Част 4: Картографиране на епигеномното и транскриптомното взаимодействие по време на формирането на паметта и извикването в ансамбъла на хипокампалната енграма
Mar 22, 2022
ali.ma@wecistanche.com
RNA-seq
ul вода без нуклеаза), за 30 минути при 37°C с леко разклащане. Увеличените ДНК фрагменти бяха амплифицирани и баркодирани с помощта на PCR реакция (1 цикъл; 5min – 72c, 30sec – 98c, 10 цикъла; 15sec – 98c, 30sec – 60c, 3min – 72c). Следвайки протокола на производителя, амплифицираната ДНК се почиства и пречиства с помощта на 1.8x AMPure гранули (AmpureXP гранули, Beckman Coulter, A63880). След биоанализатор QC за размера и разпространението на библиотеката, библиотеките бяха секвенирани на платформата Illumina Nextseq 550 в MIT BioMicro Center.
Cistanche и Cistanches за подобряване на паметта
ATAC-seq анализ—Необработените fastq данни на 40-bp сдвоени крайни секвениращи четения бяха подравнени към референтния геном на мишка mm9 с помощта на Bowtie 2.0 в режим на сдвоен край50. Колекцията Samtools51 беше използвана за сортиране, премахване на PCR дубликати (rmdup), индексиране на BAM файлове (индекс) и изчисляване на библиотечна статистика (flagstat, вижте допълнителна таблица 13). BAM файловете бяха намалени от правилно подравнени, сдвоени и уникални четения до 50 милиона. Пиковете на отворения хроматин бяха анализирани с помощта на софтуера MACS252. Диференциално достъпните региони (DARs) бяха идентифицирани от Diffbind v1.16.353 с параметри и настройки по подразбиране за използване на DESeq2 (прекъсване; FDR <0,01; промени="" на="" пъти=""> 1,5). Пълната матрица на нормализираните преброявания (RPKM54) беше извлечена от пакета DiffBind. За едно поколение големи песни, pileup сигнални файлове (фрагмент pileup на милион прочитания) в биографичен формат бяха конструирани чрез използване на функцията MACS2 call peak с флаговете -B –SPMR. След това се генерира нормализирано обогатяване на пъти (FE) върху входни ламбда следи, като се използва функцията bdgcmp на MACS2 с настройка - m FE. След това файловете на bedGraph бяха преобразувани във формат bigwig.
Инструментите IGV55 бяха използвани за визуализация на големи файлове. ChromHMM56 беше използван за установяване на модел на състояние на хроматин от две независими проучвания, които използваха обемна тъкан на хипокампуса преди и след удар на крака 21, 22 и за определяне на обогатяването на DAR над модела на състоянието. Анализът на обогатяване на мотиви 57, 58 и анотацията на пиковете беше извършена от инструменти HOMER59. Всички кодове са достъпни в допълнителен софтуерен файл Екстракция на РНК и подготовка на библиотека – Незабавно следвайте фиксирането и сортирането (вижте подготовката на тъканите), 4 ul протеаза се добавя към буфера за смилане (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit за FFPE, Life Technologies, AM1975) . Пробите се инкубират в топлинни блокове за 15 минути при 50 градуса, след това 15 минути при 80 градуса. След това към всяка проба се добавят 0,75 ml Trizol LS (TRIzol™ LS реагент, Thermo Fisher Scientific, 10296028) и 0,2 ml разтвор на фенол: хлороформ (фенол: хлороформ: изоамилов алкохол, 1 фаза, VWR International, K169), последвано от енергично разклащане в продължение на 5 минути при стайна температура (RT). Суспензията се поставя в тежки епруветки с Phase lock gel (PLG, 5 Prime, 2302830) и се върти надолу при 13,000rpm за 5 min. Водната фаза с нуклеинови киселини се екстрахира от епруветките в прясна епруветка Eppendorf с равно количество етанол 100 процента. Пречистването на РНК се извършва чрез комплект Direct-zol™ RNA MicroPrep (Zymo Research, R2060) за пречистване на РНК, съгласно инструкциите на производителя. РНК се елуира (10 ul, DEPC) и след това се съхранява при -80 градуса. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian (Clontech, 635006) беше използван за подготовката и амплификацията на библиотеката. 3 биологични реплики (N=3) бяха използвани за подготовка на библиотека. Библиотеките бяха приготвени съгласно инструкциите на производителя без допълнителна стъпка на фрагментиране (FFPE, опция 2, вижте ръководството), с изчерпване на рибозомна сДНК и крайна PCR амплификация (15 цикъла). Библиотеките бяха секвенирани на платформата Illumina HiSeq 2000 в MIT BioMicro Center.
RNA-seq анализ—Необработените fastq данни бяха подравнени към еталонната mm9 мишка
геном с помощта на Bowtie 2.0. Картографираните четения от генни тела (включително четения на екзони и интрони) бяха обработени от копчета за ръкавели 2.260 и DEseq261 с UCSC mm9 референтна генна анотация за оценка на изобилието на транскрипт. Диференциалната генна експресия и анализите надолу по веригата бяха извършени с помощта на DEseq2 и персонализирани R скриптове. Относителното изобилие на транскрипти се измерва чрез фрагменти на килобаза от екзон на милион картирани фрагменти (FPKM).
За анализа на транскрипционните програми, експресията на всеки ген беше оценена за различнипаметфази (Активирана -ранна, Активирана -късна, Реактивирана) чрез тяхната log2 кратна промяна (log2FC) от базалното състояние. 1095 диференциално експресирани гени (DEGs) преминаха граничните критерии, в които наблюдавахме поне в едно сравнение на P-стойността на< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">
Cistanche може да подобри паметта
Улавяне на конформация на хромозома (Hi-C)
Ядрата от фиксирани клетки (вижте подготовката на тъканите) се сортират в 1,5 mL Eppendorf епруветки, съдържащи 500 ul пресен леденостуден лизисен буфер (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0,2 процента Igepal CA{{ 9}}, вода с клас Pi и PCR) и замразени върху сух лед и съхранявани при -80°C, докато бъдат използвани. Hi-C библиотеки бяха приготвени от 100 000 клетки/на група (събрани от две животни) в две биологични реплики, като се използва ръководство за комплект Dovetail™ Hi-C (v.1.03, Dovetail Genomics, Чикаго, САЩ). Шестте Hi-C библиотеки бяха секвенирани (сдвоен край) на платформата Illumina Nextseq 500. Тръбопроводът HOMER Hi-C беше използван за филтриране на експериментални артефакти като циркуляризация, самолигиране и PCR дубликати. Филтрираните показания бяха подравнени към референтния миши геном (mm9) и допълнително обработени с помощта на HOMER HI-C тръбопровод.
Hi-C инструментите на HOMER бяха използвани за извършване на анализ на главните компоненти (PCA) върху Hi-C данните за идентифициране на суб-ядрени отделения (A и B) при резолюция 50 Kb (вижте допълнителен софтуер). За анализ на превключвателя на отделението първо извадихме стойностите на PC1 между групите. След това идентифицирахме най-добрите BtoA преходи като региони с PC1 промяна над 90-ия персентил и най-добрите AtoB преходи като региони с PC1 промяна под 10-ия персентил. Тъй като субядрените отделения се регулират като единици от няколкостотин килобази, ние консолидирахме последователни 50 Kb AtoB или BtoA сегменти, които бяха на разстояние от 100 Kb един от друг. Консолидираните домейни, които бяха с общ размер под 200 Kb, отхвърлихме. Превключвателят на отделението се взема предвид само ако отрицателна стойност се трансформира в положителна стойност (и обратно). Накрая, положителните и отрицателните стойности на първия компонент бяха сравнени между всичките три популации на неврон (базална, активирана - ранна и активирана - късна).
Промоутър улавяне Hi-C
След фиксиране и сортиране (вижте подготовката на тъканите) клетките бяха сортирани в 1,5 mL Eppendorf епруветки, съдържащи 500 ul пресен леденостуден лизисен буфер (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0,2 процента Igepal CA{ {9}}, Pi и PCR клас вода), замразени върху сух лед и съхранявани при -80c, докато бъдат използвани. Hi-C библиотеките бяха приготвени от 10 000 клетки /на група (N=3–4), както е описано по-рано62, с известна модификация. Пробите се центрофугират (4 градуса, 1600 g за 20 минути) и утайката се ресуспендира в 400 ul 1,2x Cutsmart буфер (New England Biolabs,
САЩ). Първото рестрикционно смилане беше извършено, както е описано в оригиналния протокол с 1500 U от HindIII (R3104L, New England Biolabs, САЩ), като 6-базов режещ инструмент (вместо BglII в оригиналния протокол). След маркиране с биотин и лигиране за една нощ (вижте оригиналния протокол за подробности), пробите се центрофугират (4 градуса, 1600 × g за 15 минути) и пелетата се ресуспендира в 25 ul PBS. Суспензията се инкубира при 65°С с 3 ul протеиназа К за 12-16 часа. Пречистването на Hi-C ДНК се извършва, както е описано в оригиналния протокол със 100 ul стрептавидинови перли (Dynabeads M-280–стрептавидин, Life Technologies, 11205D). За втория рестрикционен ензим използвахме 4-базов нож Hpych4V (10 U /на проба, R0620S, New England Biolabs, САЩ). След реакция на A-tailing (вижте оригиналния протокол за подробности), пробите бяха амплифицирани с помощта на PCR (17 цикъла) и пречистени с AMPure XP гранули. Hi-C библиотеките се елуират в 20 ul от 10 mM Tris-HCl (рН 8.5). Проектиране на система за улавяне на стръв за Promoter Capture Hi-C – Списък от 5000 миши генни промотори е получен от публикувания по-рано протокол в Schoenfelder. Et al.29. Списъкът съдържа само транскрипти с биотип на протеин-кодиращи региони, със сайтове на HindIII рестрикционни фрагменти. Бяха проектирани две сонди за улавяне от 120 bp, по една за всеки край на фрагмента. Сондите са синтезирани от Agilent Technologies съгласно системата за обогатяване на цели SureSelect (Agilent Technologies).
Подготовка и секвениране на Hi-C библиотека за улавяне на промотор – За улавяне на продукти на Hi-C лигиране, съдържащи промоторни последователности, използвахме публикувания по-рано протокол29. Накратко, хибридизационни блокери (Agilent Technologies) бяха добавени към Hi-C ДНК библиотеките. Хибридизационният буфер и РНК за примамка за улавяне се приготвят съгласно инструкциите на производителя (SureSelect Target Enrichment, Agilent Technologies). След това Hi-C библиотеката ДНК/хибридизационни блокери се нагряват в продължение на 5 минути при 95 градуса, преди да се понижи температурата до 65 градуса. ДНК от Hi-C библиотека се смесва с хибридизационен буфер (предварително загрят за 5 минути до 65 градуса) и впоследствие със специално проектирана система за примамка за улавяне (предварително загрята за 3 минути до 65 градуса), състояща се от 10 000 биотинилирани РНК, насочени към краищата на рестрикционния фрагмент на HindIII на 5000 миши генни промотори (Agilent Technologies, вижте Допълнителен материал за дизайн на примамка за улавяне). След 24 часа при 65 градуса в машината за PCR се извършва изтегляне на биотин (MyOne Streptavidin T1 Dynabeads; Life Technologies) и промивания, следвайки протокола за обогатяване SureSelect Target (Agilent Technologies). След последното промиване, зърната се ресуспендират в 30 μL NEBuffer 2 без предварително елуиране на ДНК и се извършва PCR след улавяне (четири амплификационни цикъла, използващи универсални праймери на илюмина) върху ДНК, свързана с зърната чрез биотинилирана РНК. Библиотеките за улавяне на Hi-C бяха секвенирани в сдвоен край (Nextseq 500, Illumina).
Hi-C анализ за улавяне на промоутъра – конвейерът HiCUP63 беше използван за обработка на необработените четения на последователността на fastq. Този тръбопровод беше използван за картографиране на прочетените двойки спрямо генома на мишка (mm9), за филтриране на експериментални артефакти (като кръгови четения и повторни лигатури) и за премахване на дублирани четения. За данните от pc-HiC, получените BAM файлове бяха намалени и обработени с помощта на CHiCAGO версия 1.2.064, следвайки настройките по подразбиране за извикване на значими взаимодействия. Пълните подробности за този тръбопровод са налични от Babraham Bioinformatics
Cistanche може да подобри паметта
Инжектиране на стереотаксичен адено-асоцииран вирус
ArcCreERT2 мишки бяха анестезирани с авертин и за инфузия на AAV9-EF1a-DIO-hChR2-EYFP (серотип5, получен от UNC вирусно ядро). Първо беше направена малка дупка в черепа над дорзалния хипокампус (спрямо Брегма: предно-задна -2.0 и медиолатерална ± 1,5), спринцовка Хамилтън с 33-игла за измерване беше спусната до -1,8 DV и 500 ηl вирус се влива със скорост на потока от 50 ηl на минута в двата хипокампа. Иглата се изтегля след 10 минутен период след инжектиране и мишките се оставят да се възстановят в продължение на 4 дни.