Част 1: Нов подход за подобряване на регенеративния потенциал на циркулиращите ендотелни прогениторни клетки при пациенти с краен стадий на бъбречно заболяване

За повече информация. контактtina.xiang@wecistanche.com

Резюме: Циркулиращите ендотелни прогениторни клетки от костен мозък (ЕРС) улесняват възстановяването на съдовете в няколко органа, включително бъбреците, но прогресивно намаляват в крайния стадийзаболяване на бъбреците(ESKD) пациенти, което корелира със сърдечносъдовите резултати и свързаната смъртност. По този начин ние определихме дали повишаването на тъканно-репаративните ефекти на мезенхимни стромални клетки, получени от човешки костен мозък (BM-MSCs) с васкулогенните ефекти на рекомбинантния човешки релаксин (RLX), може да насърчи пролиферацията и функцията на EPC. CD34 плюс EPCs бяха изолирани от кръвта на здрави пациенти и пациенти с ESKD, култивирани до образуването на късни EPCs, след това стимулирани с получена от BM-MSC кондиционна среда (CM; 25 процента o), RLX (1 или 10 ng/mL), или и двете комбинирани лечения. Докато RLX самостоятелно стимулира пролиферацията на EPC, образуването на капилярни тръби и зарастването на рани in vitro, тези мерки бяха по-бързо и значително подобрени от комбинираните ефекти на получените от BM-MSC CM и RLX в EPCs, получени както от здрави, така и от ESKD пациенти. Тези констатации имат важни клинични последици, като са идентифицирали нова комбинирана терапия, която може да възстанови и подобри броя и функцията на EPC при пациенти с ESKD.

Ключови думи: ендотелни прогениторни клетки; краен стадий на бъбречно заболяване; мезенхимни стволови клетки, получени от костен мозък; релаксин; заздравяване на рани; ангиогенеза; регенерация

Щракнете тук, за да научите повече за цистанче за продажба

1. Въведение

Хронично бъбречно заболяване(CKD) е глобален здравен проблем, дефиниран като намаляване на скоростта на гломерулна филтрация (GFR) по-малко от или равно на 60mL/min/1,73m², което често води до краен стадий (стадий V) бъбречно заболяване (ESKD; дефинирано като GFR По-малко или равно на 15 mL/min/1,73 m2)[2]. Патологичните характеристики на ХБН включват тубулна атрофия, свързана с намаляване на бъбречните капиляри и подоцити, разрушаване на бъбречните ендотелни клетки и развитието набъбречна фиброза[3,4]. Бъбречният ендотел е компрометиран по време на тези процеси, което води до нарушена ангиогенеза и бъбречна функция [5]. Следванеувреждане на бъбреците, получените от костен мозък ендотелни прогениторни клетки (ЕРС) се набират към местата на нараняване, за да се улесни възстановяването на тъканите [6]. EPC играят основна роля в съзряването и пролиферацията на бъбречните ендотелни клетки, съдовата цялост и възстановяването на увредения ендотел. Броят на циркулиращите EPC обаче прогресивно намалява при пациенти с ESKD [7-9], което корелира с неблагоприятни сърдечно-съдови резултати [9,10] и дългосрочна смъртност.

Съобщава се, че мезенхимните стромални клетки (MSC) насърчават ангиогенезата чрез стимулиране на EPC програмирането. Въпреки това, докато MSC са оценени в различни клинични изпитвания [13], тяхната способност да улесняват регенерацията на бъбречния ендотел не е изследвана. Скорошни проучвания от нашата лаборатория идентифицираха повишения терапевтичен потенциал на комбиниране на МСК, получени от човешки костен мозък (BM), с антифибротичен агент, а именно рекомбинантен човешки (ген-2)релаксин (серелаксин; RLX[14) за подобряване на увреждане на бъбреците,възпалениеи фиброза в предклинични модели на заболяване. Докато RLX самостоятелно може да стимулира пролиферацията на EPC, получена от човешка кръв, и производството на азотен оксид (NO) in vitro, и васкулогенезата при мишки in vivo [18], остава неизвестно дали неговите комбинирани ефекти с BM-MSC могат да ускорят и/или подобрят EPC- получена ангиогенеза и заздравяване на рани. По този начин това проучване оценява терапевтичния потенциал на комбиниране на кондиционирана среда (CM), получена от RLX и BM-MSC, върху EPC пролиферация, ангиогенеза и зарастване на рани in vitro, спрямо получена от ESKD пациент.

2. Материали и методи

2.1. Изолиране и култура на EPC от периферна кръв

След получаване на подписан формуляр за съгласие на пациента, около {{0}} mL кръв от здрави мъжки контроли беше събрана от Австралийската кръвна служба на Червения кръст. За разлика от това, само ~5 mL максимум от кръвта на мъже пациенти с ESKD бяха събрани от медицинския център Monash поради тяхното здравословно състояние. Всички кръвни проби бяха обработени в рамките на 24 часа от времето за събиране. Всички кръвни проби бяха разредени с 1 × балансиран солев разтвор на Ханк (HBSS; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ) до общ обем от 2 0 mL. След това кръвта беше внимателно наслоена върху 15 mL Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Упсала, Швеция) в 50 ml епруветка Falcon (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) и центрофугирана при 400× g за 40 минути при стайна температура, за да се отдели бъфито покритие от другите компоненти чрез използване на метод за разделяне с градиент на плътност, както е описано по-горе [19,20]. След разделянето на градиента, горният слой, съдържащ плазма и тромбоцити, се отстранява чрез внимателно вкарване на серологична пипета, оставяйки необезпокоявано бъфито покритие, съдържащо мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMCs), състоящо се от ендотелни прогениторни клетки (EPCs). Пелетата беше ресуспендирана в 2 ml среда за растеж на ендотелни клетки (EGM)-2 Microvascular (MV)Bullet Kit (продукт #CC-3162, Lonza, Hayward, CA, USA); допълнен с 5 процента фетален говежди серум (FBS), 0,04 процента хидрокортизон, 0,4 процента човешки фибробластен растежен фактор (hFGF) и 0,1 процента съдов ендотелен растежен фактор (VEGF), R3-инсулиноподобен растежен фактор (IGF) )-1, аскорбинова киселина, човешки епидермален растежен фактор (hEGF) и гентамицин сулфат/амфотерицин (GA-1000), за култивиране на изолирани EPC. Клетките бяха преброени с помощта на автоматичен клетъчен брояч CountessM (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ), преди да бъдат посяти върху покрити с фибронектин културални плаки/колби.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 клетки/колония), като се използва анализ на образуваща колония единица (CFU).

2.2. Приготвяне на кондиционирана среда (CM) от култивиран BM-MSC

Тъй като добавянето на BM-MSCs към EPC културите би компрометирало EPC-асоциираните крайни точки, които трябва да бъдат измерени, беше решено, че би било по-добре да се анализират ефектите на BM-MSC, получени от CM върху EPC функцията, както е използвано преди за анализа на други крайни точки [19]. Накратко, BM-MSCs се отглеждат в Alpha-Minimum Essential Media (-MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Австралия), допълнена с 16 процента фетален говежди серум (FBS) и 1 процент 200 mM L-глутамин и 1% пеницилин/стрептомицин. След като клетките достигнат ~80 процента конфлуентност, BM-MSCs бяха допълнително субкултивирани и поставени в 12-плака с ямки при плътност ~0,5×10 градуса на ямка и поддържани в култура за 24-48 h за осигуряване на клетъчно прикрепване. За да се подготви кондиционирана среда (CM) от BM-MSCs, за кратко клетките се промиват три пъти с предварително затоплен 1 mL от 1 × HBSS. След стъпките на промиване, 500 μL от серум и свободна от растежен фактор базална среда на ендотелни клетки (EBM); Продукт #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, USA) се добавя към клетките и се поддържа в култура при 5 процента CO, 37 градуса за още 24 часа. В края на този инкубационен период, CM се събира и центрофугира при 400 × g за 10 минути, за да се отстранят всички клетъчни остатъци. CM в аликвотни части от 500 μL се съхранява при -80 градуса до бъдеща употреба.

2.3. Функционални анализи

2.3.1. Лечение на култивирани късни EPC

След като късните EPCs бяха събрани, бяха извършени функционални анализи. Всички експерименти бяха проведени в пасажи 3-6. Бяха проведени функционални анализи за изследване на ефекта от (i) 25 процента BM-MSC получена кондиционирана среда (25 процента CM) [20]; (ii) 1 [RLX-1] или 10 [RLX-10 ]ng/mL [18] RLX (представляващи циркулиращите нива на H2 релаксин, открити при бременни жени [21]); или (i) комбинираните ефекти от 25 процента CM и 1 или 10 ng/mL RLX; (iv) 20 процента FBS се използва като положителна контрола върху потенциала за пролиферация и образуване на тръби (ангиогенен) на късните EPCs, получени от контролни пациенти . Групите на лечение бяха сравнени с нетретирани клетки.

2.3.2. Тест за жизнеспособност и пролиферация

Жизнеспособността и пролиферативният потенциал на късните ЕРС бяха определени чрез използване на {{0}}(4,5-диметитиазол-2-ил)-2,5- дифенил тетразолиев бромид (MTT) анализ съгласно инструкциите на производителя (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Австралия). Накратко, ~5 × 103 клетки на ямка бяха посяти в 96-плаки с ямки (BD Falcon, North Ryde, NSW, Австралия), след което клетките бяха третирани с получен от BM-MSC CM, RLX (10 ng/ mL), или комбинация от CM и RLX при 1 или 10 ng/mL за 24 часа. В края на инкубационния период се добавят 10 μL реагент за маркиране на МТТ (0,5 mg/mL, Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Австралия) и се инкубират при 37 градуса Cand 5 процента CO2 за още 4 часа. Клетките се солюбилизират чрез добавяне на 100 μL от разтвора за разтваряне (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Australia) и потенциалът за пролиферация на късните EPCs се определя чрез измерване на абсорбцията на всяка проба при 590 nm с помощта на микроплака. четец (Bio-strategy, Balwyn North, VIC, Австралия) и анализиран със софтуер SoftMax Pro за Windows OS (Версия 7.3, Molecular Devices LLC, Калифорния, САЩ). Всяка от третираните групи беше проведена и анализирана в шест повторения.

2.3.3. Анализ на образуване на тръба

Ефектите от различните лечения за насърчаване на ангиогенния потенциал на късните EPCs, използвайки анализ за образуване на тръби, бяха определени с помощта на μ-ангиогенезисния анализ （Abidi, Fitchburg, WI, USA）. Накратко, 10 μL намален с растежен фактор（GFR） Matrigel （Продукт #356231, Corning, Tewksbury, Масачузетс, САЩ） беше добавен във вътрешното гнездо на μ-Slide на комплекта за анализ на ангиогенезата (Abidi, Fitchburg, WI, USA) ). Конфлуентни култури от късните EPCs се посяват върху покрити клетки и се третират с получени от BM-MSC CM, RLX (10 ng/mL) или комбинация от CM и RLX при 10 ng/mL. Общ обем от 50 μL клетъчна суспензия, съдържаща ~ 1 × 104 клетки, се прилага към всяка ямка. Изображенията бяха незабавно заснети и означени като 0-часова времева точка. Способността на клетките при различни лечения да

формирани епруветки бяха наблюдавани и изображенията бяха заснети на 2-24 h след клетъчно посяване с помощта на светлинен микроскоп. Броят на тръбите, дължината на тръбата и броят на точките на разклоняване бяха определени с помощта на софтуера ImageJ.

2.3.4. Тест за заздравяване на рани

Ефектите от различните лечения върху регенеративния потенциал на късните EPCs бяха определени с помощта на анализ за зарастване на рани. За извършване на анализа, ~ 1 × 10 клетки се суспендират в 50 μL растежна среда и се посяват в 2-ямков силикон в 35 mm чиния за анализ на заздравяване на рани (Abidi Inc., Fitchburg, WI, USA). Изкуствените рани в паничките бяха създадени чрез внимателно отстраняване на силиконовите ямки с помощта на стерилна пинсета (разстояние на междината=500±100μm). Съдовете бяха допълнени с 2 mL 50 процента EGM-2, с добавяне на различни лечения, включващи CM, получени от BM-MSC, RLX (10 ng/mL) или комбинация от CM и RLX при 1 или 10 ng/mL.Броят на клетките, които мигрираха, за да затворят раната, беше оценен чрез използване на светлинна микроскопия.Микрографии на мигрираните клетки бяха уловени на 0-24 ч след третирането.Процентът на зоната на затваряне на празнината беше определен с помощта на софтуер Image].

2.3.5. Анализи на изображения

Всички анализи на изображения за функционалните анализи бяха извършени с помощта на ImageJ за MacOS (Версия 1.8, Национален институт по здравеопазване, Бетезда, MD, САЩ). За потенциала за образуване на тръби на късните EPC, изображенията бяха анализирани с помощта на плъгина за анализ на ангиогенезата и бяха записани четири различни параметъра, включително обща дължина, брой отвори, брой кръстовища и брой разклонения. За теста за зарастване на рани, зоната на затваряне на раната се анализира чрез ръчно маркиране на зоната без клетки във всяка от времевите точки. Всички измервания бяха извършени най-малко 3 пъти, за да се контролират вариациите.

2.3.6. Имунофлуоресценция

Локализацията на протеина на пептидния рецептор 1 на семейство Relaxin (RXFP1; родствения RLX рецептор) в култивирани късни EPCs се определя с помощта на имунофлуоресцентно оцветяване. Първо, ~1 × 1{{20}} градуса клетки, отгледани върху 13 mm стъклено покривно стъкло (покрито с поли-D-лизин) в 12-плака с гнезда, бяха фиксирани в 4% PFA за 15 минути на стайна температура. Фиксираните клетки бяха блокирани за неспецифично протеиново свързване с помощта на 1% говежди серумен албумин (BSA) за 60 минути при стайна температура. В края на инкубационния период клетките се промиват в PBS в продължение на 5 минути (3 пъти) и се инкубират със заешко поликлонално RXFP1 антитяло (aa 609-624; A 9227; 1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Германия ) в 0,01 процента BSA за една нощ при 4 градуса. Клетките се промиват с PBS и се инкубират с козе-анти-заешко Alexa-fluor 594 вторично антитяло (1:500; Invitrogen, Scoresby, Виктория, Австралия) в 0.01% BSA за 2 часа при стайна температура. Ядреното обратно оцветяване се извършва чрез добавяне на 40 μL DAPI в среда за монтиране на Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, Калифорния, САЩ) и се покрива. Имунореактивният RXFP1 протеин се визуализира с помощта на флуоресцентен микроскоп при ×40 увеличение (Olympus BX51) и изображенията се обединяват с помощта на софтуер ImageJ.

2.4. Статистически анализи

Всички данни са показани като средна стойност ± SEM и всички статистически анализи са извършени с помощта на GraphPad Prism'M (Версия 9; GraphPad Software Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ). Беше използван начин-ANOVA за сравняване на ефекта от различни лечения върху пролиферацията (MTT анализ) и ангиогенния (тест за образуване на тръби) потенциал на късните EPCs, последван от post-hoc тест на Tukey, за да се позволят множество сравнения между групите на лечение. Повторно измерване - двупосочна ANOVA беше използвано за сравняване на ефекта от различните лечения върху затварянето на рани от късните EPC с течение на времето, последвано от post-hoc теста на Tukey за сравняване на всяка от групите на лечение. P-стойност по-малка от 0.05 се счита за статистически значима.