Част1: Анти-злокачествен асцит ефект на общо дитерпеноиди от Euphorbiae Ebracteolatae Radix се дължи на променянията на аквапорините чрез инхибиране на PKC активност в бъбрека
May 18, 2022
За повече информация. контактtina.xiang@wecistanche.com
Абстрактен: Това проучване оценява анти-асцитния ефект на общите дитерпеноиди, извлечени от Euphorbiae ебрактеолат Radix(TDEE)върху злокачествени асцитни мишки и елуцитира базовия му механизъм. TDEE е извлечен от дихлорметан и подложен на колонна хроматография. Чистотата на шест дитерпеноиди, изолирани от TDEE, е определена да бъде 77.18% от HPLC. TDEE (3 и 0,6 g сурови билки/kg, p.o.) намалява асцита и повишения изход на урината. Междувременно анализът на жизнеспособността на туморните клетки, цикълът и апоптозата показват, че TDEE нямаантитуморенактивност. Освен това нивата на изразяване на аквапорини (AQPs) и нивата на мембранна транслокация на протеин киназа C (PKC) α и PKCβ вБъбрецитеи клетките са измерени. TDEE намалява нивата на AQP1-4 и инхибира PKCβ експресия в мембранната фракция. Четири основни дитерпеноиди, с изключение на съединение 2, намалени aQP1 нива в човешки бъбрек-2 клетки. Съединения 4 и 5 инхибира aQP2-4 израз в murine вътрешен медуларен събиране на канални клетки. Индуцираното от дитерпеноид инхибиране на AQP1-4 експресията е блокирано от phorbol-12-миристат-13-ацетат (PMA; агонист на PKC). Дитерпеноидите от TDEE са основните анти-асцитни компоненти. Анти-асцитният ефект на дитерпеноидите може да бъде свързан с променяния в AOPs в бъбреците за насърчаване на диурезата. Инхибирането на AOP1-4 израз от TDEE е свързано със инхибирането на Активирането на PKCβ.
Ключови думи: Ефрактеолат Хайата от Ефрактобия; диуреза; биоактивни компоненти; терпеноиди; бъбречни клетки; PKC инхибитор
Кликнете, за да научите cistanche билка ползи
1. Въведение
Euphorbia ebracteolate Hayata (EEH) е член на рода Euphorbia в семейството Euphorbiaceae и се използва широко при лечение на коремна дистензия и оток, паразитна инфекция, туберкулоза, и други заболявания в традиционната китайска медицина(TCM)[1]. Коренът на EEH (EER) съдържа различни терпеноиди, които се считат за ефективни компоненти. Проведени са последни проучвания върху терпеноиди, за да се определи тяхнатапротивовъзпалителни,Антивирусни,анти-туберкулоза, и други ефекти in vitro [2-5]. Въпреки това, основните изследователски разследвания за традиционните ефекти на EER при лечението на коремна дистензия и оток са ограничени. Според теорията на TCM, EER може бързо да премахне коремната дистензия и оток чрез насърчаване на уриниране и диария [6]. Предишните ни проучвания показват, че общите дитерпеноиди от EER (TDEE) могат да причинят диария чрез регулиране на изразяването на аквапорин (AQP)-1 и AQP3 [7]. Към днешна дата обаче ефективните вещества на анти-асцит в ЕЕР остават неясни.
Коремното разширение и отокът са описани като асцит в съвременната медицина. Асцитът е патологично натрупване на перитонеална течност [8]. Има много причини за образуване на асцит, като цироза, тумор, сърдечна недостатъчност, и нефротичен синдром [9]. Появата на асцит е свързана с портална хипертония, което води до splanchnic артериална вазодилатация, намаляване на ефективния циркулиращ обем, активиране на ендогенните вазоконстрикторни системи, и запалено задържане на вода в бъбреците [10]. AQPs са бързи мембранни транспортери на вода за преминаване на епителни и ендотелни бариери и по този начин играят основна роля за поддържане на водния баланс [11]. Многобройни проучвания показват, че AQPs играят ключова роля при образуването и разстройството на асцита [12-15]. Има много видове AQP в бъбреците, като AQP1, AQP2, AQP3, и AQP4[16]. Тъй като TDEE може да регулира изразяването на AQPs в червата [7], предлагаме TDEE да може да бъде упражнено при лечението на асцит чрез регулиране на AQPs в бъбреците.
AQPs играят критична роля в образуването на урина, въпреки това, механизмите на регулиране на AQPs изразяване в бъбреците не са изяснени. В момента само ограничен брой доклади показват, че AQPs се регулират чрез протеин киназа C(PKC) и протеин киназа A(PKA)пътища [17-20]. Някои терпеноиди, изолирани от Euphorbia (напр., ъпхолд и ингенол 3-ангелат) имат регулаторни ефекти върху PKC. TDEE може да регулира aQPs експресията в бъбреците чрез PKC пътя.
В това проучване, Ние извлече TDEE и оцени неговия анти-асцит ефект, както и ана-анализирани AQPs изразяване, PKC, и PKA дейности в бъбреците на асцитни мишки. След това изолирахме и пречистихме основните дитерпеноиди от TDEE, за да проучим ефектите му върху нивата на AQPs протеин и mRNA експресия в два видабъбречни клетки(човешки бъбречни-2 клетки (HK-2) и мурин вътрешен медуларен събиращ канални клетки(mIMCD3)). И накрая, избираме дитерпеноидно съединение (евфебрактеолатин А), като използваме phorbol-12-миристат-13-ацетат (PMA; агонист на PKC) за активиране на Пътя на PKC, за да идентифицираме дали изразяването на AQPs в бъбреците е регулирано от PKC път. Това проучване има за цел да определи анти-асцитния ефект на TDEE в EER и да осигури основа за клиничното прилагане на EER и идентифициране на кандидат лекарства за диуреза и анти-асцитни ефекти.
2. Резултати
2.1.Ефекти на TDEE върху асцитната течност тегло, тегло на урината, и фекална вода съдържание
Лечението на асцитични мишки с общ екстракт от EER (TEER) и TDEE (3 и 0,6 g сурови билки/kg, p.o.) и фуроземид (положително лекарство) значително намалява повишаването на теглото на асцитната течност в сравнение с групата модели (фигура 1А). Фигура 1С показва, че тегла на урината значително (p<0.05, compared="" to="" the="" model="" group)increased="" in="" ascitic="" mice="" pretreated="" with="" teer,="" tdee,="" and="" furosemide.="" in="" addition,="" in="" the="" teer="" and="" tdee="" groups="" at="" a="" dose="" of="" 3="" g="" raw="" herbs/kg,="" a="" significant="" increase="" in="" fecal="" water="" content="" was="" observed="" compared="" with="" the="" model="" group="" (figure="" 1d).="" however,="" the="" non-diterpenoid="" fraction="" of="" eer(ntdee)="" groups="" showed="" no="" significant="" influence="" on="" ascites="" weight,="" urine="" weight,="" and="" fecal="" water="" content="" compared="" to="" the="" model="">
2.2. Ефекти на TDEE върху серумните нива на албумин в асцитните мишки
Серумният албумин е най-изобилният протеин в гръбначната плазма и може да поддържа осмотичното налягане на кръвта и да регулира водния транспорт. Фигура 1Б показа, че производството на асцит при моделни мишки е причинило значително намаляване на серумния албумин в сравнение с нормалната група. След лечение с фуроземид, TEER, и TDEE(3 и 0,6 g сурови билки/kg, p.o.), нивата на серумния албумин са ефективно възстановени в сравнение с групата модели. Не е наблюдавано подобрение в този индекс в групите на NTDEE.
2.3.Ефекти на TDEE върху тумор клетка жизнеспособност, цикъл, и апоптоза при асцитични мишки
При злокачествен асцит туморните клетки плават в асцитната течност. Оценихме дали намаляването на асцита е свързано с раковата активност на TEER и TDEE. Резултатите показват, че тези лекарства не инхибират туморната клетъчна жизнеспособност (Фигура 2А)и не са довели до арест на клетъчния цикъл(Фигура 2Б) и апоптоза (Фигура 2C, D).
2.4.Ефекти на TDEE върху AQPs Изразяване в бъбреците на асцитните мишки
Бъбрекът е важен орган за реабсорбция на водата и концентрация на урина. Водните канали AQP посредничават за бързото транспортиране на вода в бъбреците. По този начин изследвахме изразяването на AQPs в бъбреците. Фигура3 показа, че подобрението на асцита има малък ефект върху AQPsexpression в бъбреците в сравнение с нормалната група. Когато се лекува с TEER и TDEE, изразяването на AQP1, AQP2, AQP3, и AQP4 протеини е подчертано по-ниска, отколкото в групата модели в повечето дози. TEER води до значително намаляване на AQP2, AQP3, и AQP4 израз в дози от 3,0 и 0,6g сурови билки/кг, като има предвид, че AQP1 израз е намален само с ниска доза(0.6g сурови билки/кг). По-специално, TDEE имаше същите инхибиторни ефекти върху AQP3 и AQP4 израз като TEER в две дози. Разликата между TDEE и TEER е, че TDEE инхибира изразяването на AQP1 и AQP2 само при висока доза (3g сурови билки/кг). NTDEE има слаби ефекти върху AQPslevels в бъбреците, и само регулира израза на AQP4 протеин в доза от 3g сурови билки/кг.
2.5.Ефекти на TDEE върху PKC и PKA активиране в бъбреците на асцитни мишки
Предишни проучвания показват, че aQPs експресията би могла да бъде регулирана чрез Активиране на PKC и PKA. Проверихме ефектите на TDEE върху PKC-a, PKC-β, и Активиране на PKA. Активирането на PKC е измерено чрез транслокацията му от цитозола към клетъчната мембрана. Както е показано на фигури 4А, и Б, нивото на експресия на протеини на PKC-β в мембранната фракция е значително намалено при групите на TDEE, като има предвид, че не е имало значителен ефект върху нивото на изразяване на PKC-α мембранен протеин. Фосфолипаза C(PLC) е важна молекула за сигнализация нагоре по веригата, която посредничи за активирането на PKC. Лечението с TDEE не оказва никакъв ефект върху нивата на фосфорилирания и общия PLC (Фигура 4D). PKA е хетеротетрамер, състоящ се от две каталитични подединици, обвързани с две регулаторни подединици. Освобождаването на каталитични подединици е отличителен белег на активирането на PKA. На фигура 4В TDEE не повлиява изразяването на PKA каталитични подединици.
2.6.Определяне на съдържанието на шест дитерпеноиди в TDEE чрез високоефективна течна хроматография (HPLC)
Резултатите от опитите с животни показват, че TDEE е основната ефективна фракция на EER. Изолирахме шест дитерпеноиди(структурите на съединения от 1 до 6 са показани на фигура 5; спектралните данни бяха добавени към допълнителния материал) от TDEE и използвахме тези съединения като стандарти за определяне на съдържанието на дитерпеноиди в TDEE. HpLC хроматограмите за TDEE и шестте дитерпеноидни стандарти са представени на фигура 6. Съдържанието на съединения от 1 до6 е съответно 1,07%,12,00%,12,69%,9,15%, 39,26% и 3,02%, което представлява съответно 77,18% от TDEE.
2.7.Ефекти на дитерпеноиди от TDEE върху AQPs експресия в бъбречни клетки
TDEE е активната фракция на EER, която инхибира асцита чрез намаляване на AQP1, AQP2, AQP3 и AQP4 израз в бъбреците. В същото време TDEE също така значително намалява протеина и mRNA експресията на AQP1, AQP2, AQP3, и AQP4 в човешките бъбречни-2 клетки(HK-2)и murine вътрешни медуларни събирателни клетки (mIMCD3)(фигура 7). Основните компоненти на TDEE са дитерпеноидите. Сравнихме ефектите между TDEE и дитерпеноиди смес (шест изолирани дитерпеноиди са смесени според съдържанието им в TDEE). Резултатите показват, че инхибиторните ефекти на дитерпеноиди смес и TDEE на AQP1, AQP2, AQP3, и AQP4 израз са сходни (Фигура 7). Дейностите на четири основни дитерпеноиди от TDEE са оценени in vitro. Фигури 8 и 9 показаха, че нивата на протеин и mRNA експресия на AQP1 в HK-2 клетки са значително намалени от съединения 3,4 и 5. Лечението със съединение 2 не предизвиква забележително намаляване на AOP1 на нивата на протеин и mRNA. За тези съединения съединение 3(ент-абиетан тип дитерпеноид)беше по-активен от другите съединения. В mlMCD3 клетки, четири дитерпеноидни съединения индуцирани различни степени на инхибиране на AQP2, AQP3, и AQP4 израз. Резултатите от протеина и генната експресия са представени на фигури 8 и 9. Съединения 4 и 5вложени мощни AQP2, AQP3, и AQP4 инхибиторни ефекти в сравнение с контролната група на генните и протеинови нива. Съединения 2 и 3 само показа различни ефекти върху Aqp2, Aqp3, и Aqp4 mRNA израз.
2.8.Ефекти на активатор на PKC върху Дитерпеноид индуцирана инхибиране на AQPs
Резултатите от експеримента с животни показват, че TDEE едновременно инхибира Активността на PKCβ и AQPs експресията в бъбреците на H22 туморноклетъчни носещи мишки. За да се изясни допълнително дали PKC регулира изразяването на AQPs в бъбречните клетки, PKC агонистът (PMA) е предварително лекуван в HK-2 и mIMCD3 клетки при 1,5 ч преди дитерпеноид (Euphebracteolatin A)стимулация. Беше засекретена промяната на мембраната PKCβ, AOP1, AOP2, AOP3 и AOP4 израз. Резултатите от Western Bolt показват, че еуфебрактеолатин А може да намали протеиновата експресия на мембрана PKCβ, AOP1, AOP2, AOP3, и AOP4, и ефектите могат да бъдат атенюирани от PMA предварително лечение (фигура 10).
