Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Моля, щракнете тук за част 1

Моля, щракнете тук за част 3

Cistanche може да подобри паметта

Като се имат предвид тези констатации, ние след това проучихме дали повишена хипокампална експресия на miR-466f-3p при мишки при пространствено обучение ипаметобразуването също повлиява морфологията на невроните in vivo. Показателно е, че открихме, че средната гръбначна плътност на хипокампалните неврони на GLN мишки е по-висока от тази на PLN мишки, както се разкрива чрез импрегниране на Голджи на пирамидалната

Фигура 3. Ефекти от промяна на нивата на експресия на miR-466f-3p на хипокампа върху производителността на MWM на мишката

(A) Експериментална времева линия на задачата MWM, анализ на експресията или електрофизиологично измерване на мозъка на мишката след инжектиране на лентивирус.

(B) Леви панели: експресия на dsRed в миши хипокампус. Представителни IF изображения с ниско и голямо увеличение на хипокампус от мишки, заразени с рекомбинантни лентивируси, експресиращи dsRed-само като контрола (лява колона с изображения) или miR-466f-3p плюс dsRed (вдясно) колона с изображения). Оградените области на горните две изображения са увеличени и показани по-долу. Скали, 100 мм. Пунктираните линии показват границите на ДГ. Ядрата се оцветяват с DAPI. GCL, гранулиран клетъчен слой; ML, молекулен слой. Дясна хистограма, относителни нива на експресия на miR-466f-3p в миши хипокампус, инфектиран с лентивирус, експресиращ контрола или miR-466f-3p, както е анализирано чрез RT-qPCR ( n=16 на група).

(C) MWM характеристики на мишки, заразени с различни рекомбинантни лентивируси, опаковани с помощта на пет различни плазмида, експресиращи само dsRed, miR-466f-3p, mut-miR-466f{ {5}}p и miR/SCR-гъби, съответно, в техния хипокампус (n=13, съответно 26, 16, 19 и 11 на група). Ляв панел: избягвайте латентността по време на обучението. Десен панел: индивидуална латентност на бягство на 6-та сесия.

Данните, показани в (B), са представени като средно ± SD, а данните, показани в (C), са представени като средно ± SEM. Статистическата значимост беше оценена чрез несдвоен t тест (B), двупосочен ANOVA с post hoc сравнение на Bonferroni (C, ляв панел) или one-ANOVA с post hoc тест на Tukey (C, десен панел). Статистически разлики: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0.01="" и="" ****p="">< 0,0001;="" *mir-466f-3p="" спрямо="" други;="" #mir-гъба="" срещу="">

неврони в GLN и PLN миши хипокампус (Фигура S3). Тези констатации показват, че регулирането на хипокампалния miR-466f-3p насърчава невритния растеж и образуването на дендритни шипове, което е подобно на индукцията на гръбначна плътност, наблюдавана в хипокампуса на GLN мишки по отношение на PLN мишки.

miR-466f-3p положително модулира пространственото обучение на мишката ипаметпроизводителност, както и синаптична пластичност

Да се ​​изследва дали miR-466f-3p регулира положително пространственото обучение на мишката ипаметобразуване, ние използвахме подход на рекомбинантна лентивирусна инфекция за свръхекспресия на miPHK в хипокампуса на мишката. Мишките бяха анализирани 7 дни след инжектирането на лентивирус в DG (Фигура 3А). Представителните изображения на нивата на експресия на тазобедрената става на miR-466f-3p наистина бяха повишени в групата със свръхекспресия на miR-466f-3p в сравнение с контролната група (дясна хистограма на фигура 3B). Открихме, че мишки с хипокампална свръхекспресия на miR-466f- 3p и подложени на задачата MWM показват латентност на бягство от 88 ± 5 s в 1-вата сесия и 19 ± 1 s в 6-тата сесия (червено точкова линия, Фигура 3C), които са по-добри, отколкото за векторни контролни мишки (черна линия) или мутантни контролни мишки (червена кръгла линия) и подобни на латентностите на бягство на GLN мишки, описани на Фигура 1A. Успоредно с това изследвахме ефекта на miR-466f-3p загуба на функция върху пространственото обучение ипаметчрез инхибиране на miR-466f-3p с помощта на miR-гъба. Трябва да се отбележи, че ефективността на MWM на мишки, при които miR-466f-3p на хипокампа е уловен от miR-гъбата, е подобна на тази на PLN мишки, т.е. те не са се научили да намират платформата дори чрез последната сесия (плътна зелена квадратна линия,

Фигура 3C). Освен това, мишките, инжектирани с лентивирус, изглежда не са нарушили хомеостатичната пластичност, тъй като някои мишки във всяка група са научили или поне са били в процес на обучение по време на последната сесия (Фигура 3C, дясна хистограма).

Като се има предвид, че свръхекспресията на miR-466f-3p в хипокампуса на мишка подобрява тяхното обучение ипаметспособност, ние анализирахме сравнителната електрофизиология на култивирани неврони на хипокампа, експресиращи различни нива на miR-466f-3p. Миниатюрният възбуждащ постсинаптичен ток (mEPSC) от DIV14 хипокампални неврони, свръхекспресиращи miR-466f-3p или mut-miR-466f-3p, miR-гъба или контрола, беше записан с помощта на пач скоби за цели клетки. Докато нямаше значителни разлики в амплитудата на mEPSC, повишаването на Tau или затихването на Tau сред четирите комплекта проби, честотата на mEPSC на неврони, свръхекспресиращи miR-466f-3p, беше значително по-висока в сравнение с други групи (Фигура 4А), което показва, че постсинаптичните глутаминергични рецептори са по-силно активирани при miR-466f- 3p свръхекспресия.

След това измерихме дългосрочното потенциране (LTP), за да определим директно ролята на miR-466f-3p в синаптичната пластичност in vivo. Инжектирахме хипокампуса на мишки с рекомбинантен лентивирус, както е описано на Фигура 3, и след това индуцирахме LTP в срезове на хипокампуса чрез тетанична стимулация (три серии високочестотна стимулация [3xHFS]) на колатералния път на Шафер. Ние открихме, че нашият протокол индуцира LTP във всички групи, както се вижда от постоянното увеличаване на постсинаптичните потенциали на възбуждане на полето (fEPSPs) в региона на cornu ammonis 1 (CA1) (Фигура 4B, ляв панел). LTP е по-силен в miR-466f-3p-свръхекспресиращи срезове (188 процента ± 2 процента от изходното ниво на 40-50 минути след стимулация, средно ± SEM) в сравнение с мутант (169 процента ± 1 процент от изходното ниво), SCR-гъба (173 процента ± 3 процента от изходното ниво) и инфектирани с контролен вирус срезове (159 процента ± 2 процента от изходното ниво), като инхибиране на miR-466f-3p от miR-гъбата намалява LTP (128 процента ± 1 процента от изходната линия) спрямо контролите (Фигура 4B, десен панел). Измерихме и LTP на групите GLN и PLN след обучение. Съответните данни също разкриват значителни разлики в наклона на fEPSP в региона CA1 между групите GLN и PLN (Фигура 4C). По този начин, повишеното ниво на miR-466f-3p подобрява LTP и синаптичната пластичност, което от своя страна може да насърчи ученето ипаметспособността на мишките. Заедно данните, представени на фигури 2, 3 и 4, показват, че miR-466f-3p играе критична положителна роля в пространственото обучение ипаметобразуване, вероятно чрез засилване на образуването на гръбначен стълб, LTP и силата на синаптичната пластичност.

Mef2a иРНК е регулаторна цел на miR-466f-3p

Проведохме биоинформатичен анализ, за ​​да идентифицираме потенциални целеви иРНК, регулирани чрез свързване на miR-466f-3p към техните 30 UTR. Сред кандидатите, които идентифицирахме, беше Mef2a иРНК, кодираща MEF2A. Интересното е, че преди това беше установено, че експресията на MEF2A е понижена след MWM обучение и свръхекспресията на този фактор оказва отрицателен ефект върху представянето на мишки (Cole et al., 2012). Следователно, ние използвахме луциферазен репортерен анализ, за ​​да проверим дали miR-466f-3p регулира транслацията на Mef2a mRNA чрез свързване към неговите 30 UTR. Вмъкнахме див тип или мутантни Mef2a 30 UTR последователности надолу по веригата на управлявана от SV40-промотор луциферазна сДНК (Luc), което доведе до репортерния плазмид psiCHECK2-MEF2A 30 UTR или psiCHECK2- mut-MEF2A 30 UTR (Фигура 5А). Както е показано в лявата хистограма на Фигура 5В, ко-експресията на miR-466f-3p отслабва експресията на луцифераза, насочена от Mef2a 30 UTR. Този ефект изглежда зависи от взаимодействието между miR-466f-3p и Mef2a 30 UTR след мутацията или на предвиденото място на свързване на miR-466f-3p на Mef2a 30 UTR (50-UGU- GUAU-30) или началния регион на miR-466f-3p (50-AUACACA-30) разпознаването на Mef2a 30 UTR отмени инхибиторния ефект на miR-466f-3p върху луциферазната активност (Фигура 5В, средна хистограма). Освен това, ко-експресията на miR-гъбата, но не и CR гъбата, също елиминира репресивния ефект на miR-466f-3p върху луциферазната активност (Фигура 5B, дясна хистограма). Трябва да се отбележи, че нито свръхекспресията на miR-466f-3p, нито miR-гъбата са имали някакъв ефект върху нивата на Mef2a mRNA в първичните хипокампални неврони (Фигура 5C), но те намаляват или увеличават, съответно, ниво на протеин MEF2A (Фигура 5D). Ние също така открихме, че свръхекспресията на miR-466f-3p или miR-гъба, съответно, регулира надолу или повишава нивото на иРНК на регулиран с активност цитоскелетно свързан протеин (Arc) в първичните неврони на хипокампа (Фигура 5C) , което беше известна цел надолу по веригата, положително регулирана от MEF2A (Flavell et al., 2006)

Ние също извършихме флуоресцентна in situ хибридизация (FISH), за да открием miR-466f-3p и го комбинирахме с IF маркиране на MEF2A в DIV14 първични хипокампални неврони без или с лечение с форсколин. Известно е, че форсколинът индуцира химически LTP и активира аденилил циклазата, като по този начин повишава вътреклетъчните нива на cAMP. Наблюдавахме ядрена колокализация на MEF2A с miR-466f- 3p, както е илюстрирано от представителните изображения на Фигура 5E. След стимулация с форсколин обаче сигналът miR-466f-3p се увеличава както в сома, така и в дендритите, докато сигналът MEF2A в

ядрото намалява, както се вижда от реципрочните промени на интензитетите на сигналите MEF2A и Fast Red, съответно, на отделните невронни клетки (Фигура 5E). В обобщение, данните на Фигури 5A–5E показват, че miR-466f-3p негативно регулира експресията на MEF2A протеин чрез свързване към 30 UTR на Mef2a mRNA и следователно потискане на транслацията му.

В съответствие с описаните по-горе резултати, ние открихме, че хипокампалните нива на MEF2A протеин се регулират надолу при GLN мишки след MWM обучение, но не и при PLN мишки (Фигура 5F). Освен това, относителните нива на MEF2A в отделни GLN мишки (точки) и PLN мишки (квадрати) са обратно пропорционални на нивата на miR-466f-3p (R=0.60, Фигура 5G). По този начин, разнородни модели на пространствено обучение ипаметспособността се модулират чрез стохастични увеличения на хипокампалния miR- 466f-3p в отделни мишки и последващи понижения на MEF2A при стимулиране на невронната активност.

Стохастично активиране на хипокампалния CREB и последваща транскрипционна регулация на клъстера miR- 466-669 по време на MWM обучение

Изследвахме механизмите, чрез които miR-466f-3p в хипокампуса на мишката може да бъде стохастично регулиран нагоре от задачата MWM. Има три miRNA прекурсора, кодиращи miR-466f-3p, всички от които принадлежат към специфичния за гризачи miR-466-669 клъстер, разположен в интрон 10 на неговия ген гостоприемник, mSfmbt2 (Inoue et al ., 2017) (Фигура 6A). Интересното е, че за разлика от miR-466f-3p, няма значителна разлика в нивата на експресия на mSfmbt2 между GLN и PLN групите (Фигура 6B), което предполага, че miR-466-669 клъстерът може да кодира отделен транскрипт вместо да бъде част от първичния препис на mSfmbt2. Съответно, ние проектирахме няколко комплекта праймери, за да идентифицираме предполагаемия първичен транскрипт на miR-466-669 клъстер чрез RT-qPCR. Както е изобразено на фигура 6A, дълъг PCR фрагмент (плюс 282 до 2381), заедно със серия от припокриващи се qPCR ленти, а именно A (плюс 282 до 115), B (131 до 406), C (388 до 686), D (662 до 1 028), E (1 004 до 1 299), F (1 242 до 1 629), G (1 605 до 2 029) и H (2 005 до 2 381), могат да бъдат открити в миши хипокампус, но не и част I (2 306 до 2 776 ) (данните не са показани). Тези данни потвърждават, че клъстерът miR-466-669 е кодирал дълъг транскрипт близо до приблизително 2388 bp преди първия прекурсор на miRNA (т.е. pre-mir-466m, означен плюс 1 на фигура 6A). Забележително е, че подобно на това, което открихме за miR-466f-3p, средното ниво на този транскрипт в хипокампуса на GLN мишки е по-високо, отколкото при PLN мишки (Фигура 6C). По този начин подобреното обучение ипаметспособността на GLN мишки се дължи на транскрипционното активиране на miR-466-669 клъстера.

Активирането на ядрен CREB чрез фосфорилиране по време на MWM задачи или в други форми на обучение е критична стъпка за превръщането на краткосрочното в дългосрочнопамет(Lisman et al., 2018; Rogerson et al., 2014). Следователно, ние проучихме дали различните нива на miR-466f-3p сред отделните мишки, които са преминали задачата MWM, могат да бъдат свързани със състоянието на активиране на CREB. За да проучим тази идея, първо изследвахме нивата на фосфорилиране на хипокампалния CREB в отделни мишки. Както е показано на Фигура 6D, активирането на CREB (чрез фосфорилиране при остатък S-133) се засилва при GLN мишки спрямо PLN и HC мишки. Ние също така потвърдихме, че miR-466f-3p наистина е ко-експресиран с pCREB в неврони чрез извършване на miRNA ISH, комбинирано с IF оцветяване на pCREB и MAP2 в първични неврони на хипокампа (Фигура S2A). Освен това нивата на първичния транскрипт на miR- 466-669 клъстер са положително корелирани с pCREB при GLN мишки (R=0.52), докато има отрицателна корелация с pCREB при PLN мишки (R=0 .71) (Фигура 6E). Проверихме за корелация между нивата на друг активен фактор, фосфо-екстрацелуларен сигнал-регулирана киназа (pERK), и първичните нива на транскрипт на клъстера miR-466-669. Ние открихме, че и двата вида MWM-обучени мишки представят положителни корелации между miR-466-669 клъстерен сигнал и pERK (R=0.59 и 0.48, съответно; Фигура S4A), и няма разлика в pERK/ tERK експресия между тези две групи (Фигура S4B). За допълнително изясняване на въздействието на активирането на CREB върху транскрипционната регулация на miR-466-669клъстера и, следователно,

индукция на miR-466f-3p, ние използвахме специфичен CREBinhibitor,666- 15 (Xie et al., 2015), в комбинация с лечение с форсколин на DIV14 първични хипокампални неврони. Известно е, че форсколинът активира CREB фосфорилирането (Malhotra et al., 2015). Установихме, че предварителното третиране на първични хипокампални неврони с 666-15 блокира индуцираното от форсколин CREB активиране (Фигура 6F) и намалява нивата на miR-466f-3p и miR-466-669 клъстер препис (Фигури 6G и 6H). Едновременно с това нивата на mRNA на известните pCREB целеви гени nurr1 и homer1a (Bridi et al., 2017; Jensen et al., 2017) също бяха намалени при 666-15 лечение (Фигура 6H). Взети заедно, Фигура 6 показва, че стохастичното активиране на CREB в хипокампуса на субпопулация от инбредни мишки, подложени на MWM задача, индуцира транскрипция на miR-466-669 клъстера и, следователно, индукция на miR-466f{{23 }}p, като по този начин подобрява тяхното пространствено обучение ипаметспособност за по-добро изпълнение на задачата.

ДИСКУСИЯ

Ние проучихме възможната роля на miRNAs в модулирането на различната способност на пространственото обучение ипаметсред инбредни C57BL/6J мишки. Предполагаме, че стохастичното активиране на CREB и последващото регулиране нагоре на хипокампалния miR-466f-3p се дължи на по-доброто пространствено обучение ипаметспособност на подгрупа от нашите тестови мишки, вероятно поради miR-466f-3p, медииращо транслационното инхибиране на Mef2a иРНК, която кодирапаметотрицателен регулатор MEF2A. Нашите констатации предоставят сценарий, демонстриращ функционалната и еволюционна роля на специфична miPHK в регулирането на познанието чрез стохастична индукция на оста CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A от стимули от околната среда.

Задачата MWM е широко използвана за изследване на различните възможности за пространствено обучение ипаметза гризачи. При нормални условия гризачите използват дистални знаци, за да се ориентират, което им позволява да научат и запомнят местоположението на скритата платформа в задачата. Повечето от нашите тестови инбредни мишки C57BL/6J (62 процента) показаха нормален модел на латентност на бягство, намирайки платформата в рамките на 30 s от сесии 3rd-6th (Фигура 1A, GLN). За разлика от това, група мишки (38 процента) не са научили задачата дори до 6-та сесия (PLN). За отбелязване е, че ние също подложихме мишките на два други теста за разпознаване. Първият беше тестът за разпознаване на нов обект (NOR), който е единичен опит, базиран на вродено изследване без подсилване или стрес за мотивиране на поведението (Leger et al., 2013). Корелацията между задачите NOR и MWM по отношение на представянето на мишката е лоша (R {{1{{20}}}.13), което е подобно на корелацията между изпълнението на NOR и нивата на експресия на хипокампа на miR-466f-3p (R=0.01; данните не са показани). Тестът NOR също не разкрива разлики в индекса на дискриминация между групите MWM GLN и PLN (0,36 ± 0,25 спрямо 0,29 ± 0,18; Фигура S1B). Другото пространствено обучение ипамет-зависимата задача, която приложихме, е лабиринтът на Барнс (BM), който е подобен на MWM. Базира се на предположението, че гризачите, поставени в неблагоприятна среда, трябва да научат и запомнят местоположението на кутията за бягство, разположена под повърхността на платформата. Както е показано на Фигура S1C, ние открихме, че представянето на мишка в изпитанията с BM сонда също е в положителна корелация с нивата на експресия на хипокампа на miR-466f-3p. По този начин индукцията на оста CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A в хипокампуса по време на обучение ипаметформирането зависи от пространствения контекст.