Част 2 Откриване на лекарствени продукти от Cistanches Herba (Rou Cong Rong) с помощта на специфични за вида нуклеотидни подписи

Търсейки нуклеотидните сигнатури, разработени в това проучване, открихме, че 15 от 31 китайски патентовани лекарства, етикетирани като съдържащиCistanches Herbaвместо това съдържаше подправки, включително осем фалшиви съставки и седем подправки (Таблица 2). Например, шест партиди бяха заменени с Cy. songaricum, включително три партиди хапчета Shihu Yeguang, една партида хапчета Kangguzhi Zengsheng, една партида капсули Sanbao и една партида частици Wenweishu.

Освен това различни партиди от един и същи производител дават малко различни резултати. Например, сред три партиди от един производител (ZCY16, ZCY69 и ZCY71), една партида съдържа смес от Ci.deserticolaи Cy. songaricum, една партида се състои от смес отCi. deserticolaиCi. tubulosaи съдържа само една партидаCi. tubulosa. Две партиди от друг производител (ZCY44 и ZCY70) също се различават: една партида съдържа Cy. songaricum, докато другата партида съдържашеCi. deserticolaиCi. tubulosa.

Cistanches Herbaбеше открит в 23 от 31 тествани китайски патентовани лекарства (Таблица 2) и само 16 проби бяха автентични, например без подправки или фалшиви съставки.Ci. tubulosaе открит в 16 партиди китайски патентовани лекарства и Ci. deserticola е открит в 10 партиди. O. coerulescens не е открит в нито един от продуктите (Таблица 2).

Cistanche deserticola има много ефекти, щракнете тук, за да научите повече

ДИСКУСИЯ

Необходимостта от разработване на нов метод за мониторинг на наличните в търговската мрежа лекарствени продукти, съдържащицистанчииHerba

Cistanches Herbaе тоник, който се използва широко във възстановителните китайски патентовани лекарства и други медицински продукти. Контролът на качеството на китайските патентовани лекарства обаче представлява голямо предизвикателство поради разнообразието и сложността на съставките. Поради липсата на регулаторен надзор съществува значителна възможност за подправяне или фалшифициране на продукти. В допълнение, всички продукти трябва да бъдат обработени в съответствие с Фармакопеята или други стандарти; подправянето или фалшифицирането не е разрешено по време на обработката. По този начин са установени различни методи за контрол на качеството, като двуизмерна течна хроматография с много сърцевини (Yao et al., 2015), близка инфрачервена отражателна спектроскопия (Zhang and Su, 2014; Zhang et al., 2015). ) и течна хроматография-масспектрометрия (Wang et al., 2016b). Въпреки това методите на аналитичната химия, които понастоящем се прилагат от Комисията по китайската фармакопея (2015 г.), не могат да се използват за удостоверяване на всички съставки в китайски патентовани лекарства или за откриване на наличието на фалшиви съставки. Освен това проучванията показват, че целевите метаболити в растенията се променят по време на обработката на продукта, което води до значителна променливост в резултатите от теста или пълен провал на методите за тестване (Ananingsih et al., 2013). По този начин молекулярни инструменти като специфични за видовете нуклеотидни сигнатури са готови да подсилят системите за контрол на качеството срещу риска от измамно заместване на продукта и подправяне и включване на немаркирани съставки.

Въпреки че ITS/ITS2 се счита за високоефективен инструмент за идентифициране на билкови лекарства, тези последователности не могат да бъдат амплифицирани от силно обработени проби (Newmaster et al., 2013; de Boer et al., 2015). Wang и др. съобщава, че ITS2 не може да бъде усилен от екстракт от Angelicae Sinensis Radix или отвари, варени повече от 120 минути (Wang et al., 2016a). Според традиционните технологии и Комисията по китайската фармакопея (2015 г.), Cistanches Herba винаги е силно обработена, за да се увеличи нейната медицинска ефикасност; тези процеси включват сушене в пещ, осоляване и задушаване с вино (Zou et al., 2017), което води до разграждане на ДНК. Освен това по време на обработката се добавят различни ексципиенти, като мед, нишесте и декстрин. Ако тези ексципиенти не бъдат отстранени напълно, чистотата на ДНК ще бъде засегната. Например, следният производствен процес се използва за генериране на капсули Sanbao, съдържащи Cistanches Herba: "Сварете лечебните резени в продължение на 1,5 часа два пъти, комбинирайте отварите и филтрирайте сместа. Концентрирайте филтрата до относителна плътност от 1,20~1,25 (при 80°С). ◦C).Добавете други смлени прахове и ги комбинирайте, за да получите хомогенна смес.След това изсушете сместа при 60◦C и след това я смилайте на фино

прах." Въпреки това, след производствения процес, описан по-горе, може да има трудности по време на екстракцията на ДНК на китайски патентовани лекарства и дългите фрагменти може да не бъдат амплифицирани от разградената ДНК, което би попречило на идентифицирането на фалшификати. По този начин, за да се гарантира, качество и чистота на ДНК, добавихме допълнителни стъпки преди екстракцията на геномна ДНК, включително промиване с буфер за предварително измиване и елуиране на десет паралелни епруветки в една епруветка за всяка партида.

Въпреки че всички китайски патентовани лекарства, използвани в настоящото изследване, съдържаха 6–25 съставки, разработените двойки праймери биха могли специфично да увеличат последователностите на фалшивите вещества в тези китайски патентовани лекарства. Директното секвениране на PCR продуктите показа чисти файлове със следи. По този начин този метод на нуклеотиден подпис е в състояние да идентифицира както автентични видове съставки, така и примеси и трябва да разшири приложението на основани на ДНК инструменти за молекулярна диагностика за надзор на пазара.

увреждане и заболяване на бъбреците може да се лекува с цистанхе

Нуклеотидни сигнатури за ефективна идентификация на продукти Cistanches Herba

Молекулярните инструменти, които използват PCR технология, са много обещаващи за удостоверяване на автентичността на лекарствени продукти в рамките на системите за контрол на качеството. Успешното прилагане на праймерите за идентифициране на разградени от ДНК добавки от Cistanches Herba предполага, че PCR-базиран метод за откриване може да се използва широко. На китайския пазар на билкова медицина цената на автентичните съставки от вида Cistanches Herba е повече от пет пъти по-висока от цените на нейните подправки. Нашите резултати показаха, че Cy. songaricum е най-често срещаният фалшификат на Cistanches Herba на пазара, следван от Ci. Sinensis. Cy. songaricum беше добавен, тъй като тези лекарства имат сходни морфологични характеристики. В допълнение, химичният състав на Ci. sinensis е подобен на този на Cistanches Herba. Като маркери за контрол на качеството заCistanches Herbaекстракти, ехинакозид и актеозид могат да бъдат евтино извлечени от Ci. sinensis. По този начин някои фармацевтични фабрики използват Ci. sinensis като заместител при производството на екстракти от Cistanches Herba. Взети заедно, резултатите от това проучване показват, че има значителни измами на пазара на лекарствени продукти.

Фалшификацията в китайската патентна медицина е подобна на тази в други страни. Подобни нива на фалшифициране са регистрирани в Северна Америка (Newmaster et al., 2013), Европа (Raclariu et al., 2017) и Азия (Cheng et al., 2014; Shanmughanandhan et al., 2016; Gao et al. , 2017). В това проучване процентът на фалшифицирани китайски патентовани лекарства е приблизително 48,4 процента, като само 16 от 31 проби са автентични Cistanches Herba. Освен това спекулирахме, че различните резултати, получени в продукти от един и същи производител, могат да се дължат на разлики в качествата на различните партиди китайски медицински материали. Следователно, за да се контролира качеството на китайските патентовани лекарства, суровините трябва да бъдат удостоверени, преди да бъдат преработени в продукти.

Подправяне наCistanches Herbaтрадиционно се свързва с въпросите на търсенето и предлагането на суровини.Ci. deserticolaиCi. tubulosaса двете оригинални растения, използвани в момента за формулиранеCistanches Herba. Въпреки това Ci. deserticola е единственият оригинален вид в традиционните автентични Cistanches Herba, изброени в Комисията по китайската фармакопея (2000), в която Ci. tubulosa се идентифицира като фалшификат. Поради недостига на Ci. ресурси на deserticola,Ci. tubulosaе посочен като добавка в Китайската фармакопея от 2005 г. (Jiang and Tu, 2009). Доскоро цените на тези билки се различаваха значително; Ci. tubulosa е много по-евтин от Ci. deserticola, защото има много по-голямо предлагане на първото. Тук нашите резултати показаха, че Ci. tubulosa се използва по-широко в предлаганите в търговската мрежа продукти Cistanches Herba.

В заключение, нуклеотидните подписи и базирани на PCR

Методите, разработени в това проучване, могат да послужат като полезни инструменти за индустрията на лекарствените продукти за удостоверяване на съставките и откриване на подправки вцистанчииПродукти Herba. В съответствие с резултата за чувствителност, дори ако съотношението на фалшификата е едно на десет хиляди, то може да бъде открито чрез qRT-PCR. Това означава, че след като бъде открит нуклеотиден подпис вцистанчииФункционални продукти, съдържащи Herba, могат да бъдат идентифицирани като подправена или фалшива съставка. Осигурено е ново решение за откриване на фалшиви съставки или фалшифицирани Cistanches Herba, което преди не е било достъпно чрез химически методи за откриване в Китайската фармакопея. В допълнение, този метод може да се използва за валидиране на нарастващи видове лекарства и за разширяване на приложенията на основани на ДНК инструменти за молекулярна диагностика за надзор на пазара.

За облекчаване нахрониченбъбрекзаболяванесцистанче

АВТОРСКИ ПРИНОС

JH замисля проучването и участва в неговия дизайн. XW, RX и JC допринесоха с проби и извършиха експериментите. XW анализира данните. XW, JH, ZZ, S-GN, JS и SC съставиха ръкописа. Всички автори са прочели и одобрили окончателния ръкопис.

ФИНАНСИРАНЕ

Тази работа беше подкрепена от Националната природонаучна фондация на Китай [грант номер 81673552], CAMS Innovation

Фонд за медицински науки [грант номер 2016-I2 M- 3-016] и Ключов проект на Обединения фонд на Националната фондация за природни науки на Китай [грант номер U1403224].

БЛАГОДАРНОСТИ

Бихме искали да благодарим на нашите колеги, които помогнаха за събирането на проби, идентификацията, лабораторната работа и подготовката на ръкописа, включително Chaokui Sun, Dianyun Hou и Piao Zhang.

ДОПЪЛНИТЕЛЕН МАТЕРИАЛ

Допълнителният материал за тази статия може да бъде намерен онлайн на: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018. 01643/пълен#допълнителен-материал

Допълнителна фигура S1|Резултатът от подравняването на ITS2 последователност от шест вида.

Допълнителна фигура S2|Агарозна гел електрофореза на всички проби.

Допълнителна таблица S1|Информация за вземане на проби от Cistanches Herba и неговите примеси.

Допълнителна таблица S2|Информация за последователността на свързани видове, изтеглена от GenBank.

Допълнителна таблица S3|Декларираните състави на различни образци на китайски патентовани лекарства.

Допълнителен информационен лист S1|Всички последователности, получени в това изследване.

Цистанчеdeserticola има много ефекти

ПРЕПРАТКИ

Ananingsih, VK, Sharma, A. и Zhou, W. (2013). Катехини на зелен чай по време на обработка и съхранение на храни: преглед на стабилността и откриването. Food Res. Вътр. 50, 469–479. DOI: 10.1016/j.foodres.2011.03.004

Chen, H., Jing, FC, Li, CL, Tu, PF, Zheng, QS и Wang, ZH (2007). Ехинакозидът предотвратява стриаталните извънклетъчни нива на моноамин

невротрансмитери от намаляване при плъхове с 6-хидроксидопаминови лезии. J. Ethnopharmacol. 114, 285–289. DOI: 10.1016/j.jep.2007.07.035

Chen, S., Yao, H., Han, J., Liu, C., Song, J., Shi, L. и др. (2010). Валидиране на региона ITS2 като нов ДНК баркод за идентифициране на лечебни растителни видове. PLoS ONE 5:e8613. DOI: 10.1371/journal.pone.0008613

Cheng, X., Su, X., Chen, X., Zhao, H., Bo, C., Xu, J., et al. (2014 г.). Анализ на биологични съставки на препарати от традиционна китайска медицина, базирани на високопроизводително секвениране: историята за Liuwei Dihuang Wan. Sci. Представление 4:5147. DOI: 10.1038/srep05147

Китайска фармакопейна комисия. (2000). Фармакопея на Китайската народна република. Част I. Пекин: China Medical Science Press.

Китайска фармакопейна комисия. (2015). Фармакопея на Китайската народна република. Част I. Пекин: China Medical Science Press.

de Boer, HJ, Ichim, MC и Newmaster, SG (2015). ДНК баркодиране и фармакологична бдителност на билкови лекарства. Drug Saf. 38, 611–620. DOI: 10.1007/s40264-015-0306-8

Dubey, B., Meganathan, PR и Haque, I. (2011). ДНК мини-баркодиране: подход за криминалистична идентификация на някои застрашени видове индийски змии. Криминалистика. Sci. Вътр. Женет. 5, 181–184. DOI: 10.1016/j.fsigen.2010.03.001

Едгар, RC (2004). MUSCLE: подравняване на множество последователности с висока точност и висока производителност. Nucleic Acids Res. 32, 1792–1797. DOI: 10.1093/var/gkh340

Фу, Л. (1991). Китайска червена книга за растенията. Част I. Пекин: Science Press, 502.

Gao, Z., Liu, Y., Wang, X., Song, J., Chen, S., Ragupathy, S., et al. (2017). Производна технология на ДНК баркодиране (нуклеотидна сигнатура и SNP методи с двоен пик) открива подправки и заместване в китайски патентовани лекарства. Sci. Представление 7:5858. DOI: 10.1038/s41598-017-05892-y

Gu, CM, Yang, XY и Huang, LF (2016). Cistanches Herba: неврофармакологичен преглед. Отпред. Pharmacol. 7:289. DOI: 10.3389/fphar.2016.00289

Hajibabaei, M., Smith, MA, Janzen, DH, Rodriguez, JJ, Whitfield,

JB и Hebert, PDN (2006). Минималистичен баркод може да идентифицира екземпляр, чиято ДНК е разградена. Mol. Ecol. Бележки 6, 959–964. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2006.01470.x

Японска фармакопейна конвенция. (2016). Японската фармакопея, 17-то изд. Токио: Министерството на здравеопазването, труда и социалните грижи на Япония, 1831–1832.

Jiang, Y. и Tu, PF (2009). Анализ на химичните съставки във видовете Cistanche. J. Chromatogr. 1216, 1970–1979. DOI: 10.1016/j.chroma.2008.07.031

Келер, А., Шлайхер, Т., Шулц, Й., Мюлер, Т., Дандекар, Т. и Волф, М. (2009). 5.8S-28S rRNA взаимодействие и HMM-базирана ITS2 анотация. Ген 430, 50–57. doi: 10.1016/j.gene.2008.10.012

Lei, L., Yang, F., Zhang, T., Tu, P., Wu, L. и Ito, Y. (2001). Препаративно изолиране и пречистване на актеозид и 2'-ацетил актеозид от Cistanches salsa (CA Mey.) G. Beck чрез високоскоростна противотокова хроматография. J. Chromatogr. A 912, 181–185. DOI: 10.1016/S0021-9673(01)00583-0

Li, Z., Lin, H., Gu, L., Gao, J. и Tzeng, CM (2016). Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): един от най-добрите фармацевтични дарове на традиционната китайска медицина. Отпред. Pharmacol. 7:41. DOI: 10.3389/fphar.2016.00041

Liu, XM, Li, J., Jiang, Y., Zhao, MB и Tu, PF (2013). Химични съставки от Cistanche Sinensis (Orobanchaceae). Biochem. Syst. Ecol. 47, 21–24. DOI: 10.1016/j.bse.2012.09.003

Liu, Y., Wang, X., Wang, L., Chen, X., Pang, X. и Han, J. (2016). Нуклеотиден подпис за идентифициране на американски женшен и неговите продукти. Отпред. Plant Sci. 7:319. DOI: 10.3389/fpls.2016.00319

Lo, YT, Li, M. и Shaw, PC (2015). Идентифициране на съставни билки в отвари от женшен чрез ДНК маркери. Брадичка. Med. 10:1. DOI: 10.1186/s13020-015-0029-x

Meusnier, I., Singer, GA, Landry, JF, Hickey, DA, Hebert, PD, и Hajibabaei, M. (2008). Универсален ДНК минибаркод за анализ на биоразнообразието. BMC Genomics 9:214. DOI: 10.1186/1471-2164-9-214

Newmaster, SG, Grguric, M., Shanmughanandhan, D., Ramalingam, S. и Ragupathy, S. (2013). ДНК баркодирането открива замърсяване и заместване в северноамерикански билкови продукти. BMC. Med. 11:222. DOI: 10.1186/1741-7015-11-222

Raclariu, AC, Mocan, A., Popa, MO, Vlase, L., Ichim, MC, Crisan, G., et al. (2017). Удостоверяването на автентичността на продукта от Veronica officinalis с помощта на ДНК метабаркодиране и HPLC-MS разкрива широко разпространено подправяне с Veronica chamaedrys. Отпред. Pharmacol. 8:378. DOI: 10.3389/fphar.2017.00378

Shanmughanandhan, D., Ragupathy, S., Newmaster, SG, Mohanasundaram, S. и Sathishkumar, R. (2016). Оценка на автентичността и фалшифицирането на билкови продукти в Индия с помощта на ваучерирана библиотека с биологични референтни материали, базирана на ДНК. Drug Saf. 39, 1211–1227. DOI: 10.1007/s40264-016- 0459-0

Sun, ZY, Song, JY, Yao, H. и Han, JP (2012). Молекулярна идентификация на Cistanches Herba и неговите примеси въз основа на nrITS2 последователност. J. Med. Plants Res. 6, 1041–1045. DOI: 10.5897/JMPR11.1115

Тамура, К., Питърсън, Д., Питърсън, Н., Стечер, Г., Ней, М. и Кумар, С. (2011). MEGA5: молекулярно-еволюционно-генетичен анализ, използващ методи на максимална вероятност, еволюционно разстояние и максимална пестеливост. Mol. Biol. Еволюция 28, 2731–2739. DOI: 10.1093/molbev/msr121

Wang, Q., Song, W., Qiao, X., Ji, S., Kuang, Y., Zhang, ZX, et al. (2016b). Едновременно количествено определяне на 50 биоактивни съединения от формулата на традиционната китайска медицина Gegen-Qinlian отвара с помощта на ултра-високо ефективна течна хроматография, съчетана с тандемна масспектрометрия. J. Chromatogr. 1454, 15–25. DOI: 10.1016/j.chroma.2016. 05.056

Wang, T., Zhang, XY и Xie, WY (2012). Cistanche deserticola

YC Ma, „Пустинен женшен“: преглед. Am. Дж. Чин. Med. 40, 1123–1141. DOI: 10.1142/S0192415X12500838

Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J. и Chen, S. (2016a). Нуклеотиден подпис за идентифициране на Angelicae Sinensis Radix (Danggui) и неговите продукти. Sci. Представление 6:34940. DOI: 10.1038/srep34940

Yao, CL, Yang, WZ, Wu, WY, Dai, J., Hou, JJ, Zhang, JX,

и др. (2015). Едновременно количествено определяне на пет сапонини от Panax notoginseng чрез двуизмерна течна хроматография с много сърцевини: разработване на метод и приложение за контрол на качеството на осем съдържащи Notoginseng китайски патентовани лекарства. J. Chromatogr. 1402, 71–81. DOI: 10.1016/j.chroma.2015.05.015

Zhang, C. и Su, J. (2014). Приложение на близката инфрачервена спектроскопия за анализ и бърза оценка на качеството на традиционни китайски лекарствени продукти. Acta. Pharm. грях. B 4, 182–192. DOI: 10.1016/j.apsb.2014.04.001

Zhang, W., Qu, Z., Wang, Y., Yao, C., Bai, X., Bian, S., et al. (2015). Близка инфрачервена отражателна спектроскопия (NIRS) за бързо определяне на гинзенозид Rg1 и Re в китайска патентована медицина Naosaitong хапче. Spectrochim. Acta. A Mol. Biomol. Spectrosc. 139, 184–188. DOI: 10.1016/j.saa.2014.11.111

Zou, P., Song, Y., Lei, W., Li, J., Tu, P. и Jiang, Y. (2017). Приложение на метаболомика, базирана на 1H NMR, за разграничаване на различни части и разработване на нов работен процес за обработка на Cistanche deserticola. Acta. Pharm. грях. B 7, 647–656. DOI: 10.1016/j.apsb.2017.07.003

Декларация за конфликт на интереси: Авторите декларират, че изследването е проведено при липса на търговски или финансови взаимоотношения, които биха могли да се тълкуват като потенциален конфликт на интереси.

Авторско право © 2018 Wang, Xu, Chen, Song, Newmaster, Han, Zhang и Chen. Това е статия с отворен достъп, разпространявана съгласно условията на лиценза Creative Commons Attribution (CC BY). Използването, разпространението или възпроизвеждането в други форуми е разрешено, при условие че оригиналният автор(и) и собственикът(ите) на авторските права са посочени и че оригиналната публикация в това списание е цитирана, в съответствие с приетата академична практика. Не е разрешено използване, разпространение или възпроизвеждане, което не отговаря на тези условия.