Част 3:Уникална мишка модел на ранния живот упражнение позволява хипокампус памет и синаптична пластичност

за повече information:ali.ma@wecistanche.com

PLS кликнете тук, за да част 2

Материали и методи

Животни. Мишките от див тип бяха потомството на язовири C57Bl6J, първоначално получени от Лаборатории Джаксън и допълнително отмножени в нашите животински съоръжения. Мишките имаха свободен достъп до храна и вода и светлините се поддържаха на 12 h лек/тъмен цикъл. При отслабване в постнатален ден (Р) 21 мишките са били настанени или в стандартни постелки клетки, или в клетки, оборудвани с ходово колело. Както мъжките, така и женските мишки са използвани за всички експерименти с упражнения и поведение. Само мъжки мишки са използвани за електрофизиологични проучвания. Цялото поведенческо тестване е извършено по време на светлинния цикъл. Експерименти бяха проведени съгласно американските национални институти по здравеопазване насоки за грижи и употреба на животни и са одобрени от Комитета по институционална грижа за животните и употреба на Университета на Калифорния, Ървайн.

Щракнете, за даCistanche ефекти за подобряване на паметта

Парадигма на ходното колело. При отбождане на P21 мишките са били сдвоени или в стандартни клетки без колело, или оборудвани или с подвижно или неподвижно неръждаемо ходово колело (диаметър 4,5 см, 112 грама, Starr Life Sciences). Животните, настанени с ходови колела, са имали свободен достъп за предварително определени срокове: или една седмица по време на юношеския период (P21–27; juv ELE), една седмица по време на юношеството (P35–41; Adol ELE), или три последователни седмици достъп (P21–41; juv-adol ELE). Допълнителна група мишки беше приютена с неподвижно колело по време на P21–41 (sta) за контрол за обогатяване на околната среда от наличието на колело в клетки. Всяко колело е било съоръзнато с лека полиуретанова мрежа, за да се предотврати промъкването на малките крайници на отбиващите мишки през пистите на колелата. Бягащата активност беше проследена чрез цифрово наблюдавани сензори, прикрепени към порт за данни и компютър за придобиване на данни в реално време (Vital View Sofware) чрез магнитно откриване на оборотите на колелата. Всяко цифрово наблюдавано колело е проследило разстоянието за движение за клетки (две мишки, настанени на клетки, като по този начин изминатото разстояние за една клетки представлява общото разстояние, протечено между две мишки). Оборотите бяха количествено определени с минутата дневно за продължителността на бягане и преобразувани в разстояние бягане на кафез (км).

Местоположение на обектапамет(OLM) протокол. Мястото на обектапаметпротокол, използван в това проучване, е адаптиран и модифициран от предишни протоколи44. В постнатален ден 36 мишките бяха вкарани в зала за тестване с намалена яркост на стаята. Мишките се обработваха приблизително по 2 мин всеки, за общо 5 последователни дни преди тренировката на OLM (два пъти дневно за първите 2 дни, последвани от веднъж дневно за следващите 3 дни). Сесиите за привикване бяха 5 мин, два пъти на ден в продължение на 3 дни (P38-P40) и се случиха в рамките на камери, съдържащи четири уникални пространствени сигнали на всяка стена на камерата (хоризонтални линии, черни X, вертикална лента, и празна стена). Привикването се припокрива с последните 2 дни на боравене. По време на фазата на обучение (P41) мишките са били поставени в едни и същи камери с два еднакви предмета и са изложени или на подтресхолд (3 мин), или праг (10 min) период на обучение; дизайн на проучване, информиран от предварителна работа, доказващ, че 3 min обучение обикновено е недостатъчно за дългосрочнипаметформация45. За мишките в клетки за упражнения ходовите колела бяха заключени веднага след обучението на OLM, за да се премахнат всички остри ефекти на упражняване върхупаметКонсолидация. В деня за тестване (P42; 24 часа афер обучение), един от обектите е преместен на роман място вътре в камерата, и мишки след това са били допуснати да изследват обектите в продължение на 5 минути. Te времената, прекарани с всеки обект, се определяха чрез сляп анализ чрез ръчно точкуване, И стойностите, получени както в дните на обучение, така и в дните на тестване, бяха превърнати в Индекс на дискриминацията (DI), въз основа на романа местоположение на обекта по време на тестването: [(времето, прекарано в проучване на роман обект – време, прекарано в проучване на познат обект)/(общо време за изследване на двата обекта) × 100%]. Няма значителни разлики впаметпроизводителност между заседнали животни и тези, настанени с неподвижно колело, така че тези групи са били комбинирани и представени като "без ELE" във всички OLM анализи. Опитите за привикване бяха анализирани за изминато разстояние през сесиите с помощта на софтуер за поведенчески анализ ANY-лабиринт (Stoelting Co). Мишките с неравномерни времена на проучване между двата обекта по време на фазата на обучение (DI > 20) или които не показват намаляване на общото разстояние, изминато през сесиите за привикване, бяха изключени от анализа.

Cistanche може да помогне за подобряване на паметта

проучвания за електрофизиология. Експериментите с електрофизиология са извършени, както е описано по-рано, а източникът на тези методи е публикуван другаде66. Само мъжки мишки са използвани за електрофизиологични експерименти. За кратко мъжките мишки от всички ELE групи са пожертвани между Р42–51, а от ростралния хипокампус се събират нарязвания. Короналните резени са сечени (Leica VT1000 S) с дебелина 320um и са поставени в интерфейсна записваща камера с предварително загрята (31 ± 1 °C) изкуствена цереброспинална течност (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 1,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3, и 10 mM d-глюкоза). Нарезите непрекъснато се перфузираха със скорост 1,75 –2 ml на мин, докато повърхността на парчетата беше изложена на топло, навлажнено 95% O2/5% CO2. Записите започнаха афер най-малко 2 h инкубация. Полев възбуждащ постсинаптични потенциали (fEPSPs) са записани от CA1b стратум радиатум с помощта на една стъклена пипета (2–3 MΩ) флиртува с 2 M NaCl. Импулсите за стимулиране (0,05 Hz) са доставени на обезпечения-комисурални прогнози на Шафер, като се използва биполярен стимулиращ електрод (усвъртена нихромна тел, 65 μm), позициониран в CA1c. Текущата интензивност е коригирана, за да се получи 50% от максималния отговор на FEPSP. След установяването на стабилна изходна линия LTP е предизвикана с един влак fve theta избухва, при който всеки избухнал (четири импулса при 100 Hz) е доставен на 200 ms един от друг (т.е. при тета честота). Интензивността на стимулиране не е увеличена по време на TBS. Данните са събрани и цифровизирани от NAC 2.0 Система за придобиване neurodata (Teta Burst). Данните в lTP фигурата са нормализирани до последните 10 мин на изходното ниво и представени като средна ± SE. Изходни мерки за I/O криви, сдвоено-импулсно улеснение и LTP са анализирани с помощта на двупосочен ANOVA и линеен регресионен анализ (софтуер Graphpad Prism 8).Cistanche може да помогне за подобряване на паметта.

Статистически анализи. Еднопосочни ANOVAs са били използвани за анализ на ефекта от времето на упражняване на ранен живот на OLM придобиване DIs (фиг. 2г, ж), OLM тестване DIs (фиг. 2д, з) и OLM Тестване общо време на проучване (Фиг. 2е, i) в рамките на всеки пол. След-хок множеството сравнения на Dunnett са използвани за извършване на специфични сравнения с групата "no ELE" (засечка), когато са наблюдавани значителни резултати от ANOVA. Двупосочна ANOVA е била използвана за анализ на теглото на мишката, придобито по време на периода ELE (фиг. 1b, фактори на ELE група и секс). Двупосочни повторни мерки (RM)-ANOVAs бяха използвани за анализ на дневното бягане разстояние (Фиг. 1в–д, фактори на постнатален ден и пол), сесии за привикване (фиг. 2б, в) и за сравняване на OLM придобиване DI срещу тестване DI за всяка мишка за сравнения в рамките на групата. Пост хок тестовете на Sidak са използвани за извършване на специфични сравнения, когато са наблюдавани значителни взаимодействия или основни ефекти на бягаща група или OLM сесия. Освен това е извършена тристранна ANOVA за OLM тестване DIs за определяне на всякакви значителни взаимодействия между три номинални променливи (OLM продължителност обучение, ELE група, и секс). За редки случаи, че не са били записани 24 h работещи данни за определен ден, стойностите са били вмествани въз основа на предприемането на средното разстояние бягане на предварителните три дни, за извършване на статистически анализи. T-тестовете на Unpaired Student са използвани за анализ на общите разстояния на бягане за всяка ELE група (фиг. 1f–h), както и сравняване на OLM тестване DIs между 3-мин и 10-мин обучени заседнал мишки. Кумулативните разстояния при движение се изразяват като Средства ± SD. Основните ефекти и взаимодействия за всички ANOVAs са описани в текстовите и фигурните легенди, заедно със специфичния брой животни от всеки пол, използвани при всеки експеримент. Всички анализи бяха двуопашати и изискваха α стойност 0,05 за значимост. Лентите за грешки във всички цифри представляват SEM. За всички експерименти стойностите ±2 стандартни отклонения от средната група са считани за зали и са премахнати от анализите. Всички статистически данни бяха извършени със софтуер GraphPad Prism 8. Общ брой на мишките, използвани в експериментите за поведение = 152.

Cistanche може да помогне за подобряване на паметта

Получено: 16 януари 2020 г.; Прието: 13 май 2020 г.;

Публикувано: xx xx xxxx

Благодарности

Това изследване е подкрепено от Националния институт по неврологични нарушения и инсулт на Националните институти по здравеопазване, под награда номер K12NS098482 (присъдена на A.S.I.) и UC Irvine училище по медицина, Катедра по педиатрия. Също така бихме искали да благодарим на д-р Марсело Ууд за техните научни дискусии и критичен вход по проекта.

Авторски приноси

A.S.I., T.Y., S.P., F.S., и T.V. извършиха експерименти с упражнения и поведение и анализирани данни; Е.К. извърши всички електрофизиологични експерименти, анализира данните и редактира ръкописа; A.S.I. проектирани проучване, анализирани данни, интерпретирани резултати, и написа ръкописа.

конкурентни интереси

Авторите не обявяват конкурентни интереси.

Допълнителна информация

Кореспонденцията и исканията за материали следва да бъдат адресирани до A.S.I.

На www.nature.com/reprints има информация за препечатки и разрешения.

Бележката на издателя Springer Nature остава неутрална по отношение на претенциите за юрисдикция в публикуваните карти и институционалната принадлежност.