Part1:Acteoside потиска RANKL-медиирана Остеокластогенеза чрез инхибиране на C-Fos индукция и NF- KB път и атенюиране ROS производство
Mar 05, 2022
За контакти: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-so Lee3.¤, Сий Хьон И2., Сунг-Хо Кук, Чонг-Че Лий22,3*
Абстрактен
Многобройни проучвания са съобщили, че възпалителните цитокини са важни медиатори за остеокластогенезата, като по този начин причиняват прекомерна костна резорбция и остеопороза.Acteoside от цистанш билка, основното активно съединение на Rehmannia glutinosa, което се използва широко в традиционната ориенталска медицина, има противовъзпалителни и антиоксидантни потенциали. В това проучване Сметната палата установи, чеактеозидниподчертано инхибирана остеокласт диференциация и образуване от костен мозък макрофаги (BMM) и RAW264.7 макрофаги, стимулирани от рецепторния активатор на ядрения фактор-капаБ (NF-kB) лиганд (RANKL).Актеозидипредварителното лечение също предотвратява костната резорбция чрез зрели остеокласти по дозозависим начин. Acteoside (10 mM) атенюирана RANKL-стимулирано активиране на p38 киназа, извънклетъчно сигнал регулирани кинази, и c-Jun N-терминална киназа, и също потиска NF-kB активиране чрез инхибиране на фосфорилиране на подединицата p65 и инхибитора kBa. В допълнение, RANKL-медиирани увеличения в изразяването на c-Fos и ядрен фактор на активирани Т-клетки, цитоплазмени 1 (NFATc1), и в производството на туморна некроза фактор-а, интерлевкин (IL)-1b, и IL-6 очевидно са били инхибирани от acteoside предварително лечение. Освен това, перораленактеозиднинамалена овариектомия индуцирана костна загуба и възпалително производство на цитокини до контролни нива. Нашите данни предполагат, че acteoside инхибира остеокласт диференциация и съзряване от остеокластични прекурсори чрез потискане rankL-индуцирана активиране на митоген активирани протеин кинази и транскрипция фактори като NF-kB, c-Fos, и NFATc1. Колективно, тези резултати предполагат, че acteoside може да действа като анти-резорбтивен агент за намаляване на костната загуба чрез блокиране на остеокласт активиране.
Въвеждането
Костта постоянно се ремоделира чрез балансиран остеокласт и остеобластна активност [1]. Остеокластите възникват от хематопоетичните прекурсорни клетки на моноцитното/макрофагичното потекло, докато остеобластите са от мезенхимното потекло [2]. Необичайно остеокласт активиране или намалена остеобластогенеза може да наруши костната хомеостаза, в крайна сметка причинява заболявания като остеопороза, артрит, и рак на костите [3,4]. Остеопорозата е често срещано костно заболяване, което води до повишен риск от фрактура. Най-честата форма на остеопороза се причинява от естрогенен дефицит при менопауза женски. Медикаменти като кортикостероиди и анти-епилептици също могат да причинят дисбаланс между костната резорбция и образуване, което може да доведе до остеопороза [5].
Много анти-резорбтивни инхибитори, включително бифосфонати, калцитонин, естроген, и селективни естроген рецепторни модулатори са били използвани за лечение на остеопороза. Тези инхибитори поддържат костната маса чрез инхибиране на остеокластната функция [6]. Естроген заместителна терапия е най-популярното лечение за предотвратяване и лечение на постменопаузална остеопороза. Въпреки това, дългосрочна естроген заместителна терапия може да увеличи риска от ендометриална и рак на гърдата. Затова много следователи са съсредоточили усилията си върху разработването на нов анти-резорбционен агент, който няма странични ефекти [7–10]. Тъй като остеокласти функционират в костната резорбция, специално инхибиране остеокласти е смятан за основна цел в множество проучвания.
Остеокласти са многоядрени гигантски клетки, образувани от мононуклеарни прогенитори на семейството моноцит/макрофаг чрез последователното пролиферация, диференциация и сливане на хематопоетичните прекурсорни клетки [11]. Макрофагният колониостимулиращ фактор (M-CSF) и рецепторният активатор на ядрения фактор (NF)-kB (RANK) лиганд (RANKL) са съществени фактори за остеокластовата диференциация [12]. В допълнение, няколко възпалителни цитокини, като тумор некроза фактор (TNF) и интерлевкин (IL)-1b, допринасят за остеокластогенеза чрез модулиране на индукцията на RANKL, остеопротегерин, и M-CSF [7,13]. RANKL свързване с клетъчната повърхност RANK рецептор води до RANKL/RANK/TNFR свързани фактори (TRAF) комплекси, които последователно активират NF- kB и митоген активирани протеин кинази (MAPKs), включително c- Jun N-терминална киназа (JNK), p38 киназа, и извънклетъчна киназа, свързана със сигнала (ERK) [14]. Това активиране играе ключова роля при посредничеството на остеокластната диференциация, активиране и оцеляване. RANKL също така активира изразяването на фактори на транскрипция като ядрен фактор на активирани Т-клетки, цитоплазмени 1 (NFATc1), и c-Fos, които са от съществено значение за развитието на остеокластите [7,9]. Следователно, RANKL сигнализация се счита за основна цел на анти-резорбтивни агенти, които потискат остеокласт активиране и загуба на кост.
Актеозидие основното активно съединение на Rehmannia glutinosa, което се използва широко в традиционната ориенталска медицина [15,16]. Acteoside е силен антиоксидант и има анти-хепатотоксични, противовъзпалителни, и анти-ноцицептивни дейности [17–20]. Преди това установихме, че acteoside намалява тирозиназа активност и меланин биосинтеза чрез регулиране на ERK сигнализация [21], предпазва от реактивни кислородни видове (ROS)-медиирани гингивално увреждане [22], и потиска микотоксин-медиирани увреждане на клетките [23]. Тези ефекти са тясно свързани със способността на нуклеозидите да премахват ROS и да регулират медиирана от MAPK сигнализация. По-специално, ROS се предлагат на медиатор RANKL-индуцирана сигнализация пътища и клетъчни събития в остеокласти. Предварително лечение с антиоксиданти инхибира RANKL индуцирана активиране на NF-kB, ERK, и IkBa, като по този начин потиска остеокластогенезата [24]. Тези констатации силно предполагат, че в допълнение към противовъзпалителна активност, антиоксидантна активност е от решаващо значение за анти-резорбтивен агент, по този начин acteoside може да потисне RANKL индуцирана остеокластогенеза.
В настоящото проучване изследвахме дали acteoside има терапевтичен ефект върху костната загуба. Изследвахме ефектите на acteoside върху остеокластната диференциация и костната резорбция и свързаните клетъчни механизми, използващи in vitro и in vivo експериментални системи.
Cistanche acteoside потиска индуцираната от RANKL остеокластогенеза
Материали и методи
Изявление по етика
Практиките за грижа и употреба на животни бяха одобрени от Националния университетски комитет на Чонбук по етика в грижата и употребата на лабораторни животни (Разрешително No. CBU 2010-0007). Всички експерименти в това проучване са извършени съгласно насоките на Комитета по грижа за животните и употреба на университета.
Мишки, химикали, и лабораторни уари
Четириседмични женски Мишки ICR са закупени от Orient Bio Inc. (Сеул, Корея) и се помещават в 2261uC и 5565% влажност на 12 h лек/тъмен цикъл със свободен достъп до храна и вода. Acteoside (3,4-дихидрокси-бфенетил-О-а-рхамнопиранозил-(1R3)-4-О-кафеоил-б-D-глюкопиранозид; C29H36O15) (фиг. S1) е бил изолиран от листата на Rehmannia глутиноза. Acteoside е разтворен в фосфат-буфериран физиологичен разтвор (PBS) преди употреба. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6, и M-CSF са закупени от R & D системи (Минеаполис, MN, САЩ). Антитела, специфични за c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa, и b-actin, са получени от Биотехнологиите на Санта Круз (Санта Круз, Калифорния, САЩ). Антитела за p-p38 и p38 са закупени от Технологията за клетъчна сигнализация (Danvers, MA, САЩ). Calcium Assay и Osteocalcin (OC) EIA Kits са закупени от BioAssay Системи (Hayward, CA, САЩ) и Биомедицински технологии (Stoughton, MA, САЩ), съответно, за определяне на серумни биохимични параметри. Миши тартарат устойчиви киселина фосфатаза (Трап) Assay комплект (Имунодиагностичните системи, Scottsdale, AZ, САЩ) също е бил използван за измерване на серум tRAP5b ниво. Освен ако не е посочено друго, са получени допълнителни химикали от Sigma Chemical Co. (Сейнт Луис, MO, САЩ), а лабораторните продукти са от SPL Life Sciences (Почун, Южна Корея).
Клетъчни култури
Клетките на костния мозък са получени от тибията и фемората на 6-седмични женски ICR мишки по методи, описани преди това [25]. Суспензията на костния мозък е инкубирана в 100-mm култура ястие в присъствието на 50 ng/ml M-CSF. След 3 дни, прилепящи клетки са били използвани като костен мозък макрофаги (BMM) за предизвикване на остеокластична диференциация. Някои клетки на костния мозък също са инкубирани за 48 часа без M-CSF, и прилепващите клетки са били култивирани в остеобласт диференцираща среда, както е описано другаде [25]. RAW264.7 макрофаговите клетки са култивирани в модифицираната среда на Dulbecco Eagle (DMEM) допълнени с 10% плода говежди серум (FBS), 2 mM L- глутамин, и антибиотици. Тези клетки са били използвани като колега клетъчна линия за BMM да проучи ефекта на acteoside върху остеокластогенезата.
Остеокластична диференциация и капан оцветяване
BMM са предварителнотретирани с различни концентрации (0–50 mM) отактеозидниза 2 h, преди да стимулирате със 100 ng/ml RANKL. Медиите за култура бяха заменени със свежи медии в дни 2 и 5. След 7 дни инкубация културите са фиксирани в 4% PBS- буфериран параформалдехид и оцветен с ТРАП с помощта на комплект Sigma Aldrich съгласно инструкциите на производителя. TRAP-положителни клетки са били преброени с помощта на оптична микроскопия, и клетки, съдържащи 3 или повече ядра са били считани за остеокласти. RAW 264,7 клетки също са били изложени на 100 ng / ml RANKL след предварително третиране с acteoside за 2 h, и след 7 дни на инкубация, клетките са били обработени за оцветяване на Трап.
Измерване на жизнеспособността на клетките
Клетъчната жизнеспособност е определена с помощта на водоразтворим тетразолиев сол (WST)-8 реагент. Накратко, BMM или RAW264.7 клетки, култивирани в среда за растеж, съдържаща 10% FBS и антибиотици са лекувани с 10 mM acteoside или фенолни съединение като кверцетин, лутеолин, апигенин, или епигалокатехин-3-галат (EGCG). В културите е добавен реактив WST-8 след 48 h инкубация. След инкубиране за допълнителни 4 h, WST-8- специфичната абсорбция е измерена при 450 nm с помощта на четец на микроплочки (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, САЩ).
Костна резорбция assay
BMM (16105 клетки/ml) са суспендирани в a-MEM, съдържащи 50 ng/ml M-CSF и 100 ng/ml RANKL, след което са разделени на 24-добре пластина, покрити с калциев фосфат нанокристали (OAAS-24; Остеокласт дейност Assay субстрат, Oscotec Inc., Choongnam, Южна Корея) с плътност от 26104 клетки / cm2 със и без acteoside. След инкубиране в продължение на 7 дни клетките са извадени от плочите с 5% натриев хипохлорит, а образуването на яма се наблюдава под оптичен микроскоп. Резорбираният район също е измерен от анализатор на изображения и е изразен като процент от контролната стойност.
Уестърн Блут Анализ
Цели протеинови лизати са приготвени в лизис буфер, както е описано другаде [26]. Цитозолните и ядрените протеини са приготвени, както е описано преди това [25]. Равните количества протеинов екстракт са разделени с 12–15% SDS-PAGE и се размиват върху поливинил дифлуоридните мембрани. Слотовете са били пробити с първични антитела за една нощ в 4uC преди инкубация с вторично антитяло в блокиране буфер за 1 ч. Блутовете са
разработена със засилена chemiluminescence (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Бъкингамшир, Великобритания) и изложена на рентгеново фолио (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, САЩ).
MAPK Дейност Assay
Клетките са предварителноактеозидниза 2 ч и след това се стимулира с RANKL за допълнително-30 мин. Дейностите на MAPK бяха определени с помощта на имунометрични комплекти за асистенция, като комплекта за асистенция на p-p38 киназа (Assay Designs, Inc., MI, САЩ), комплекта за оценка на ензимите p-ERK (Assay Designs), и комплекта за сандвичИ ELISA на P-SAPK/JNK (Технология за клетъчна сигнализация, MA, САЩ). Всички процедури са следвали инструкциите на производителя, а абсорбцията е измерена от четец на микроплаки.
Електрофоретична смяна на мобилността Assay (EMSA)
ДНК-протеинови свързващи реакции са извършени за 30 мин при стайна температура, с 10–15 mg протеин в 20 ml буфер, съдържащ 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml поли (dI-dC), 5% глицерол, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 30 000 cpm на [a-32P] олигонуклеотиди, обозначени с dCTP, и фрагмента Klenow на ДНК полимераза. Пробите са отделени върху 6% полиакриламидни гелове, които са изсушени и изложени на рентгеново фолио (Eastman Kodak Co.) за 12–24 часа при 270uC. Олигонуклеотидните грундови последователности, специфични за NF-kB, са 59-AAG GCC TGT GCT GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 и 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG GCC GCT GGA A-59.
НФ-кБ Луцифераза Асай
RAW264.7 макрофаги в 24-кладенец плочи са били трансфектирани с 0.8 мг kB-луцифераза репортер вектор с помощта на 2 мл Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Карлсбад, CA, САЩ) според инструкциите на производителя. При 24 часа след трансфекцията клетките са стимулирани с RANKL при наличие и отсъствие на acteoside за 24 ч. Клетките са ресуспендирани в 100 ml буфер за репортерски лизис
(Промега, Мадисън, WI, САЩ). Равни количества протеинови проби бяха поставени в 96-ямки микроплаки и се смесиха с субстрат на луциферазата. Луминеценцията е измерена чрез използване на микроплатен луминометър (MicroLumat Plus LB 964, Бертолд Технолоджис, Бад Вилдбад, Германия). В този експеримент, пропусклив NF-kB инхибитор пептид (BIOMOL, Иконом Пайк, PA, САЩ) е бил използван като положителен инхибитор на KB.
Измерване на Цитокини
BMM или RAW264.7 клетки са били стимулирани с RANKL в присъствието на acteoside в 24-добре култура плочи. След 48 часа инкубация супернатантите на културата са събрани и оценени от ELISA, като се използват tNF-a-, IL-1b- и IL-6-специфични комплекти OptEIATM съгласно инструкциите на производителя.
Обратна транскрипционни-полимераза верижна реакция в реално време (RT-PCR)
MRNA изразът на остеокластични маркери, като c-Fos, NFATc1, и TNF-a, се определя от RT-PCR в реално време. Накратко, общата РНК е извлечена от макрофаги с реагент Trizol според инструкциите на производителя (Invitrogen). cDNA се синтезира с 1 mg обща РНК с помощта на SuperScript обратна транскриптаза II и грундове (Invitrogen). Power SYBR Green PCR Master Mix (Приложни биосистеми, Фостър Сити, CA,САЩ) е бил използван за откриване на натрупването на PCR продукт по време на колоездене със системата за откриване на последователност aBI 7500 (Приложни биосистеми). След денатурация при 95uC за 10 min PCR е
извършва с помощта на четиридесет 3-степенни цикъла на денатурация при 95uC за 15 сек, аналиране при 60uC за 1 сек, и удължаване при 72uC за 30 сек. Всички PCR реакции са извършени най-малко в три екземпляра, и нивата на изразяване са били нормализирани към гена за почистване HPRT в същата реакция. Това проучване използва същите грундови последователности, описани другаде [7].
Измерване на Вътреклетката ROS
Борсов разтвор от 29,79-дихлородихидрофлуоресцеин-диацетат (DCFH-DA) (50 mM; Калбиохем, Дармщат, Германия) е приготвен в ДМСО и се съхранява на 220uC в тъмното. Накратко, BMM (106 клетки/ml в 6-кладенец плочи) са култивирани с 50 ng/ml M-CSF за 24 h и след това се лекуват с различни концентрации (0 – 10 mM) отактеозидни2 h преди стимулиране със 100 ng/ml RANKL. След 1 з на ко-инкубация, тези клетки впоследствие са инкубирани с 25 mM DCFH-DA за 30 мин. Зелената флуоресценция на 29,79-дихлорофлуоресцеин (DCF) е регистрирана при 515 nm (FL 1) с помощта на facs VantageH система (Becton-Dickinson, Сан Хосе, CA, САЩ), и 10 000 събития са преброени на проба.
Индукция на Овариектомия-Индуцирана Остеопороза
За това проучване са използвани женски Мишки iCR (6-седмични). Мишките получават измамническа операция (Измамник, n =10) или хирургични овариектомизирани (OVX, n=20) под анестезия. Една седмица след операцията мишките OVX са разделени на случаен принцип на 2 групи по 10 мишки всяка: двустранни OVX и двустранни OVX допълнени с 200 ml
PBS, съдържащ 1 mM актеозид перорално (AC група). Пероралният актеозид се прилага веднъж на всеки 3 дни в продължение на 8 седмици след операцията, и
същото количество PBS е приложено към групите Sham и OVX. След 1 ден от последното приложение бяха пожертвани мишки и след това бяха анализирани биохимичните параметри в серума и 3-измерната костна структура.
Определяне на Серумните биохимични параметри
Кръвните проби са събрани чрез сърдечна пункция и серумът е събран чрез центрофугиране. Серумните проби са съхранявани при 280uC за анализи на биохимични параметри. Серумните нива на IL-1b и IL-6 са оценени чрез използване на комплекта ELISA, както е описано по-горе, Докато алкална фосфатаза (ALP) дейност е определена чрез използване на биохимични колориметрична оценка, която измерва количеството на p-нитрофенол, произведен от p-нитрофенол фосфат субстрат, както е описано на друго място [27]. За да се преценят биомаркерите на образуването на костите и резорбцията, серумните нива на OC, калций и TRAP5b също са определени съгласно инструкциите на производителите.
Анализи на костната структура и морфометричните параметри
Фемората на мишки (Sham, OVX, и AC групи) са дисекция и пълни с физиологичен физиологичен разтвор за механично тестване. Механичната якост на бедрената част е измерена, както е описано другаде [28]. Натоварването на фрактурата е записано като пиковата сила в нютоните в точката, че средната шахта на дясната фрактура на бедрената реза. Освен това леката бедрена кост на всяко животно е хисто-морфометрично анализирана с помощта на микрокомпютърна томография (микро-КТ) система (Рентгенова система с микрофокус SkyScan 1076, Kontich, Белгия). Накратко, костите в 4% съхранение на формалдехид са изсушени повърхностно върху хартиена тъкан, преди да бъдат обвити в пластмаса "'cling-film' или в парафилм, за да се предотврати сушенето по време на сканирането. Всяка обвита с пластмаса кост е била поставена в пластмасови/полистиролови тръби от пяна, които са монтирани вертикално хоризонтално в камерата за проби на скенера 1076 за
микро-КТ образна диагностика. Сканирането е извършено с помощта на 100 kV изходно напрежение и 140 mA изходен ток с 35 mm разделителна способност.
Триизмерни модели на трабекуларните кости на бедрената коска са реконструирани с помощта на SkyScan CT Analyzer версия 1.11. След това са измерени структурните параметри като трабекуларна костна минерална плътност (КмП, g/cm3), процентен костен обем (BV)/обем на тъканта (ТЕЛЕВИЗОР), %), дебелина (Tb.Th, mm), отделяне (Tb.Sp, mm), и число (Tb.N, 1/mm).
Остеогенна диференциация и минерализация Assay Костен мозък клетки, култивирани в 6-добре култура плочи са били лекувани с DAG (10 nM дексаметазон, 50 mM аскорбинова киселина, и 20 mM b-глицерофосфат) в присъствието на 10 mM acteoside. След 2 седмици диференциация клетките са фиксирани с ледено-студен 70% (vol/vol) етанол за 1 h и оцветени с 0,2% ализарин червено S в дестилирана вода за 30 мин при стайна температура. След като клетките са били задържани и въздушно изсушени, плочите за клетъчна култура са оценени чрез лека микроскопия с помощта на обърнат микроскоп (Nikon TS100, Япония). За да се определи количествено количеството червено багрило, оцветяването е елюирало с 10% ацетил пиридиниев хлорид чрез разклащане за 20 мин и абсорбцията е измерена при 560 nm. Количеството калций, депозирано в клетъчните слоеве, също е измерено с помощта на комплект Calcium C (Wako Chemical Inc. Osaka, Япония) според инструкциите на производителя. Освен това, изразяването на специфични за костите mRNA маркери, като например транскрипционен фактор-2 (Runx2), остерикс, костен сиалопротеин (БСП), и OC се определя от RT-PCR в реално време. Олигонуклеотидните грундове на тези маркери са проектирани с размери на продукта по-малко от 200 bp, използвайки Primer Express Software 3.0 (Приложни биосистеми), както е описано другаде [27].
cistanche acteoside повишава костното образуване
Резултати
Acteoside инхибира остеокласт образуване от макрофаги по доза зависим начин
За да се провери ефектът на acteoside върху BMM диференциация в остеокласти, клетките са били култивирани с различни концентрации (0 – 20 mM) на acteoside в продължение на 7 дни в присъствието на 50 ng / ml M- CSF и 100 нг / мл RANKL. Acteoside намалява броя на остеокласти по дозозависим начин. Когато клетките са предварително облекчени с 10 mM acteoside за 2 h, остеокластният брой намалява с 43% в сравнение с клетките, допълнени с M-CSF и RANKL (фиг. 1A). Фиг. 1Б показва диференциацията на остеокласт, медиирана с RANKL, и инхибирането му чрез комбинирано лечение с acteoside. В съответствие с този резултат, acteoside предварително лечение намалява rankL-стимулиран диференциация на RAW264.7 клетки и остеокласт образуване (Смокини. 1C и D). Когато анти- остеокластичният потенциал на acteoside на BMM е сравнен с антиостеокластните потенциали на няколко фенолни съединения при същата концентрация (10 mM), лутеолин показва най-високата активност (фиг. 2А). Въпреки това, лутеолин, кверцетин, или апигенин себе си намалява жизнеспособността на клетките (фиг. 2B). Всички съединения инхибира остеокластична диференциация от RAW264.7 макрофаги със следните относителни дейности: лутеолин. куерцетин = апигенин .
Cistanche актеозид инхибира остеокласт
