ЧастⅠ: Тубуларна митохондриална AKT1 се активира по време на исхемично реперфузионно увреждане и има критична роля в предразположението към хронично бъбречно заболяване.
Apr 03, 2023
Резюме
Бъбречната тубулна дисфункция може да доведе до остро бъбречно увреждане и трансформация в хронично бъбречно заболяване. Въпреки че тубулните митохондрии са свързани с патофизиологията на бъбречната недостатъчност, механизмът е неясен. Тук ние демонстрираме, че исхемично-реперфузионното увреждане предизвиква остра транслокация и активиране на митохондриална протеин киназа B (известна също като AKT1) в бъбречните тубули. Ние предположихме, че митохондриалното AKT1 сигнализиране може да предотврати развитието на остро бъбречно увреждане и последващо хронично бъбречно заболяване. За да тестваме тази прогноза, ние използвахме стратегията Cre-Lox, за да генерираме два нови специфични за бъбречните тубули трансгенни щама на мишка, които индуцираха експресия или на насочен към митохондриите доминантно-отрицателен AKT1, или на конститутивно активен AKT1. при насочени към митохондриите доминантни AKT1-отрицателни мишки, инхибирането на митохондриална AKT1 влоши отрицателно азотемията, тубулното увреждане, бъбречната фиброза, гломерулосклерозата и оцеляването след исхемично-реперфузионно увреждане. За разлика от това, при насочени към митохондриите конститутивно активни AKT1 мишки, усиленото тубуларно митохондриално AKT1 сигнализиране отслабва бъбречното увреждане, защитава бъбречната функция и значително подобрява преживяемостта след исхемично-реперфузионно увреждане (съответно 76,9 процента срещу 20,8 процента). Когато митохондриалната AKT1 беше инхибирана, беше установено увеличаване на несвързаното митохондриално дишане и оксидативен стрес в бъбречните тубули, което подкрепя ролята на митохондриалната дисфункция в патофизиологията на бъбречната недостатъчност. По този начин нашето проучване предполага, че тубулният митохондриален AKT1 сигнален път може да бъде нова цел за разработването на нови стратегии за по-добро предотвратяване и лечение на бъбречно увреждане.
Преводна декларация
Острото бъбречно увреждане (ОПН) и последващото развитие на хронично бъбречно заболяване (ХБН) са основни здравословни проблеми. Разработихме трансгенен миши модел и определихме ролята на AKT активирането на проксималните бъбречни тубулни митохондрии при AKI и CKD. Този спасителен механизъм на бъбречна защита може да бъде нова цел за разработване на нови стратегии за по-добро предотвратяване и лечение на AKI и CKD. Бъдещите проучвания трябва да потвърдят участието на митохондриалния AKT сигнален път в увреждане на човешкия бъбрек и да изследват лекарствените цели на митохондриалния AKT1 път.
Ключови думи
Митохондриален Akt1; Нараняване поради отказ от исхемия; Остра бъбречна травма; Хронично бъбречно заболяване;Екстракт от цистанче.
Щракнете тук, за да получитеCistanche има ползи за бъбреците
Въведение
Острото бъбречно увреждане (ОПН) и последващото развитие на хронично бъбречно заболяване (ХБН) са основни здравословни проблеми. Понастоящем специфичните медицински лечения за тези болестни състояния са ограничени, отчасти поради липсата на разбиране на молекулярните механизми, които са в основата на бъбречното увреждане. Бъбрекът е един от най-изискващите енергия органи в тялото и митохондриите, които са необходими за улесняване на активния транспорт, поддържане на правилни електрохимични градиенти и регулиране на хомеостазата на течностите, са основният източник на клетъчно производство на АТФ чрез окислително фосфорилиране. смущенията в производството на АТФ и митохондриалната дисфункция могат да доведат до повишено производство на реактивни кислородни видове (ROS), което от своя страна уврежда функцията на бъбречните клетки и предизвиква клетъчна смърт. Въпреки че се съобщава за митохондриално увреждане и дисфункция при пациенти с бъбречно заболяване и животински модели на остро и хронично бъбречно увреждане, познаването на патофизиологичната роля на митохондриите при бъбречно увреждане остава непълно.
Подобрената митохондриална функция може да предотврати исхемично-реперфузионно увреждане (IRI). По време на исхемичната фаза на IRI, изчерпването на кислорода инхибира трансфера на електрони в митохондриалната дихателна верига и намалява производството на АТФ. Последващият приток на натриеви йони и изтичане на протони спомагат за възстановяване на нормалното рН и могат да насърчат клетъчното оцеляване чрез възстановяване на вътреклетъчния обем. По време на реперфузия, възстановяването на кръвния поток е свързано с повишени реактивни кислородни видове (ROS), Ca2 плюс вътрешен поток към митохондриите, загуба на митохондриални трансмембранни електрохимични градиенти и активиране на апоптотични пътища Тези вътреклетъчни промени могат да бъдат пагубни за клетките, които оцеляват след първоначално исхемично увреждане.
AKI е по-често при хоспитализирани пациенти и може да ускори появата на нова ХБН, да изостри съществуваща ХБН и да доведе до бъбречна смърт. Механизмите, лежащи в основата на прехода от AKI към ХБН, не са ясни. Скорошни проучвания върху животни предполагат, че бъбречната тубулна дисфункция играе важна роля в прогресията на AKI към CKD, отразявайки прехода от AKI към CKD при хора. Разбирането на сигналните пътища, които регулират увреждането на бъбреците, ще ни позволи да идентифицираме нови терапевтични цели за смекчаване на увреждането на бъбреците и предотвратяване на прогресирането на AKI към ХБН.
Връзката между цитоплазмените сигнални пътища и митохондриалната функция по време на бъбречно увреждане е до голяма степен неизвестна. Митохондриалната функция е тясно свързана с цитоплазмената сигнализация, други органели и ядрени пътища. Нашата лаборатория идентифицира активирането и транслокацията на AKT1 към митохондриите като ключова стъпка в защитата на кардиомиоцитите от увреждане на IRI чрез регулиране на комплексите за окислително фосфорилиране, повишаване на ефективността на окислителното фосфорилиране и намаляване на ROS. Въпреки това, дали IRI може да предизвика транслокация на активиран AKT1 от цитоплазмата към митохондриите в бъбречните тубули, не е известно. Ако митохондриалната AKT1 може да се активира в бъбречните тубули в отговор на бъбречно увреждане, би било важно да се оцени патофизиологичната роля на митохондриалната AKT1 в развитието на остро бъбречно увреждане (AKI) и хронично бъбречно заболяване (CKD). Тук използвахме два индуцируеми специфични за бъбречните тубули трансгенни миши модела, които модулират митохондриалното AKT1 сигнализиране in vivo и демонстрирахме защитната роля на активирането на бъбречните тубулни митохондриални AKT1 по време на IRI срещу AKI и последващо развитие на CKD.
Cistanche добавки
Резултати
Активиране на митохондриален AKT1 в бъбречните тубули при IRI
Първо проучихме дали IRI активира AKT1 в бъбречните митохондрии. За тази цел създадохме бъбречен IRI модел чрез лигиране на лявата бъбречна артерия за 30 минути, последвано от контралатерална нефректомия (Nx). Лигирането на лявата бъбречна артерия беше обърнато, за да се прекрати исхемичната фаза, беше извършена реперфузия и левият бъбрек беше събран в посочения интервал от време.
Бъбречната кора, обогатена с бъбречни тубули, се изолира и митохондриите се приготвят чрез субфракциониране. При реперфузия, изобилието на митохондриални pAKT1 и AKT1 се увеличава, което предполага транслокация на активиран AKT1 в митохондриите (Фигура 1А). Това е подобно на това, което наблюдавахме в миокарда в сравнение с фиктивно оперирани контроли или контроли с резециран бъбрек, където митохондриалната AKT1 беше значително повишена 30-60 минути след реперфузия (Фигура 1A и B) (n= 11-15). Митохондриалният pAKT1 също беше повишен. Тези резултати предполагат, че IRI-индуцираното активиране и транслокация на AKT1 към бъбречните митохондрии. iHC оцветяването потвърди фосфорилирането на AKT1 в бъбречните тубули след IRI (Фигура 1C). Фоновото оцветяване за pAKT1 е минимално в бъбречните тубули на фиктивно оперирани контроли, докато pAKT1 е драматично повишен в бъбречните тубули след IRI (фигури 1C и 1D). Не се наблюдава pAKT1 в никоя бъбречна област с изключение на тубулите. за потвърждаване на субклетъчната локализация на pAKT1 в тубулите, pAKT1 се оцветява в комбинация с митохондриални маркери. значителна съвместна локализация на pAKT1 и митохондрии се наблюдава в бъбречни тубулни клетки при IRI (Фигура 1E). Заедно тези резултати предполагат транслокация на IRI и активиране на AKT1 към митохондриите.
Фигура 1. Индуцирана от исхемия реперфузия остра транслокация и активиране на AKT1 в бъбречни митохондрии.
Генериране на трансгенни мишки с индуцируема специфична за бъбречните тубули експресия на доминантно отрицателно AKT в митохондриите
За да тестваме хипотезата, че активирането на бъбречния тубуларен митохондриален AKT1 по време на IRI предпазва бъбрека от AKI и последващо развитие на ХБН, ние генерирахме трансгенен миши модел, който позволява индуцирана от тамоксифен (TAM) експресия на тубулно-специфично митохондриално насочване на доминантно-отрицателен AKT1. Доминантно отрицателни AKT1 (mdnAKT) и митохондриални насочени последователности бяха добавени към N края. Условната експресия на тамоксифен на AKT1 трансгени се медиира с помощта на pCALNL (вижте Материали и методи). За да се изключат объркващи ефекти, свързани с произволната интеграция на трансгенни масиви в генома, едно копие на трансгена беше въведено чрез хомоложна рекомбинация в ES клетки с целеви трансгени в Gt(ROSA) 26 или локуса на хромозома. Двугенни мишки (KMDAKT) бяха получени чрез кръстосване на tam-индуцирани от mdnAKT мишки с хемизиготни KSP-CreERT2 мишки, където tam-индуцираната Cre активност се задвижваше от специфичните за бъбречните тубулни клетки калмодулин 16 промотори. tam инжектиране индуцира Cre активност, изолирани митохондрии и SDS-PAGE разделени митохондриални протеини за имуноблотинг. Резултатите показват, че TAM успешно индуцира експресията на мутант AKT1. Мутантният протеин е неоткриваем при мишки KMDAKT, мишки KSPCreERT2 и мишки от див тип (инжектиране на царевично масло).
За да се провери експресията, специфична за бъбреците, митохондриалните протеини бяха извлечени от различни тъкани след инжектиране на TAM. his-маркираният мутант AKT1 се експресира само в бъбрека. Бъбречните срезове бяха оцветени с анти-his-tag антитела и митохондриален Mitotracker за имунофлуоресцентно изобразяване. Резултатите показват, че всички мутанти AKT1 са оцветени с His-tag антитяло и локализирани в митохондриите. Не са открити AKT1 мутации в гломерулите. Ензимната активност на митохондриалния AKT1 беше анализирана с помощта на рекомбинантен GSK3, за да се потвърди основна отрицателна роля в митохондриите на там-третирани KMDAKT тубули. Тъй като митохондриалният AKT1 на бъбречните тубули се активира от IRI, ние сравнихме ензимната активност на AKT1 в митохондриите, изолирани от мишки, третирани с tam, и мишки, третирани с царевично масло след IRI. Резултатите показват, че активността на бъбречната митохондриална AKT1 е значително инхибирана при третирани с TAM KMDAKT мишки. Следователно, тази трансгенна линия на мишка е добър модел за изследване на ролята на AKT1 в тубулните митохондрии.
Cistanche ползи
Инхибирането на митохондриалната AKT на бъбречните тубули влошава IRI in vivo
IRI се индуцира при едностранна бъбречна исхемия. В последната серия от експерименти фосфорилираният AKT1 беше едва откриваем в митохондриите на проксималните бъбречни тубули. Не са наблюдавани значителни разлики в бъбречната хистология, урейния азот в кръвта (BUN) и серумния креатинин (Cr) при KMDAKT мишки, инжектирани с царевично масло и там инжектирани, което предполага, че митохондриалното AKT1 сигнализиране няма значителна роля в бъбречната структура и функция на изходно ниво преди индуцирането на IRI. За да се изследва дали митохондриалният AKT1 играе защитна роля по време на IRI, едностранният IRI се използва за индуциране на AKI при мишки с царевично масло или TAM-KMDAKT мишки. няма разлики в нивата на BUN или Cr, получени веднага след индуцирането на IRI, но при TAM-KMDAKT мишки нивата на BUN и Cr са значително повишени след 45 дни. Тези резултати предполагат, че блокираното активиране на митохондриален AKT1 в бъбречните тубули по време на IRI влошава късното развитие на бъбречна дисфункция. хистологичният анализ на H&E-оцветени бъбречни срезове показва, че бъбречното увреждане е изострено при TAM-KMDAKT мишки. Резултатът на Jablonski за бъбречно тубулно увреждане е по-висок със загуба на границата на тубулната четка, тубулен лизис и повече отломки в тубулния лумен (p=0.018). За да изключим ефекта на TAM или Cre рекомбиназа, ние също анализирахме TAM-инжектирани KSP/CreERT2 мишки и резултатите на Jablonski бяха сходни при KMdakt и TAM-KSP/CreERT2 мишки на ден 7 след IRI (Фигура 3D) (p{{ 19}}.7613). Тези данни предполагат, че нашите открития не са объркани от ефектите на TAM или Cre рекомбиназа. При TAM-KMDAKT мишки след IRI трихромното оцветяване на Masson показва по-висока фиброзна площ (процент) (p<0,001), придружена от нарушени тубулни структури с интралуминални отливки и отломки. експресията на col1a беше увеличена, в съответствие с трихромното оцветяване на Masson. Експресията на tGF не се повишава, което предполага, че митохондриалният AKT1 не регулира възпалителния отговор. След IRI експресията на маркера за тубулно увреждане - KIM -1 се повишава в групата на TAM-KMDAKT, потвърждавайки увеличеното бъбречно увреждане в групата на TAM-KMDAKT (p=0.002).
Оцветяването с TUNEL се използва за оценка на апоптозата на бъбречните клетки. Броят на апоптотичните клетки беше значително увеличен в тубулите (p{{0}}.0054) и гломерулите (p<0,001) на TAM-KMDAKT мишки в сравнение с контролната група. Предполага се, че инхибирането на тубуларния митохондриален AKT1 по време на IRI изостря тубулната клетъчна смърт и гломерулното увреждане. В съответствие с това, активирането както на каспаза 9 (промотор), така и на каспаза 3 (изпълнител) е значително повишено в TAM-KMDAKT бъбречни тубулни епителни клетки. За по-нататъшно изследване на хроничните гломерулни промени беше извършен анализ на оцветяване с периодична киселина-Шиф (PAS) върху бъбречни срезове за количествено определяне на гломерулосклерозата. Въпреки че не е наблюдавана разлика в гломерулосклерозата на 7 дни след IRI (p=0.2634), повече гломерулосклероза е открита при TAM-KMDAKT мишки на 45 дни след IRI (p<0,001). Това откритие предполага, че бъбречната тубулна митохондриална AKT сигнална пътека може да регулира образуването на гломерулен белег по време на развитието на ХБН. Анализът на преживяемостта на Kaplan-Meier показа ефекта от инхибирането на тубулната митохондриална AKT върху резултата от IRI. Преживяемостта е намалена след IRI при TAM-KMDAKT мишки в сравнение с контролите (p=0.0013).
Степента на преживяемост на мишките TAM-KMDAKT е значително по-ниска от тази на контролите в рамките на 7 дни след IRI, но нивата на BUN/Cr на мишките TAM- и KMDAKT с царевично масло са сходни през този период. Докладваните промени на BUN/Cr при мишки, третирани с TAM, може да са били подценени поради липсата на данни за BUN/Cr от мъртви мишки. В допълнение, по-високата смъртност при мишките TAM-KMDAKT може да бъде причинена от дисфункция на дистални органи (бял дроб, сърце, мозък), а не просто BUN/Cr промени.
Ролята на тубуларния митохондриален AKT1 също беше оценена при женски KMDAKT мишки. серумният BUN/Cr и бъбречната хистология са относително по-високи при TAM-KMDAKT женски мишки 45 дни след IRI. Не се наблюдава значим полов ефект.
Билкова цистанче
ПРЕПРАТКИ
1. Yang JY, Deng W, Chen Y и др. Нарушена транслокация и активиране на активността на митохондриален Akt1 смекчен митохондриален оксидативен фосфорилиращ комплекс V в диабетен миокард. J Mol Cell Cardiol. 2013; 59: 167-175.
2. Wang Z, Ying Z, Bosy-Westphal A, et al. Специфични метаболитни скорости на основните органи и тъкани в зряла възраст: оценка чрез механистичния модел на разхода на енергия в покой. Am J Clin Nutr. 2010; 92 (6): 1369–77.
3. Li SY, Susztak K. Ролята на гама коактиватор 1алфа (PGC-1алфа), активиран от пероксизомен пролифератор, при бъбречно заболяване. Семин Нефрол. 2018; 38 (2): 121–6.
4. Portilla D, Dai G, McClure T, et al. Промени на PPARalpha и неговия коактиватор PGC-1 при индуцирана от цисплатин остра бъбречна недостатъчност. Kidney Int. 2002;62(4):1208–18.
5. Forbes JM. Митохондриите - силни играчи в бъбречната функция? Тенденции Endocrinol Metab. 2016; 27 (7): 441–4425.
6. Szeto HH, Liu S, Soong Y, et al. Подобряването на митохондриалната биоенергетика при исхемични състояния повишава толерантността към топла исхемия в бъбреците. Am J Physiol Renal Physiol. 2015; 308 (1): F11– F21.6.
7. Kalogeris T, Baines CP, Krenz M, et al. Клетъчна биология на исхемично/реперфузионно увреждане. Int Rev Cell Mol Biol. 2012; 298: 229-317.
8. Gracia-Sancho J, Casillas-Ramirez A, Peralta C. Молекулярни пътища за защита на черния дроб от исхемия/реперфузионно увреждане: актуализация от 2015 г. Clin Sci (Лондон). 2015; 129 (4): 345–62.
9. Вижте EJ, Jayasinghe K, Glassford N, et al. Дългосрочен риск от неблагоприятни резултати след остро бъбречно увреждане: систематичен преглед и мета-анализ на кохортни проучвания, използващи консенсусни дефиниции на експозиция. Kidney Int. 2019; 95 (1): 160–72.
10. Szeto HH, Liu S, Soong Y, et al. Защитата на митохондриите след остра исхемия предотвратява продължителното регулиране нагоре на IL-1бета и IL-18 и спира ХБН. J Am Soc Nephrol. 2017; 28 (5): 1437–49.
11. Tran MT, Zsengeller ZK, Berg AH, et al. PGC1alpha задвижва биосинтезата на NAD, свързвайки окислителния метаболизъм с бъбречната защита. Природата. 2016; 531 (7595): 528–32.
12. Tait SW, Green DR. Митохондрии и клетъчна сигнализация. J Cell Sci. 2012; 125 (Pt 4): 807–815.
13. Deng W, Leu HB, Chen Y, et al. Протеин киназа B (PKB/AKT1) образува сигнални комплекси с митохондриални протеини и предотвратява гликолитична енергийна дисфункция в култивирани кардиомиоцити по време на исхемично-реперфузионно увреждане. Ендокринология. 2014; 155 (5): 1618–28.
14. Kanegae Y, Lee G, Sato Y и др. Ефективно генно активиране в клетки на бозайници чрез използване на рекомбинантен аденовирус, експресиращ сайт-специфична Cre рекомбиназа. Nucleic Acids Res. 1995; 23 (19): 3816–21.
15. Matsuda T, Cepko CL. Контролирана експресия на трансгени, въведени чрез in vivo електропорация. Proc Natl Acad Sci US A. 2007 1 16;104(3):1027–32.
16. Lee SA, Cozzi M, Bush EL, et al. Дисфункция на отдалечен орган при остро бъбречно увреждане: преглед. Am J Kidney Dis. 2018; 72 (6): 846–856.
Hugo YH Lin1,2,3,4, Вкусно Чен1, Ю-Хан Чен1, Алберт П. Та1,2, Хсиао-Чен Лий1,5, Грант Р. Макгрегър6, Носратола Д. Вазири1,2, Пинг Х. Уанг1,2,7
1. UC Irvine Diabetes Center и Катедра по медицина, Калифорнийски университет, Ървайн, Калифорния
2. Катедра по физиология и биофизика, Калифорнийски университет, Ървайн, Калифорния
3. Катедра по медицина, Медицински университет в Каосюн, Гаосюн, Тайван
4. Отделение по вътрешни болести, Общинска болница Ta-Tung в Kaohsiung, Тайван
5. Катедра по пластична хирургия, Медицински университет в Каосюн, Каосюн, Тайван
6. Катедра по развитие и клетъчна биология, Калифорнийски университет, Ървайн, Калифорния
7. Катедра по диабет, ендокринология и метаболизъм, Национален медицински център „Град на надеждата“, Дуарте, Калифорния
