Част 2:Анти-фиброзно действие На 6-Бромо-индирубин-3 ′ -оксим (6-BIO) Чрез регулиране на активатор протеин-1 (AP-1) и специфичност протеин-1 (SP-1) Транскрипция Фактори в бъбречните клетки

За част 1 щракнете върхуТук.

3.3. 6-BIO атенюира фиброзни маркери и свързани с фиброзата сигнални пътища в проксималната тубула (HK-2) и интерстициалните фибробласти (NRK49F) клетки

След това потвърдихме ефекта на 6-BIO върху проксималните тръбни клетки и интерстициалните фибробластни клетки. Наблюдавахме концентрация- и зависима от времето намаляване на GSK3β mRNA експресията от 6-BIO в HK-2 и NRK49F клетки (Фиг. S2A и B), и изразяването на протеини, свързани с ECM и EMT, участващи вбъбрекклеткаФиброзасъщо е намалена (фиг. S2E). Освен това, засилено изразяване на GSK3β, при TGFβ експозиция на тези клетки, също намалява с 6-BIO лечение (Фиг. S2C и D). Фиг. 3 показва протеин експресия набъбрекФиброзамаркери в HK-2 и NRK49F клетки, лекувани с TGFβ. Както е показано на фиг. 3А, изразяването на PAI-1 и CTGF протеини се увеличи значително в отговор на лечението с 5 и 10 ng / mL TGFβ в HK-2 и NRK49F клетки, съответно. Въпреки това, техният израз намалява забележително след лечение с 6-BIO (фиг. 3B).СМАДи MAPK сигнални пътища са били upregulated чрез TGFβ лечение, което е обърнато от 6-BIO лечението (Фиг. 4). След това проучихме изразяването на AP-1 и SP-1 фактори на транскрипцията, участващи в TGFβ-медиирана сигнализация в HK-2 и NRK49F клетки. Фиг. 4D показва, че TGFβ−медиираното увеличение на P-C-JUN и P-C-FOS е намалено в отговор на лечението с 6-BIO и JNK инхибитор SP600125 и при доминиращо-отрицателна C-JUN трансфекция. Фиг. 4E показва промяната в протеиновата интензивност спрямо контрола. Освен това, TGFβ-медиирани увеличение на SP-1 ниво е значително атенюирани в отговор на лечение с 6-BIO и SP-1 siRNA (фиг. 4F). Фиг. 4G показва промяната в протеиновата интензивност спрямо контрола. Тези резултати предполагат, че TGFβ/СМАДи MAPK сигнализация, както и транскрипционни фактори, AP-1, и SP-1, са регулирани от 6-BIO.

3.4. 6-BIO атенюати ядрена експресия на P-C-JUN, P-C-FOS, и SP-1 протеини в проксимални тръбни и интерстициални фибробласти клетки

Фиг. 5А и Б показват локализацията на PAI-1 и CTGF с P-C-JUN, P-C-FOS, и SP-1. Червено оцветяване на P-C-JUN, P-C-FOS, и SP-1 показва тяхната свръхекспресия в ядрото след лечение с TGFβ; аналогично, зеленото оцветяване на PAI-1 и CTGF показва тяхното свръхизразяване в цитозола. Въпреки това нивата на изразяване на P-C-JUN, P-C-FOS, и SP-1 са намалени с лечението с 6-BIO. Тези резултати предполагат, че 6-BIO пряко засяга AP-1 и SP-1, факторите на транскриптиране, регулиращи PAI-1 и CTGF израз.

3.5. 6-BIO атенюати PAI-1, CTGF, AP-1, и SP-1 организатор дейност в проксимални тръбни и интерстициални фибробласти клетки

След това проучихме дали 6-BIO инхибира дейностите на организатора на PAI-1, CTGF, AP-1, и SP-1 гени. Промоторската активност на PAI-1 и CTGF се увеличава в отговор на TGFβ, но е намалена с 6-BIO лечението (фиг. 6А и В). Освен това, намалението е забележително, когато клетките са лекувани с 6-BIO самостоятелно, отколкото в присъствието на TGFβ. AP-1 и SP-1 се свързват с организаторите на PAI-1 и CTGF. Фиг. 6C и 6D показват дейността на организатора на AP-1 и SP-1. AP-1 и SP-1 луцифераза активност е увеличена чрез TGFβ лечение и намалява с 6-BIO по зависим от дозата начин. Фиг. 6Е показва израза на транскрипционния фактор в екстрактите от ядрен протеин. Така потвърдихме, че ядреният израз на P-C-JUN, P-C-FOS, и SP-1 се е увеличил в отговор на лечението с TGFβ и е бил потиснат от 6-BIO лечението. Фиг. 6F показва промяната в протеиновата интензивност спрямо контрола. В допълнение, нашите резултати предполагат, че 6-BIO действа на транскрипционния фактор обвързващ сайт на организатора, за да отслаби свързването на AP-1 и SP-1. Извършихме in vitro промотор обвързващ assay в присъствието на 6-BIO, за да потвърдим същото. Свързването на ядрените протеини и P-C-JUN, P-C-FOS, и SP-1 беше отслабено от добавянето на 6-BIO по зависим от концентрацията начин (допълнителна фиг. 3). Тези резултати показват, че 6-BIO инхибира PAI-1 и CTGF промоутър дейности, както и AP-1 и SP-1 функции; по този начин тя може да има терапевтичен потенциал прибъбрекФиброза.

4. Дискусия

Използване на плъх модела на UUO и TGFβ-лекуванибъбрекпроксимални тубули, получени и интерстициални фибробластни клетъчни линии, демонстрирахме, че 6-BIO лечението може да атенюирабъбрекщета. Моделът UUO е представителен животински модел на обструктивна нефропатия, който се характеризира с прогресивен тубулоинтерстициаленФиброза[43]. Хистопатологичният анализ набъбректъканите, получени от uUO модела, показват, че натрупването на ЕКМ и тръбната атрофия в интерстициалното пространство са възстановени чрез лечението с 6-BIO. Освен това, с помощта на лекувани с TGFβбъбрекпроксимални производни на тубули и интерстициални фибробластни клетки, демонстрирахме, че 6-BIO лечението може да атенюирабъбрекщета. В UUO модела и третираните с TGFβ HK-2 и NRK49F клетки 6-BIO инхибира изразяването набъбрекФиброзамаркери, както и MAPK иСМАДсигнални пътища. В допълнение, 6-BIO лечение намалява изразяването на P-C-JUN, P-C-FOS, и SP-1 протеини, индуцирани от UUO и TGFβ, както и ядрената експресия и организатор дейност на AP-1 и SP-1 в TGF-β третирани HK-2 и NRK49F клетки. Инхибирането на AP-1 и SP-1 транскрипционните фактори от 6-BIO лечение е свързано с инхибирането на натрупването на ECM, което води до обостряне набъбрекФиброза. Това се постига чрез потискане на MAPK иСМАДсигнални пътища, които водят до намаляване на изразяването на PAI-1 и CTGF. Резултатите ни сочат, че 6-BIO може да бъде потенциален терапевтичен агент срещубъбрекзаболявания, както и за предотвратяване набъбрекщети, причинени от UUO и TGFβ.

Кликнете към органични Cistanche за бъбречно заболяване

Полусинтетичният клетъчен пропусклив индирубин производно 6-BIO принадлежи към бис-индол семейство и естествено се среща в ядивни коремоноги мекотели и растения [12]. Индирубинът съдържа интрамолекулна водородна връзка между 2-C двойната връзка O и n1-H групата и друга междумолекулна водородна връзка между молекулите. 6-BIO има химически модифицирана структура, в която 6-позицията се заменя с Br, за да преодолее недостатъка на лоши фармакокинетични свойства поради ниската разтворимост на вода на индирубин [44]. Много индирубини, поради конкурентно свързване с ATP, действат като двойни инхибитори на циклин-зависими киназа (CDK) и гликоген синтаза киназа-3β (GSK-3β), проявяващи повече от 16-кратна селективност над CDK5 [12]. Освен това 6-BIO проявява подчертано селективно инхибиране на GSK-3β със стойност IC50 0,005 μM [12]. Според докладите на няколко групи, 6-BIO напълно инхибира MCF-7 клетъчната пролиферация и блокира миграцията с приблизително 75% в концентрация 10 μM, и инхибира фосфорилирането на PDK1. Това показа, че 6-BIO е вкаран в свързващата джоба на PDK1, за да образува три водородни връзки с остатъци в шарнирния регион, а задължителният джоб лесно побира допълнителните Br атоми в 6-BIO [45]. С тези характеристики, 6-BIO се проучва като ново лекарство за регулиране на клетъчни процеси като възпаление, свързано със стареенето, оксидативен стрес, клетъчна преживяемост, пролиферация, и апоптоза при рак, диабет, и дегенеративни заболявания [46,47]. Въпреки това проучванията за регулирането на гените и молекулярните механизми, свързани сбъбрекклеткаФиброзаса оскъдни. Поради това се стремихме да проучим дали 6-BIO атенюирабъбрекФиброзачрез инхибиране на PAI-1 и генната регулация на CTGF вбъбрекклетки, като по този начин се намалява натрупването на ECM.

Няколко проучвания са използвали UUO модела, за да докладват за корелация между натрупването на ECM и хроничнитебъбрекзаболяване, причинено от тръбни интерстициалниФиброза[43]. Освен това се съобщава, че свръхекспресираните PAI-1 и CTGF са свързани с високо натрупване на ЕКМ по време на прогресията на хроничнатабъбрекболест. По този начин идентифицирането на терапевтична молекула, която инхибира сигнализацията и транскрипцията на гените, свързани с засилено натрупване на ECM, е важно за ефективно инхибиранебъбрекФиброза. Ето защо, в това проучване, ние оценихме 6-BIO, един от инхибиторите на гликоген синтаза киназа 3β (GSK-3β), вбъбрекФиброза.

Изследвахме ефекта на PAI-1 и CTGF протеините върхубъбрекклеткаФиброзаи потвърди, че тяхното изразяване е регулирано от общи фактори на транскрипкция, AP-1, и SP-1. Коефициентът на транскрипция, AP-1, е хетеродимер, съставен от протеини, принадлежащи към JUN (C-JUN, JUNB, и JUND), FOS (C-FOS, FOSB, Fra-1, и Fra-2), ATF (фактор на активиране транскрипция), и JDP (JUN димеризационни протеин) семейство [48]. Той регулира няколко клетъчни процеса като клетъчна пролиферация, смърт,

диференциация, и васкуларизация. По-ранно проучване съобщава, че AP-1 активност се увеличава в черния дроб и белите дробове чрез активирането на колаген тип VI и фибробласти [49,50]. Двата основни компонента на AP-1, C-JUN, и C-FOS отговарят на различни стимули, като цитокини, растежни фактори, и стрес [51]. Наблюдавахме повишено фосфорилиране на C-JUN и C-FOS в uUO плъх модел и TGFβ-третирани HK-2 и NRK49F клетки (Смокини. 2D и 4D). C-JUN и C-FOS образуват хетеродими и се свързват с мястото на свързване AP-1 в ДНК, като по този начин действат като фактори на транскрипиране, за да регулират изразяването на други гени. Освен това фосфорилацията на ERK1/2 и JNK активира C-FOS и C-JUN, съответно. В нашето проучване фосфорилацията на ERK1/2 и JNK, както и C-JUN и C-FOS в ядрото е забележително увеличена в отговор на лечението с TGFβ. Въпреки това, 6-BIO лечение значително обърна тези ефекти. Нашето проучване показа, че 6-BIO ефективно инхибира фосфорилацията на ERK1/2 и JNK и намалява активността на транскрипция фактор AP-1, като по този начин инхибира фосфорилацията на C-JUN и C-FOS които са неговите надолу по веригата ефекти. Инхибирането на SP-1 при чернодробна астроцити упражняваанти-фиброзниефект [52]. Друго проучване показва, че SP-1 играе важна роля вФиброза[52,53]. Ето защо Сметната средство оцени дали 6-BIO може да инхибира фактора на транскрипация SP-1. Наблюдавахме, че изразяването на SP-1 протеин се е увеличило в отговор на лечението с TGFβ, както и в uUO модела, като има предвид, че е намалял след лечение с 6-BIO. Освен това ядреният израз на SP-1, предизвикан от TGFβ, е потиснат от лечението с 6-BIO. В резултат на това дейностите на организаторите на PAI-1 и CTGF, които имат места за свързване AP-1 и SP-1, също бяха намалени чрез лечение с 6-BIO (фиг. 6). Поради това тези констатации сочат, че намаляването на промоуър активността на PAI-1 и CTGF чрез 6-BIO лечение понижава протеиновия израз PAI-1 и CTGF, и намалява натрупването на ECM, като по този начин намалявабъбрекклеткаФиброза.

5. Заключение

6-BIO лечението намалява PAI-1 и CTGF експресията в UUO модела и лекуваните с TGFβбъбрекКлетки. Освен това 6-BIO инхибира индуцираното от TGFβ активиране наСМАДи MAPK сигнализация, като същевременно инхибира дейностите на AP-1 и SP-1, два от няколкото транскрипционен фактор, обвързващи за организаторите на PAI-1 и CTGF гени. Инхибирането на AP-1 и SP-1 изглежда е един от ключовите механизми, чрез които 6-BIO инхибирабъбрекФиброза. По този начин резултатите ни сочат, че 6-BIO може да бъде потенциален терапевтичен агент срещубъбрекЗаболявания.

Декларация за принос на авторството по кредит

Джунг Сън Парк: Концептуализация, Методология, Data curation, Писане − оригинална проектоподготовка, Писане − преглед & редактиране, Визуализация, Придобиване на финансиране. В Ae Jung: Курация на данни, Писане − преглед & редактиране. Хонг Санг Чой: Обучение на данни, Писане − преглед & редактиране. Донг-Хьон Ким: Методология, Данни курация. Хун Ин Чой: Методология, Данни курация. Ън Хуи Бае: Писане − преглед & редактиране, Надзор. Seong Kwon Ma: Писане − преглед & редактиране,

6. Препратки

Източникът е от Jung Sun Park et, al на Биомедицина & Фармакотерапия 145 (2022) 112402