Част Ⅰ Стойността на адюванта на Herba Cistanches, когато се използва в комбинация със статин в миши модели

Elaine Wat, Chun Fai Ng, Chi Man Koon, Cheng Zhang, Si Gao, Brian Tomlinson & Clara Bik San Lau

1 Институт по китайска медицина, Китайският университет в Хонг Конг, Шатин, Нови територии, Хонконг.

2 Държавна ключова лаборатория по фитохимия и растителни ресурси в Западен Китай, Китайският университет в Хонг Конг, Шатин, Нови територии, Хонг Конг.

3 Отдел по клинична фармакология, Катедра по медицина и терапия, Китайският университет в Хонг Конг, Шатин, Нови територии, Хонконг. Илейн Ват и Чун Фай Нг допринесоха еднакво за тази работа. Кореспонденцията и исканията за материали трябва да се адресират до CBSL (имейл: claralau@cuhk.edu.hk)

За повече информация: emily.li@wecistanche.com

Щракнете тук, за да получите повече информация за Cistanche

Резюме

Известно е, че статините имат проблеми с мускулната токсичност.Herbaцистанчии(HC) е китайска билка, традиционно използвана за болки в слабините и коленете. Нашето предишно in vitro проучване предполага, че може да предпази от индуцирана от статини мускулна токсичност. Обаче защитният ефект in vivo никога не е бил изследван. Целта на това изследване беше да се определи дали водният екстракт отHerbaЦистанче(HCE) може да предотврати индуцирана от симвастатин мускулна токсичност при плъхове и дали Herba Cistanche E може също така да окаже благоприятен ефект върху намаляването на индуцираната от диета с високо съдържание на мазнини хиперхолестеролемия и повишен чернодробен холестерол, като по този начин намалява дозата на симвастатин, когато се използва в комбинирана терапия. От нашите резултати, Herba Cistanche E значително възстановява индуцираното от симвастатин намаляване на мускулното тегло и намалява повишената плазмена креатин киназа при плъхове.HerbaЦистанчеЕ също подобрява предизвиканото от симвастатин намаляване на нивата на глутатион в мускулите, потенциала на мускулната митохондриална мембрана и намалява индуцираното от симвастатин мускулно възпаление. Освен това, HCE може да упражни намаляване на теглото на черния дроб, нивата на общите чернодробни липиди и нивата на плазмените липиди при мишки, хранени с високо съдържание на мазнини. В заключение, нашето проучване предостави in vivo доказателства, чеHerba ЦистанчеE има потенциални защитни ефекти върху индуцираната от симвастатин токсичност в мускулите, както и благоприятни ефекти върху индуцираната от диета неалкохолен мастен черен дроб и хиперлипидемия, когато се използва самостоятелно или в комбинация със симвастатин в намалена доза.

Инхибиторите на HMG-CoA редуктазата, известни също като статини, са добре документирани като полезни за пациенти с хиперхолестеролемия с умерен и висок риск от сърдечно-съдови заболявания1. Статините, един от най-продаваните класове лекарства с рецепта в света, действат чрез инхибиране на редуцирането на HMG-CoA до мевалонова киселина по време на ранния етап от пътя на мевалоната, за да намалят ендогенния синтез на холестерол2, 3. Въпреки че статините обикновено се понасят добре, , един от най-важните и добре известни клинични нежелани реакции са аномалиите на скелетната мускулатура, които могат да варират от доброкачествена миалгия до тежка миопатия4, 5. В голямо проучване сред 10 409 френски субекти, проведено чрез телефонно интервю, 10 процента от пациентите, получаващи лечението със статини съобщава за мускулни симптоми, от които 30 процента от тези симптоматични пациенти са довели до прекъсване на лечението6. Работната група за безопасност на статините на Националната липидна асоциация е предоставила препоръки за управление на мускулно-свързани симптоми при пациенти, подложени на терапия със статини. По принцип се препоръчва при пациенти с тежки симптоми като повишена креатинкиназа (CK) повече от 5 × ULN, приемът на статини да се спре, докато нивото на CK се нормализира отново5. Поради появата на тези странични ефекти и че не съществува ефективно лечение за индуцирана от статини мускулна токсичност, следователно има нужда да се търсят нови терапии за управление на индуцирани от статини мускулни проблеми.

Въпреки че се предлага смесица от механизми, които биха могли да бъдат отговорни за неблагоприятните ефекти на статина, се смята, че митохондриалните механизми са замесени в неблагоприятните ефекти от мускулната токсичност на статина1. Мевалонатът е не само прекурсор на холестерола, но е и прекурсор на важни съединения, като селенопротеини, долихол и убихинон7, 8. Статинът може да понижи селенопротеина като глутатион пероксидаза (GPx), компрометирайки антиоксидантната плътност и допринасяйки за нейните неблагоприятни ефекти ефекти4. Статините също могат да доведат до изчерпване на убихинон, причинявайки намалена консумация на кислород и синтез на АТФ9. Освен това, увеличаващите се in vitro и in vivo проучвания показват, че статинът може също така да действа директно върху тъканните митохондрии, причинявайки повишени реактивни кислородни видове (ROS) и митохондриален оксидативен стрес, което води до клетъчна смърт и следователно допринася за увреждане на черния дроб и мускулите10, 11.

Herbaцистанчии, цялото изсушено растение наЦистанчеdeserticolaYC Ma (семейство Orobanchaceae) са паразитни растения, които растат предимно в пустинните райони на северен и североизточен Китай12. Според теорията на китайската медицина Herba Cistanches има вкус на сладко, топло и солено13. Това е ободряваща китайска тонизираща билка, която се използва предимно за лечение на бъбречна недостатъчност със симптоми като импотентност, безплодие, преждевременна еякулация. Това също е китайска билка, която традиционно се предписва на пациенти за болки в слабините и коленете и обикновено се използва в китайски формулировки за лечение на мускулни проблеми12, 14. Интересното е, че това също е в съответствие със съвременните научни изследвания, които демонстрират анти- -уморни дейности на богат на полизахариди и фенилетаноиди екстракт от Herba Cistanches при плъхове след тренировка чрез намаляване на мускулните увреждания и подобряване на съхранението на АТФ15. Освен това, скорошна работа показа, че метанолов екстракт от Herba Cistanches може да подобри генерирането на митохондриален АТФ16.Herbaцистанчиие също така доказано, че е силен антиоксидант и улавяне на свободните радикали в различни органи, намалявайки оксидативния стрес и активността на ROS in vivo проучвания 17, 18. В скорошно проучване, проведено от нашата лаборатория, ние демонстрирахме, че нашитеHerbaцистанчииводният екстракт значително предотвратява индуцираната от симвастатин токсичност в клетките на скелетните мускули L6, както и дозозависимо възстановено индуцирано от симвастатин намаляване на производството на АТФ в клетките L6, което предполага потенциала наHerbaцистанчииводен екстракт за защита срещу индуцирана от статини мускулна токсичност19. Въпреки това, in vivo доказателства липсват.

Следователно ние предположихме товаHerbaцистанчииводен екстракт (HCE) може да окаже благоприятен ефект върху индуцираната от симвастатин мускулна токсичност. По този начин, това проучване има за цел да определи дали употребата на HCE може да намали индуцираната от симвастатин мускулна токсичност, използвайки in vivo животински модел, и в допълнение, дали HCE може също така да окаже благоприятен ефект върху намаляването на индуцираната от диета с високо съдържание на мазнини хиперхолестеролемия и повишен холестерол в черния дроб , като по този начин се намалява използваната доза симвастатин.

Материали и методи

Удостоверяване и извличане на билкови материали.

Сурови билкови суровини отHerbaцистанчии(Cistanche deserticola, произхождащ от Вътрешна Монголия) е закупен от Zi Xin, известен доставчик в Гуанджоу, Китай. Herba Cistanches е химически удостоверена с помощта на тънкослойна хроматография и ултра-ефективна течна хроматография в съответствие с Китайската фармакопея 201013, както е описано по-горе19, свербаскозидиехинакозид(закупен от Националния институт за контрол на фармацевтични и биологични продукти, Китай) като химически маркери. При химическо удостоверяване, ваучер за хербарен образец наHerbaцистанчиибеше депозиран в Музея на Института по китайска медицина към Китайския университет в Хонг Конг с номер на образеца на ваучер 2014-3434.

Herbaцистанчииводен екстракт се приготвя, както е описано по-горе19. Накратко, 1 kg сурова билка се накисва за 1 час, последвано от екстракция два пъти чрез нагряване за 1 час под обратен хладник при 100 градуса, като се използва 10x дестилирана вода. След това водните екстракти (HCE) се комбинират и филтруват и филтратът се концентрира при понижено налягане при 60 градуса. Концентрираният екстракт се лиофилизира до сухо. Процентът на добива е 50.1 процента w/w. Целият извлечен прах беше вакуумно опакован и съхраняван до употреба.

Опитни животни.

Симвастатин е закупен от SR Pharmasolutions Ltd. Мъжки плъхове Sprague Dawley (180–200 g) и мъжки мишки C57Bl/6J (на възраст 8- седмица) са доставени от Центъра за лабораторни услуги за животни, Китайския университет в Хонконг. Експериментите с животни бяха одобрени от Комитета по етика на експериментите с животни на Китайския университет в Хонг Конг (Реф. № 12/074/MIS). Всички експериментални методи бяха проведени съгласно одобрените насоки, определени от Комитета по етика на експериментите с животни на Китайския университет в Хонконг. Всички плъхове (3 животни на клетка) и мишки (5 животни на клетка) бяха настанени в нормални стандартни клетки при постоянна температура от 21 градуса с 12-h цикъл светло-тъмно. Всяка стандартна клетка съдържаше трепетлика като материал за постеля. На всички животни беше разрешен ad libitum достъп до диета и вода.

Изследване на индуцирана от статини мускулна токсичност при плъхове.

Всички плъхове бяха разделени на случаен принцип в 5 групи (n=5–10). Всички животни са били на нормална храна. Те също така получават дестилирана вода или симвастатин всеки ден и със или без HCE лечение интрагастрално. За животни, на които се изисква да се дава както симвастатин, така и HCE, HCE се дава 3 часа след приложението на симвастатин, за да се предотврати каквото и да е директно химично взаимодействие билка-лекарство. Билковият екстракт или симвастатин се разтварят в 0,5 процента метилцелулоза в дестилирана вода при известна концентрация. Предварително изчислен обем се дава интрагастрално на всяко животно в съответствие с теглото на индивида, така че изчисленият обем съдържа количеството от необходимата предложена доза. Подробностите за тези групи са както следва:

Група а) Нормална диета плюс дестилирана вода (нормална контролна група)

Група б) Диета с нормална храна плюс симвастатин (640 mg/kg)

Група в) Диета с нормална храна плюс симвастатин (640 mg/kg) плюс ниска доза HCE (1,1 g/kg животно)

Група d) Диета с нормална храна плюс симвастатин (640 mg/kg) плюс висока доза HCE (2,2 g/kg животно)

Група e) Диета с нормална храна плюс висока доза HCE (2,2 g/kg животно)

Приемът на храна се записва ежедневно и телесното тегло се измерва два пъти седмично. Лечението е проведено в продължение на 4 седмици. След това животните се анестезират с помощта на смес от кетамин (100 mg/kg) и ксилазин (10 mg/kg) интраперитонеално. Кръвта се изтегля чрез сърдечна пункция и се оставя да се съсири. След това плазмата се отделя чрез центрофугиране (3,000 rpm за 10 минути). Различни мускули (квадрицепс, gastrocnemius, soleus, tibialis anterior и extensor digitorumlongus) бяха изрязани и съхранени при -80 градуса до анализа.

Измерване на плазмената креатинкиназа. Активността на плазмената креатинкиназа (CK) се определя с помощта на комплекта Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430, Stanbio Laboratory, САЩ) съгласно инструкциите на производителя.

Измерване на мускулна глутатион пероксидаза. Мускулната глутатион пероксидаза (GPx) се измерва с помощта на наличния в търговската мрежа комплект (703102, Cayman Chemical, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. Накратко, мускулните тъкани се промиват с PBS при рН 7,4, за да се отстранят всякакви червени кръвни клетки, и се хомогенизират в 5–10 ml студен лизисен буфер, след което хомогенатът се центрофугира при 10,000 g за 15 минути при 4 градуса. След това супернатантата се отстранява и се анализира за GPx активност, като се използва търговският комплект.

Приготвяне на мускулни митохондриални и цитозолни фракции. Митохондриални и цитозолни фракции от мускулни проби се приготвят с помощта на комплект за изолиране на митохондрии (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. Накратко, пресни мускулни проби бяха предварително обработени с екстракционно масло, нарязани на малки парчета и хомогенизирани в екстракционен буфер. След това тъканните хомогенати се центрофугират. Супернатантата беше събрана и запазена за анализ на цитозолната фракция. След това митохондриалните пелети се промиват и центрофугират отново и се използват за анализ на митохондриалната фракция.

Измерване на мускулни митохондриални реактивни кислородни видове (ROS). ROS се измерва с протокола, модифициран от предишната литература20. Накратко, ROS се измерва от митохондриалната фракция (50 µg протеин/ml), като се използва разтвор на DCFDA (C6827, Invitrogen, САЩ). Сместа се инкубира при 37 градуса за 10 минути на тъмно, след което се инкубира със субстратен разтвор (10 mM пируват, 15 mM малат) за фотоактивиране. Интензитетът на флуоресценция се измерва на всеки 5 минути в продължение на 60 минути от BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG флуоресцентен четец на микроплаки при 485 nm възбуждане и 520 nm излъчване. Интензитетите на флуоресценция бяха изчислени за измерване на генерирането на ROS.

Мускулен митохондриален мембранен потенциал. Потенциалът на митохондриалната мембрана на митохондриалната фракция от мускулни проби се определя съгласно протокола на производителя (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, САЩ). Тази процедура е анализ с фиксирана точка, измерващ усвояването на JC-1 с образуването на J-агрегатите. Накратко, митохондриалната суспензия се разрежда, за да съдържа 20 µg протеин и се инкубира с JC-1 оцветяване за 7 минути при стайна температура. Тази 7-минута е време, оптимизирано и валидирано от производителя с помощта на различни съединения (както е посочено в протокола на производителя), тъй като наблюдаваната флуоресценция на разтвора ще се повиши до плато след 5–10 минути, последвано от драстично намаляване на флуоресценцията на JC-1 поради изравняване на концентрациите на JC-1 вътре и извън митохондриалната матрица. Интензитетът на флуоресценция беше измерен от BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader при 490 nm възбуждане и 590 nm излъчване. Интензитетите на флуоресценция бяха изчислени за измерване на потенциални градиенти.

Мускулна хистология и оценка на възпалението. Имунохистохимията на възпалителните клетки в мускулите се оценява чрез оцветяване с CD68 и CD163, както е описано по-горе 21–23. Бяха изрязани парафинови секции от 5 μm, прилепени към стъклени предметни стъкла Superfrost™ Plus (Menzel-Gläser, Германия). Първичните миши анти-плъхови CD68, ED1 и CD163 антитела, ED2 (Bio-Rad, САЩ) се прилагат към срезовете при разреждане 1:100. Специфично оцветяване беше открито от EnVision™ Systems (Dako, Дания), използвайки вторичното антитяло, EnVision-HRP полимер-конюгиран анти-миши IgG при разреждане 1:200, и открито с помощта на DAB разтвор (Dako, Дания), последвано чрез контраоцветяване с хематоксилин. След това секциите се монтират в дибутилфталат в хистон (DPX). Наличието на неутрофили в мускулите се открива чрез количествена имунохистохимия с помощта на софтуер ImageJ.

Анализ на мускулната генна експресия. PCR анализ, който профилира гени, свързани с оксидативния стрес, беше извършен с помощта на PCR-матрици за окислителен стрес на плъх и антиоксидантна защита (PARN-065Z, SABiosciences, Фредерик, САЩ). PCR масивът се извършва съгласно инструкциите на производителя. Накратко, общата РНК се изолира чрез селективно свързване към мембрана, базирана на силикагел, след лизис и хомогенизиране на мускулни проби в денатуриращ гуанидин тиоцианатен буфер (RNeasy kit, Qiagen). РНК се транскрибира обратно в сДНК с помощта на RT2 First Strand Kit (SABiosciences, Frederick, USA). След това тази сДНК беше добавена към RT2 SYBR Green qPCR Master Mix (SABiosciences, Фредерик, САЩ). След това всяка проба беше разделена на аликвотни части върху PCR-матрици за окислителен стрес и антиоксидантна защита на плъхове (SABiosciences, Фредерик, САЩ). Всички стъпки бяха извършени съгласно протокола на производителя.

Проучване на индуцирана от диета с високо съдържание на мазнини хиперлипидемия и чернодробна стеатоза при мишки.

Всички мишки бяха разделени на случаен принцип в 5 групи (n=8–10) и получиха следното: Група а) Диета с нормална храна (Таблица 1); Групи b до e) Диета с високо съдържание на мазнини (съдържа 21 процента мазнини и 0.15 процента холестерол) (Таблица 2). Дадени са диети за 8 седмици на животните, за да предизвикат затлъстяване. След 8 седмици, всички групи, хранени с високо съдържание на мазнини, получават дестилирана вода или симвастатин всеки ден и/или HCE лечение интрагастрално, 3 часа след приложението на симвастатин. Билковият екстракт или симвастатин се разтварят в 0,5 процента метилцелулоза (Sigma-Aldrich Corporation, САЩ) в дестилирана вода при известна концентрация. Предварително изчислен обем се дава интрагастрално на всяко животно в съответствие с теглото на индивида, така че изчисленият обем съдържа количеството от необходимата предложена доза. Подробностите за тези групи са както следва:

Група а) Нормална диета плюс дестилирана вода

Група b) Богата на мазнини диета плюс дестилирана вода

Група c) Диета с високо съдържание на мазнини плюс симвастатин (50 mg/kg)

Група d) Диета с високо съдържание на мазнини плюс HCE (4,4 g/kg)

Група e) Диета с високо съдържание на мазнини плюс симвастатин (25 mg/kg) плюс HCE (4,4 g/kg)

Приемът на храна се записва ежедневно и телесното тегло се измерва два пъти седмично. В края на 16-седмичното проучване всички мишки бяха умъртвени след 16-часово нощно гладуване. Животните бяха анестезирани със смес от кетамин (100 mg/kg) и ксилазин (10 mg/kg) интраперитонеално. Кръвта се изтегля чрез сърдечна пункция и се оставя да се съсири. Плазмата се отделя чрез центрофугиране (3,000 rpm за 10 минути). Черните дробове се изрязват и се съхраняват при -80 градуса до анализа.

Измерване на липидите в плазмата и черния дроб.

Плазмените триглицериди, холестерол (11488872216 и 11489232216, Roche Diagnostics, Швейцария), липопротеинов холестерол с висока и ниска плътност (L-тип HDL-C и L-тип LDL-C, Wako Pure Chemicals Industries, Япония) бяха измерени чрез ензимни методи, използвайки наличния в търговската мрежа комплект съгласно инструкциите на производителя. Активността на плазмената креатинкиназа (CK) се определя с помощта на Stanbio CK Liqui-UV® комплект (2910-430, Stanbio Laboratory, САЩ). Общите чернодробни липиди се определят гравиметрично след екстракция по метода на Bligh и Dyer24. Индивидуалните чернодробни липиди се определят количествено ензимно (както е описано по-горе) след разтваряне в изопропанол (Sigma-Aldrich, САЩ)25.

Чернодробна хистопатология и оценка на възпалението. Оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E оцветяване). Срезове от кърлежи (5 μm) от вградена в парафин тъкан се изрязват с микротом и се поставят върху микроскопски предметни стъкла SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, САЩ). Срезовете се подлагат на H&E оцветяване съгласно метода на Harris et al. 26 и монтиран с дибутил-фталат в хистон (DPX) (Sigma-Aldrich, САЩ) 25.

Mac-3 оцветяване и количествено определяне. Дебели участъци (5 μm) от вградена в парафин тъкан се изрязват с помощта на микротом и се поставят върху микроскопски предметни стъкла SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, САЩ). Беше извършено извличане на антиген, последвано от блокиране с Peroxidase Block (Dako Cytomation, Дания). Първично пречистено анти-мише Mac-3 антитяло (BD Pharmingen, САЩ) се прилага към срезовете при разреждане 1:50. Специфично оцветяване беше открито с помощта на EnVision™ Systems (Dako, Дания). Слайдовете се инкубират с вторичното антитяло, EnVision-HRP полимер-конюгиран анти-заешки IgG при разреждане 1:200. Mac-3 беше открит с помощта на DAB разтвор (Dako, Дания) и насрещно оцветен с хематоксилин. След това секциите бяха монтирани в DPX. Наличието на макрофаги в черния дроб се открива чрез количествена имунохистохимия с помощта на софтуера ImageJ.

Статистически анализ. Разликите между третираните и контролните групи бяха тествани с еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA), последван от posthoc теста за множествено сравнение на Bonferroni. Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на GraphPad Prism версия 6.0 (GraphPad, САЩ). Вероятност от p<0.05 would="" be="" considered="" statistically="">

Резултати

Ефект наHerbaЦистанчеE върху индуцирана от симвастатин мускулна токсичност при плъхове. Измерване на мускулно тегло и плазмена креатинкиназа. Пет различни вида мускули (квадрицепс, гастрокнемиус, солеус, тибиалис антериор и мускули екстензорен дигиторум дълъг) бяха изолирани от всички третирани плъхове. Ефектите от различните лечения върху мускулното тегло са показани на Фиг. 1а. Симвастатин (640 mg/kg) индуцира значително намаляване на теглото на мускулите на квадрицепсите, стомашно-чревния мускул и предния тибиален мускул при плъхове, докато тези намаления бяха значително възстановени от HCE върху мускулите на четириглавия мускул и стомашно-чревния мускул по дозозависим начин. Макар чеHerbaЦистанчеE проявява тенденция за възстановяване на теглото на предния тибиален мускул при плъхове, третирани със симвастатин, нито една от тези групи на лечение не е достигнала статистическа значимост. Не е наблюдаван значим ефект само от лечението с HCE върху мускулното тегло в сравнение с контролните плъхове (Фиг. 1а).

Фигура 1b показва ефектите от различните лечения върху нивата на плазмената креатин киназа (CK) при плъхове. Симвастатин индуцира значително повишаване на активността на креатин киназата при плъхове, което е значително намалено от едновременното лечение с HCE и при двете дози. Също така няма значителен ефект от лечението самостоятелно с HCE върху нивата на CK в сравнение с контролната група. Тъй като гастрокнемиусът изглежда е чувствителен към лечението със симвастатин и това е най-големият мускул, изолиран по маса, ние, следователно, избрахме този мускул за по-нататъшен анализ, включително измерване на мускулна глутатион пероксидаза (GPx), измерване на митохондриална MMP и ROS и мускулна хистология и оценка на възпалението .

Измерване на мускулна глутатион пероксидаза (GPx). Нивата на мускулна глутатион пероксидаза бяха измерени и показани на Фиг. 2а. Приложението на симвастатин предизвиква тенденция за намаляване на измерването на мускулната глутатион пероксидаза (GPx) при плъхове. Въпреки това, HCE проявява тенденция за подобряване на индуцираното от симвастатин намаляване на мускулния GPx и при двете дози от 1,1 g/kg и 2,2 g/kg. Също така няма значим ефект само от лечението с HCE върху мускулните нива на GPx в сравнение с нормалните контролни плъхове.

Митохондриален мембранен потенциал (MMP) и измерване на ROS. Лечението със симвастатин (640 mg/kg) индуцира значително намаляване на мускулната ММР (фиг. 2b). Това намаление е дозозависимо подобрено при плъхове, получаващи съвместно лечение с HCE и симвастатин (фиг. 2b). От друга страна, интересно е, че групата на лечение само със симвастатин има значително намалени нива на митохондриална ROS в мускулите в сравнение с нормалната контролна група (фиг. 2в). Въпреки това, лечението с HCE, дадено на плъхове, лекувани със симвастатин, проявява дозозависима тенденция за възстановяване на мускулните митохондриални ROS нива до нормалното ниво. Също така няма значителен ефект само от лечението с HCE при плъхове в сравнение с нормалната контролна група за измерване на митохондриална MMP и ROS.

Мускулна хистология и оценка на възпалението. Gastrocnemius мускули от плъхове, на които е дадено различно лечение, бяха допълнително анализирани хистологично и представителни оцветени срезове са показани на Фиг. 3а. Животните от контролната група показват хистологични срезове на нормални мускули. За разлика от това, H&E срезове от животни, третирани със симвастатин, разкриха инфилтрация на възпалителни маркери (жълти стрелки), която беше значително намалена в тези мускулни срезове на плъхове, дадени на комбинацията от симвастатин и HCE. Извършени са също така имунохистохимични анализи за наличието на макрофаги CD68 и CD163 съответно на Фигури 4а и 5а, с количествено определяне на съответните макрофаги, показани на Фигури 4b и 5b. Имунохистохимичният анализ на мускулни срезове разкрива наличието на макрофаг (CD68) в плъхове, третирани със симвастатин (кафяво оцветяване), което е значително намалено при плъхове, като се дава HCE съвместно лечение и при двете дози (фиг. 4b). Също така не е наблюдавано значително възпаление при животни, лекувани само с HCE. По подобен начин, имунохистохимичният анализ на мускулни срезове разкрива наличието на CD163-позитивни макрофаги при плъхове, третирани със симвастатин (кафяво оцветяване), което е значително намалено при плъхове, получаващи съвместно лечение с HCE при 2,2 g/kg (фиг. 5b). ). Също така не е наблюдавано значително възпаление при животни, лекувани само с HCE.

Анализ на мускулната генна експресия. За да се определят ефектите на симвастатин и HCE върху гени, свързани с оксидативния стрес в мускула, PCR анализ, който профилира гени, свързани с оксидативен стрес, беше извършен с помощта на PCR-матрици за окислителен стрес на плъх и антиоксидантна защита. Гените, които са били значително повлияни от лечението със симвастатин, са анализирани и представени на Фиг. 6. За профила на експресия на гени, регулиращи антиоксиданти, плъхове, третирани със симвастатин (640 mg/kg), повишават експресията на гени, регулиращи антиоксиданти. Това включва глутатион пероксидази (GPx) GPx1 и GPx7 и други пероксидази, включително Serpinb1b и клуб (фиг. 6а). HCE и при двете дози (1,1 или 2,2 g/kg) намалява тези индуцирани от симвастатин увеличения на GPxs и други пероксидази до нормални нива. От друга страна, само лечението с HCE значително повишава нивата на експресия на GPx1. По отношение на експресията на гени, регулиращи метаболизма на ROS, симвастатин значително индуцира експресия на други гени на метаболизма на супероксид, включително Cyba, Ncf1, Ncf2, Scd1 и Ucp2. По същия начин, HCE и при двете дози значително намалява тези увеличения (фиг. 6b). Освен това, симвастатин индуцира експресия на реагиращи на оксидативен стрес гени, включително Apoe, Ccl5 и Txn1, докато тези експресии са значително намалени при съвместно третирани с HCE животни и при двете дози (фиг. 6с). От друга страна, симвастатин причинява значително намаляване на генната експресия на Txnip. Няма значим ефект на HCE върху индуцираното от симвастатин намаляване на експресията на Txnip ген (фиг. 6с). Симвастатин също така упражнява значително увеличение в експресията на гени, регулиращи кислородните транспортери, включително Slc38a1 и Vim. Съвместното лечение с HCE намалява експресията на тези гени и при двете дози (фиг. 6d).

Ефекти от комбинираната употреба на Simvastatin и HCE върху приема на храна и телесното тегло при мишки. Фигура 7а показва дневния прием на храна на мишки за всички третирани групи. Диетата с високо съдържание на мазнини предизвиква значително увеличение на дневния прием на храна на животните в сравнение с животните, хранени с храна (p<0.001). there="" was="" however="" no="" significant="" effect="" of="" the="" herb="" or="" drug="" treatments="" among="" all="" high-fat-fed="" groups="" (fig.="">

Седмично измерване на телесното тегло. След 16 седмици на хранене с високо съдържание на мазнини, животните, хранени с HF, значително наддават на тегло, отколкото животните, хранени с храна (фиг. 7b). Въпреки това, няма значителен ефект между мишките, хранени с HF, и всички групи, хранени с HF, получаващи лечение. Също така няма значителна разлика между хранени с HF мишки, получаващи съвместно лечение със симвастатин и HCE спрямо мишки, хранени с HF, получаващи HCE или само лечение със симвастатин (Фиг. 7b).

Ефекти от комбинираната употреба на Simvastatin и HCE върху хиперлипидемия и чернодробна стеатоза при мишки. Измерване на активността на плазмените липиди и креатинкиназа. Нивата на плазмените липиди на всички мишки са показани на Фиг. 8. В сравнение с мишките, хранени с нормална храна, мишките, хранени с HF, имат значително повишени нива на плазмен общ холестерол (ТС), които са значително намалени във всички групи на лечение (Фиг. 8а) . Мишки, хранени със сърдечна недостатъчност, лекувани със симвастатин и HCE, имат значително по-нисък плазмен TC в сравнение с животни със сърдечна недостатъчност, на които е приложен само симвастатин или животни със сърдечна недостатъчност, на които е даден само HCE (p<0.001 and=""><0.01, respectively)="" (fig.="" 8a).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" simvastatin="" alone="" treatment="" group,="" suggesting="" hce="" has="" comparable="" effects="" as="" simvastatin.="" besides,="" hf-fed="" mice="" also="" had="" significantly="" higher="" plasma="" triglyceride="" (tg)="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" a="" normal="" chow="" diet=""><0.05) (figure="" 8b).="" there="" was="" a="" trend="" for="" a="" reduction="" in="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" on="" plasma="" tg="" in="" hf-fed="" animals,="" though="" this="" did="" not="" reach="" statistical="" significance.="" however,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" significantly="" reduced="" plasma="" tg="" compared="" to="" control="" hf-fed="" animals=""><0.001 and=""><0.01, respectively).="" when="" comparing="" between="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" with="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" group,="" hce="" co-treatment="" with="" simvastatin="" had="">

по-нисък плазмен TG в сравнение с мишки, хранени с HF, на които е дадено само лечение със симвастатин (стр<0.01) (fig.="" 8b).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" the="" simvastatin="" treatment="" group,="" though="" hce="" had="" a="" slightly="" better="" reduction="" in="" tg="" levels.="" in="" addition,="" high-fat-diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" high-density="" lipoprotein="" (hdl)="" cholesterol="" and="" plasma="" low-density="" lipoprotein="" (ldl)="" cholesterol="" in="" mice="" compared="" to="" normal="" chow-fed="" animals="" (fig.="" 8c="" and="" d).="" simvastatin="" treatment="" alone="" significantly="" reduced="" both="" lipids="" in="" high-fat-fed="" mice.="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" also="" significantly="" reduced="" both="" types="" of="" plasma="" lipids="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone.="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" both="" lipids="" among="" all="" treatment="" groups.="" figure="" 8e="" showed="" the="" effect="" of="" different="" treatments="" on="" plasma="" creatine="" kinase="" (ck)="" levels.="" interestingly,="" hf="" diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels="" in="" mice="" compared="" to="" normal-chow-fed="" mice="" (fig.="" 8e).="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" the="" co-treatment="" of="" simvastatin="" significantly="" reduced="" plasma="" ck="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone=""><0.01 and=""><0.01, respectively).="" simvastatin="" treatment="" alone="" also="" significantly="" reduced="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels.="" there="" was="" also="" no="" significant="" difference="" in="" plasma="" ck="" levels="" among="" all="" active="" treatment="" groups="">измерване на iver липиди.

Ефектите на различните групи на лечение върху индуцираната от HF хепатомегалия (увеличен черен дроб) са свързани със значително намаляване на общото съдържание на чернодробни липиди, изразено като милиграм липиди на черен дроб (Фиг. 9а). Общото съдържание на чернодробни липиди е значително по-високо при мишки, хранени с HF, в сравнение с мишки, хранени с нормална храна (30-пъти по-високо, p<0.001). simvastatin="" exerted="" no="" significant="" effect="" on="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" total="" liver="" lipid.="" interestingly,="" hce="" significantly="" reduced="" such="" a="" diet-induced="" increase="" in="" liver="" lipid=""><0.05). on="" the="" other="" hand,="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" exerted="" a="" trend="" to="" reduce="" the="" liver="" lipid="" content="" though="" did="" not="" reach="" statistical="" significance="" (p="0.15)." however,="" when="" comparing="" the="" liver="" lipid="" content="" among="" all="" treatment="" groups,="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" all="">

Както е показано на Фиг. 9b и c, измерването на общия чернодробен холестерол (TC) и чернодробните триглицериди (TG) разкри, че мишките, хранени с HF, имат повишени нива и на двата липида в сравнение с мишките, хранени с нормална храна (т.е. 3.{{4} }кратно увеличение на TC, p<0.001; and="" 3.4-fold="" increase="" in="" tg,=""><0.001). simvastatin="" treatment="" significantly="" reduced="" liver="" total="" cholesterol="" levels=""><0.05) but="" not="" triglyceride="" levels.="" on="" the="" other="" hand,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment,="" significantly="" reduced="" both="" liver="" total="" cholesterol="" and="" triglyceride="" levels="" in="" high-fat-fed="" mice.="" when="" comparing="" the="" effects="" among="" all="" groups,="" we="" observed="" no="" significant="" difference="" in="" liver="" total="" cholesterol,="" but="" there="" was="" a="" significant="" reduction="" in="" liver="" tg="" for="" the="" hce="" treatment="" group="" as="" compared="" to="" the="" simvastatin="" treatment="" group="" (fig.="" 9b="" and="">

Оценка на чернодробно възпаление. Извършено е имунохистохимично оцветяване за оцветяване за наличие на макрофаги (Mac-3) (Фиг. 10а). Имунохистохимичният анализ на чернодробни срезове разкри наличието на Mac-3 както при хранени с високо съдържание на мазнини, така и при нормално хранени с храна мишки (кафяво оцветяване). Това възпаление се увеличава допълнително при животни, лекувани със симвастатин, въпреки че такова увеличение не достига статистическа значимост. Интересно е, че лечението с HCE, със или без съвместно лечение със симвастатин, значително намалява възпалението при мишките, хранени с високо съдържание на мазнини. При сравняване между всички групи на лечение, лечението с HCE, със или без съвместно лечение със симвастатин също има значително по-ниско възпаление в сравнение с групата на лечение със симвастатин (p<0.001 and=""><0.001, respectively).="" these="" data="" are="" also="" presented="" as="" percentage="" areas="" in="" fig.="">

Продължавай да четеш ...