителни ефекти [24–30].
Въпреки че са известни много полезни ефекти на вербаскозид за човешкото здраве, няма данни за ефекта му върху клетките на панкреаса. Тъй като оксидативният стрес и възпалението са в основата на патогенезата на T2D, ние проучихме дали лечението с вербаскозид може да подобри жизнеспособността на клетките и
функционира в условия, предизвикващи ER-стрес и ние характеризирахме молекулярните механизми на неговото действие. Нашите данни разкриват, че вербаскозидът предотвратява окислителния стрес и възпалението на клетките, като модулира активирането на разгънатия протеинов отговор и насърчава митохондриалната динамика, което води до повишена жизнеспособност на клетките и съдържание на инсулин.
2. Материали и методи
2.1. Клетъчни култури и материали
Миши tc3 клетки (любезно предоставени от проф. Hanahan—Катедра по биохимия и биофизика, Калифорнийски университет, Сан Франциско, Калифорния [31]) бяха култивирани в среда RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Италия), допълнен с 10 процента (v/v) инактивиран от топлина фетален телешки серум (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Италия), 1 процент (v/v) пеницилин-стрептомицин (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Италия) и 1 процент (v/v) L-глутамин (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Италия). Човешки острови на Лангерханс бяха изолирани в Милано (Niguarda Ca' Granda) от трупни мултиорганни донори съгласно процедурата, описана от Ricordi et al. [32]; те бяха култивирани в RPMI културална среда, съдържаща 5.5 mmol/L глюкоза, 10 процента топлинно инактивиран фетален говежди серум, 0.7 mM глутамин, 50 единици/mL пеницилин и 50 ug/mL стрептомицин (EuroClone, SpA, Pero MI, Италия). Използвани са четири различни препарата за островчета, чистотата на островчетата е 80 ± 10 процента. Изолирането на островчета и изследванията на островчетата бяха одобрени от Комитета по етика на болница Niguarda Ca' Granda в Милано (11.12.2009 г.). tc3 клетки бяха третирани с 0,8, 1,6 и 16 uM вербаскозид (Carbosynth, OV08034, Compton, UK), кафеена киселина и хидрокситирозол (любезен подарък от проф. Dell'Agli, Департамент по фармакологични и биомолекулярни науки, Universita degli Studi di Milano, Милано, Италия) в пълна RPMI среда за 5 дни, докато човешки островчета с 16 uM вербаскозид. Като контроли се използват клетки, третирани с метанол/етанол. За да се индуцира оксидативен стрес, клетките бяха третирани с H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 uM в пълна RPMI среда за 20 минути преди анализа, докато третирани с туникамицин 2 ug/mL (T7765, Sigma Aldrich ) в продължение на 7 часа се извършва, за да се предизвика ER стрес.
2.2. Откриване на клетъчна жизнеспособност чрез МТТ тест
Клетките се поставят в 96 многоямкови плаки и пет дни след третиране с вербаскозид те се инкубират с 0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-диметилтиазол{{7} }yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) в продължение на 4 часа във влажна атмосфера, съдържаща 5 процента CO2 при 37 oC. След инкубиране клетките бяха внимателно ресуспендирани в 100 uL DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Италия) и абсорбцията при 540 nm беше открита с четец на микроплаки (Benchmark, четец на микроплаки, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, САЩ) [33]. Експериментите бяха проведени в три екземпляра и данните бяха изразени като кратно увеличение спрямо контролните проби.
2.3. Откриване на клетъчна смърт чрез поточна цитометрия
Пет дни след инкубиране с 16 uM вербаскозид, -клетките се отделят чрез 7 минути инкубиране с трипсин/EDTA, събират се и се центрофугират; утайката се ресуспендира внимателно във фосфатно-буферен физиологичен разтвор с ниско съдържание на соли. Клетките бяха оцветени с MuseTM реагент за броене и жизнеспособност (Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA), следвайки протокола на производителя и анализирани чрез поточна цитометрия. Експериментите бяха проведени в три екземпляра и данните бяха изразени като процент на мъртвите клетки спрямо общия брой.
2.4. Генериране на ROS
Вътреклетъчните ROS бяха оценени с DCFDA (2/,7/-дихлорофлуоресцеин диацетат) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, USA), мембранна пропусклива сонда, която става флуоресцентна, когато се свърже с ROS [34]. tc3 клетките бяха предварително заредени с 15 uM DCFDA в буфер на Krebs-Ringer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 и 2 mM CaCl2)
допълнен с 11 mM глюкоза за 1 час при 37 oC. Съдържанието на ROS се открива за 30 минути както в базални, така и в условия на стрес с четец на микроплаки (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Швейцария). Средните стойности и стандартните отклонения се основават на три независими експеримента.
2.5. Western blotting
tc3 клетки бяха събрани и разтворени в RIPA буфер (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl рН 7.6, 1 mM EDTA, 1% TERGITOLw NP40, 0.5% дезоксихолат), добавен с апротинин (Sigma Aldrich, A4529, St. Louis, MO, USA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) и инхибитори на Roche (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) за 40 минути при 4 oC. Концентрацията на протеин се определя чрез анализ на Bradford [35] с помощта на реагент на Bradford (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, USA), 30 ug протеини се разделят с 10 процента SDS-PAGE и се прехвърлят върху нитроцелулозни мембрани (Millipore, Burlington Масачузетс, САЩ). Първичните антитела се прилагат за 2 часа в блокиращ буфер с 5 процента обезмаслено мляко или 5 процента BSA разтвори; бяха използвани следните първични антитела: миши анти- -актин (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, САЩ), миши анти-акролеин (Abcam, ab48501, Кеймбридж, Обединеното кралство), миши анти-BIP (любезен подарък от проф. Borgese Nica, Institute of Neuroscience, CNR, Милано, Италия), заешки анти-HNE (-diagnostic International Inc., HNE11S, Сан Антонио, Тексас, САЩ), миши анти-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, САЩ), заешки анти-фосфо-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Данвърс, Масачузетс, САЩ), миши анти-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, САЩ), заешки анти-фосфо-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, САЩ), заешки анти-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, САЩ), овчи анти-SOD1 (Merck, KGaA, Дармщат, Германия), заешки анти-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, САЩ), заешки анти-eIF2 (Cell Signaling Technology Inc., 5324, Данвърс, Масачузетс, САЩ) и заешки анти-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Данвърс, Масачузетс, САЩ). Вторичните антитела, конюгирани с HRP (Dako Agilent, Санта Клара, Калифорния, САЩ) се използват при разреждане 1:5000. Протеините бяха открити с помощта на системата за откриване ECL (Euro-Clone SpA, Pero MI, Италия) с помощта на Odyssey Fc Image system (LI-COR Biotechnology GmbH, Бад Хомбург, Германия) и плътността на лентата беше количествено определена от софтуера Image Studiow Lite (LI -COR Biosciences, Lincoln, NE, САЩ) [36]. Експериментите бяха проведени в три екземпляра и данните бяха изразени като кратно увеличение спрямо контролните проби.
2.6. Потенциал на митохондриалната мембрана
tc3 клетки и човешки островчета на Лангерханс се инкубират със 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Милано, Италия) или 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Campoverde Srl, Милано, Италия) за 30 минути при 37 oC; Интензитетите на флуоресценция бяха открити с четеца на микроплаки TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em за MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em за MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Швейцария). Клетките се инкубират с 500 uM H2O2 за 20 минути и интензитетът на флуоресценция се открива, както е описано по-горе. Средните стойности и стандартните отклонения се основават на три различни експеримента.
2.7. Митохондриална морфология и динамика
tc3 клетките бяха предварително заредени със 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Милано, Италия) в 11 mM глюкозен буфер на Krebs-Ringer при 37 oC за 30 минути. Пробите бяха поставени в камера за изображения и произволни полета бяха изобразени с помощта на родановия филтър на микроскопа Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Германия). За да се оцени митохондриалната морфология, следните параметри бяха анализирани с помощта на софтуера за анализатор на частици ImageJ: площ (um2), кръглост (4mArea2/Perimeter2) и максимален диаметър на Feret (um) [37].
За експерименти с изтичане на времето, едноклетъчно изобразяване се извършва при 1 кадър в секунда за 30 s при условия на контрол или оксидативен стрес. За измерване на митохондриалното кумулативно разстояние (um2), изображенията първо бяха коригирани за избелване на снимки, след това видеоклиповете бяха анализирани с помощта на съществуващ Image-Pro Plus Plug-in (проследяване на обект) (Media Cybernetics, Rockville, MD, САЩ). До дванадесет
клетките бяха изобразени в три независими експеримента и данните бяха представени като средни стойности и стандартни отклонения.
2.8. Секреция на инсулин
Човешки изолирани острови на Лангерханс се посяват в 96-плака с ямки при плътност от 20 островчета на ямка и след 5 дни лечение съдържанието и секрецията на инсулин се измерват при базална (3,3 mM глюкоза) и стимулирана (16,7 mM глюкоза) ) условия чрез имуноанализ ELISA (Mercodia, 10-1113-01, Упсала, Швеция).
2.9. Статистически анализи
Всички статистически анализи бяха извършени с GraphPad Prism 8.0 върху независими биологични реплики. Средните стойности между две групи бяха оценени чрез използване на двустранен t-тест на Student и p-стойност < 0.05="" беше="" взета="" като="" доказателство="" за="" статистическа="" значимост.="" средните="" стойности="" между="" три="" или="" повече="" групи="" бяха="" сравнени="" чрез="" анализ="" на="" дисперсията="" (anova),="" последван="" от="" многократен="" post-hoc="" (tukey)="" сравнителен="" тест.="" използваният="" статистически="" тест,="" точните="" p="" стойности="" и="" броят="" на="" репликите="" (n)="" са="" посочени="" в="" отделните="" легенди="" на="" фигурите.="" лентите="" за="" грешки="" на="" фигурите="" показват="" средната="" стойност="" ±="" sd="" или="" средната="" стойност="" ±="" se,="" както="" е="">
3. Резултати
3.1. Вербаскозидът подобрява жизнеспособността на клетките
Тъй като нямаше данни за ефекта на вербаскозид върху клетките, ние проведохме МТТ тест за оценка на жизнеспособността на клетките и както е показано на Фигура 1А, се наблюдава положителна доза-зависима тенденция. Следователно, за по-нататъшни изследвания, ние избрахме концентрация от 16 uM, която статистически беше доказана ефективна за подобряване на жизнеспособността на клетките. Чрез поточна цитометрия изследвахме въздействието на петдневна инкубация на вербаскозид върху преживяемостта на клетките при основни условия и след 2{{21} } min предварителна обработка с 500 uM H2O2. В базалното състояние вербаскозидът не повлиява клетъчното оцеляване, което предполага, че повишената жизнеспособност на клетките, наблюдавана при МТТ анализа, може да се дължи на подобрена митохондриална активност. Докато след експозиция на H2O2 предварителната обработка с 16 uM вербаскозид значително намалява клетъчната смърт, предизвикана от оксидативен стрес (Фигура 1B,C). Вербаскозидът е сложна молекула, която може да бъде модифицирана чрез хидролизиращи ензими [18]. За да се провери дали метаболитите на вербаскозид могат да бъдат отговорни за наблюдавания защитен ефект, tc3 клетките бяха третирани с хидрокситирозол и кафеени киселини (0,8 и 16 uM) в продължение на 5 дни. И двата метаболита не повишават клетъчната жизнеспособност, напротив, цитотоксичен ефект, по-уместен след излагане на H2O2, беше открит за концентрация от 16 uM (Фигура S1). Това откритие доказва, че вербаскозидът, а не неговите метаболити, упражнява защитен ефект при третиране с H2O2.
3.2. Вербаскозидът модулира редокс хомеостазата и упражнява противовъзпалителен ефект в клетките
Първо потвърдихме в tc3 клетки противовъзпалителните и антиоксидантни ефекти на вербаскозид, наблюдавани в други типове клетки [24,29,34]. Активността на вербаскозид за отстраняване на ROS беше оценена с tc3 клетки, белязани с ROS специфична DCFDA (2/,7/-дихлорофлуоресцеин диацетат) клетъчна пропусклива сонда. Както е показано на Фигура 2А, значително намаляване на съдържанието на ROS е открито след предварително третиране с вербаскозид, както при условия на базален, така и при оксидативен стрес.
Western blot анализите разкриват значително намаляване на експресията на маркерите за оксидативен стрес акролеин и 4-хидроксиноненал (HNE) в клетки, третирани с вербаскозид. В допълнение, открихме повишаване на експресията на супероксид дисмутаза (SOD1), което предполага, че вербаскозидът проявява своята антиоксидантна активност вероятно с два различни механизма, директно като ROS акцептор и индиректно чрез индуциране на експресията на антиоксидантни ензими (Фигура 2B,C).
Противовъзпалителният ефект на вербаскозид върху β-клетките беше оценен чрез оценка на активирането на NFKB пътя, най-важният провъзпалителен път в тези клетки [38]. Чрез Western blot анализ открихме намалена експресия на инхибитор на ядрен фактор капа B (IKB) и нуклеарен фактор капа-лека верига-енхансер (NFKB) и значително намаляване на NFKB фосфорилирането в предварително третирани клетки, подкрепяйки хипотезата за ефикасността на вербаскозид за намаляване на клетъчното възпаление (Фигура 2D,E).
3.3. Вербаскозидът модулира отговора на разгънатия протеин на -клетките
След това анализирахме в дълбочина молекулярния механизъм, чрез който вербаскозидът упражнява антиоксидантни и противовъзпалителни роли, фокусирайки се върху ендоплазмения ретикулум, който се очертава като ключов сензор за метаболитни и стресови сигнали в клетките. При условия на стрес, органелата предизвиква хомеостатичен отговор, известен като разгънат протеинов отговор (UPR), насочен към възстановяване на ER функцията; обаче прекомерното активиране на този път води до апоптоза [39,40].
Маркерите за повишен ER стрес са регулирането нагоре на шапероновите протеини и активирането на UPR отговора. Western blotting анализ на клетки, третирани с вербаскозид, разкри понижени нива на двата шаперонина протеин на топлинен шок 70 (HSP70) и свързващ имуноглобулинов протеин (BIP) (Фигура 3A, B). Освен това, беше установено значително намаляване на експресията на протеин киназа РНК-подобна ER киназа (PERK) и намалено фосфорилиране на нейния низходящ ефектор, еукариотния фактор за иницииране на транслацията 2 (eIF2).
