Част 2: Молекула за увреждане на бъбреците-1 е потенциален рецептор за SARS-CoV-2

За повече информация. контактtina.xiang@wecistanche.com

Клинични прояви на коронавирус

1. Инкубационният период е дълъг, а основните симптоми са висока температура, отпадналост, болки в гърлото и кашлица. Треската може да бъде висока температура, умерена температура или ниска температура;

2. Бебетата и възрастните хора не са типични и често са придружени от хрипове и диспнея. В тежки случаи може да възникне мултисистемна повреда;

3. Сухата кашлица в ранния стадий е предимно пароксизмална и тежка, подобна на магарешка кашлица, която засяга съня и дейността; в по-късния етап кашлицата е храчка, храчките са злобни, понякога съдържат малко количество кръв, а някои са придружени от хрипове;

4. Някои пациенти имат леки симптоми и може да нямат температура. Повечето пациенти имат добра прогноза, а малък брой пациенти са критично болни или дори умират;

5. Синдром на остър респираторен дистрес, септичен шок, рефрактерна метаболитна ацидоза и коагулационна дисфункция.

Как да се предпазим от новия коронавирус, подобряването на собствения имунитет е най-ефективното средство за борбата на хората с вируса. Цистанче, което се използва като подхранващо съкровище от древни времена, е известно като "пустиненженшен" и е кралят на укрепването на имунитета. Cistanche - Кралят на укрепването на имунитета

Съвременните медицински изследвания са доказали, че в допълнение към функциите за подхранване и укрепване на тялото, Cistanche има значителни лечебни ефекти за предотвратяване на тумори, против стареене, против аритмия, инхибира апоптозата и подобрява имунитета. услуга.

Theобщи глюкозиди на Cistancheса активните компоненти на женшена за регулиране на имунната функция, което може да подобри имунната функция не само при нормални хора, но и при хора с ниска имунна функция.

Клиничните наблюдения потвърждават, че Cistanche има известен лечебен ефект върху злокачествените тумори и има очевидния ефект на увеличаване на левкоцитите. Приемът на женшен по време на лъчетерапия и химиотерапия може да намали токсичните и странични ефекти от лъчетерапията и химиотерапията, да ускори възстановяването на увредената тъкан и да предотврати левкопенията;

Дискусия

Да се ​​бори срещуПандемия от COVID-19, дълбоко разбиране за това какSARS-CoV-2нахлува в човешки клетки е оправдано. Проучванията показват директна инфекция на SARS-CoV-2 вбъбрекв допълнение към белия дроб (Braun et al., 2020; Farkash et al., 2020). Въпреки това, ACE2 остава единственият добре разпознат рецептор, който може да медиира тази инвазия. Освен това, бъбречният тропизъм на SARS-CoV-2 и свързаните с негоувреждане на бъбрецитеизглеждат необясними с относително пониженото ниво на ACE2 при вирусна инвазия (Kuba et al., 2005). Тук нашето проучване предполага, че KIM1, драстично повишен биомаркер за бъбречно увреждане (Yang et al., 2015), медиира бъбречната инвазия на SARS-CoV-2 като рецептор.

Открихме също, че SARS-CoV-2-RBD се свързва с KIM1 с по-висок афинитет от този на SARS-CoV-RBD и MERS-COV-RBD, което вероятно е в основата на по-силното заразяване на SARS-CoV-2 (Rabaan et al, 2020); следователно, бъбречната инфекция и ролята на KIM1 при тези тежки респираторни заболявания си струва да бъдат преразгледани. По-специално, нашите резултати предполагат различни места на свързване на KIM1 и ACE2 върху вирусен RBD, поради което си струва да се проучи дали и как KIM1 и ACE2 медиират SARS-CoV-2 инвазия в тези органи. В допълнение, тъй като KIM1 е ​​ендоцитизиран чрез клатрин-зависими пътища (Zhao et al., 2016), също би било интересно да се проучи допълнително KIM1-зависимият процес след прикрепване на вируса към клетъчната мембрана.

ACE2 е най-добре проученият рецептор за SARS-CoV-2, но не е идеална терапевтична цел за COVID-19, тъй като е широко експресиран в множество органи и играе решаваща роля в регулирането на кръвното налягане и предотвратяване на увреждане на сърцето/бъбреците (Imai et al., 2005; Li et al., 2020d). За разлика от това, KIM1 има по-силна връзка с бъбречната функция и е силно изразен само следбъбречно увреждане(Kondratowicz et al, 2011; Yuan et al, 2015; Costafreda and Kaplan, 2018), което го прави по-специфична и може би по-безопасна терапевтична цел за пациенти с COVID-19 с бъбречни заболявания.

В обобщение, нашите данни предполагат решаваща роля на KIM1 в бъбречния тропизъм на SARS-CoV-2 като потенциален рецептор за SARS-CoV-2. Тук предлагаме модел на „порочен кръг“, медииран от KIM1 и ACE2 (Фигура 5G), който може да обясни бъбречния тропизъм на SARS-CoV-2 при пациенти с COVID-19. По време на началния етап на инвазията на SARS-CoV-2, по-високото физиологично ниво (допълнителна фигура S1) и афинитетът на свързване (допълнителна таблица S1) правят ACE2 основната цел, която не е специфична за бъбреците. Въпреки това, след началото на индуцираната от вирус AKl, получената драстично повишена KIM1 бързо насърчава вторична вирусна инфекция, медиирана от KIM1 и ACE2, която е по-специфична за бъбреците, и следователно изостря увреждането на бъбреците в порочен кръг (Фигура 5G). Подходи, които могат да прекъснат взаимодействието между SARS-CoV-2 и KIM1, включително анти-KIM1 антитела, инхибитори с малки молекули и получени от KIM1-антагонистични пептиди, може да хвърлят светлина върху COVID-19 лечение.

Материали и методи

Материали

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 процента) са химически синтезирани от Genscript. Анти-мише-lgG антитяло (p/n 18-8816-33) и анти-заешко-lgG антитяло (p/n 18-8817-33) бяха получени от Rockland. IgG с SureBeads" Протеин G магнитни зърна (J2112LB-02) бяха закупени от Bio-Rad. DAPI (D9542) беше от Sigma. Alex Flour 594 белязан фалоидин (C2205S) беше от Beyotimes. Антитела срещу KIM1 (NBP{{ 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma) и ACE2 (2115-1-AP, Proteintech) бяха използвани.

Придобиване и анализ на профили на експресия на KIM1 и ACE2

За да получим изчерпателните транскриптомни и протеинови профили на KIM1 и ACE2 за човешки тъкани, ние събрахме и анализирахме данните за транскриптомите и базираните на имунохистохимия протеинови профили от Атлас на човешкия протеин (HPA, https://www.proteinatlas.org), който показа, че експресия и локализация на човешки протеини в тъканите и органите, въз основа на дълбоко секвениране на РНК (RNA-seq) от 37 нормални тъкани и имунохистохимия върху тъканни микрочипове, съдържащи 44 типа тъкани (Uhlen et al., 2015). HPA RNA-seq тъкан на гена, кодиращ протеин, се записва като средни протеин-кодиращи транскрипти на милион (pTPM), съответстващи на средните стойности на проби от всяка тъкан. Базираните на хистология нива на протеинова експресия бяха анализирани ръчно на четири нива (неоткрито, ниско, средно и високо). В допълнителна фигура S1 са изброени съответно 10-те нива на тъканна транскрипция и базирани на хистология нива на експресия на протеини на KIM1 и ACE2 и е обобщен профилът на припокриване на експресия на KIM1 и ACE2.

Молекулярно докинг и динамични симулации

Докингите бяха проведени чрез Z-Dock (http://zdock.umassmed.edu/). Кристални структури на SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), ​​SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2 (PDB ID 1R42) и KIM1 Ig V домейн (PDB ID 5DZO) бяха използвани за търсене на потенциални модели на свързване. Протеиновите комплекси с най-добър резултат бяха избрани за следните симулации на молекулярна динамика, които бяха проведени от сървъра на Desmond и анализирани от Pymol2.3 и Maestro11.8.012. Диаграмата за симулации на динамика от 50 ns беше приложена за изследване на динамичните параметри на протеиновите комплекси . Свободната енергия на свързване на MM-GBSA беше изчислена от HawkDock (Misini lgnjatovic et al., 2016).

Средноквадратично отклонение (RMSD) и средноквадратично отклонение (RMSF)

RMSD беше използван за оценка на средната промяна в изместването на селекция от атоми за определен кадър, както е описано (Li et al., 2011). RMSF беше проведен за изследване на промените в изместването в протеиновата верига (Li et al., 2011) .

AKI мишки модели и qPCR

I/R нараняване беше извършено върху C57BL/6 мишки, както описахме по-рано (Chen et al, 2015, 2017). За AKI, предизвикана от цисплатин, 30 mg/kg телесно тегло цисплатин се инжектира интраперитонеално в 8-седмични мъжки мишки и мишките се умъртвяват 3 дни по-късно. Бяха събрани кръвни и бъбречни проби за допълнителен анализ, с n=4 за всяка експериментална група животни. Общата РНК се изолира от бъбреците чрез RNAiso Plus (TaKaRa) и се транскрибира обратно в сДНК, като се използва M-MLV система за синтез на първа верига (Invitrogen). Изобилието от специфични генни транскрипти се оценява чрез qPCR. Предоставени са праймери, използвани в изследването (допълнителна таблица S4).

Конструкции

Експресионни плазмиди на бозайници за човешки KIM1, KIM1 Ig V (KIM1 остатъци aa 20-127), KIM1 △lg V (скъсен KIM1 без остатъци aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-S остатъци aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}RBD-YFP и TIM4-YFP бяха конструирани. Продуктите на PCR амплификация на съответните сДНК фрагменти бяха клонирани във вектор, базиран на pRK промотор, съдържащ или НА, или FLAG етикет. Свързаните със SARS-CoV-2-плазмиди бяха любезни подаръци от д-р PHWang от университета Шандонг.

Клетъчна култура и трансфекция

Тубулна клетъчна линия на човешки бъбрек HK-2 (получена от Китайския център за събиране на типови култури) се култивира в среда DMEM/F12 (Hyclone), съдържаща 17,5 mM глюкоза и 10 процента фетален говежди серум. За да се оцени въздействието на SARS-CoV-2 върху клетките, HK-2 клетките бяха трансфектирани с SARS-CoV-2-S и SARS-CoV-2-RBD плазмиди и след това събрани за по-нататъшно откриване.

Co-IP

Посочените HK-2/HEK293T клетки (1×10) бяха лизирани в 1 ml буфер преди лиза (25 mM Tris-HCl, рН 7,4, 150 mM NaCl, 1 процент NP-40, 1 mM EDTA, 5 процент глицерол), който е формулиран за изтеглящи се и IP анализи и като промивен буфер за гранули. За IP, клетъчният лизат се имунопреципитира с посоченото антитяло или съответния gG с SureBeadsTM Protein G магнитни перли за една нощ при 4°С. След промиване с предварително лизисен буфер, съдържащ 500 mM NaCl, зърната се варят в зареждащ буфер и се подлагат на имуноблотинг (Wan et al., 2017).

FRET анализ

Вътреклетъчното взаимодействие между KIM1 и SARS-CoV-2-RBD беше открито чрез стандартен анализ, базиран на FRET (Карпова и Макнали, 2006), използвайки KIM1-CFP и SARS-CoV-2-RBD-YFP . Накратко, експресионни плазмиди на бозайници, експресиращи KIM1-CFP или KIM1 Alg V-CFP, бяха котрансфектирани със SARS-CoV-2-RBD-YFP в-293Т клетки. За откриване на базата на флуоресцентен спектрофотометър, клетките бяха събрани и лизирани 24 часа след трансфекцията и лизатът беше открит от F-2700 флуоресцентен спектрофотометър (Hitachi) чрез сканиране на дължина на вълната (500-600nm) и времево сканиране (435 /527 nm, възбуждане/емисия). За конфокално базирано откриване, клетките бяха изобразени с конфокален микроскоп Leica TCS SP8 под обектив с висока мощност (40 ×) (CFP канал: 435/485 nm, възбуждане/емисия; YFP канал :485/527nm, възбуждане/емисия; FRET канал:435/527 nm, възбуждане/емисия) (Li et al, 2020b). Котрансфекцията на неконюгиран CFP и YFP беше включена като отрицателна контрола, както е описано (Карпова и Макнали, 2006). Взаимодействието между KIM1 и неговия лиганд TIM4 беше открито чрез FRET анализ като положителна контрола (Rong et al, 2011).

CRISPR-Cas9-медииран нокаут на KIM1

Базираните на CRISPR-Cas9-протоколи за геномно инженерство бяха използвани, както е описано (Zhang et al., 2017). Предоставени са водещи РНК целеви последователности за KIM1 (допълнителна таблица S4).

FITC етикетиране и конфокална микроскопия

FITC етикетът беше извършен, както описахме по-рано (Li et al, 2020b; Zhang et al., 2020). Накратко, SARS-CoV-2-RBD се инкубира с FITC (моларно съотношение 1:5) за една нощ и след това се добавя 5 mM NHCl, за да се спре реакцията и да се потуши нереагиралият FITC. Разтворът беше диализиран два пъти и лиофилизиран за по-нататъшна употреба.

HEK293T клетки (5×109) или HK-2 клетки (1×107) се инкубират със свободен FITC или FITC-SARS-CoV-2-RBD （100ug/ml за 2. За тестове за интернализация на базата на пептид, AP1 или AP2（50 μM）се добавя заедно с FITC-SARS-CoV-2-RBD （100 ug/m）. След фиксиране с 4 процента (w/v) формалдехид, клетъчните мембрани бяха оцветени с Alex Flour 594 белязан фалоидин (2 ug/ml), а ядрата бяха оцветени с DAPI (1 ug/m) и след това изобразени с Leica TCS SP8 конфокален микроскоп. За всяка група в оценката бяха включени най-малко 100 клетки от пет полета под обектив с висока мощност (64 ×). Бяха представени представителни изображения. Количественото определяне на изображенията е извършено от ImageJ1.8.0.

Тестове за клетъчна жизнеспособност

Клетките се посяват при 3000-4000 клетки на ямка в 96-ямкови плаки. При 80 процента сливане клетките, инкубирани със SARS-CoV-2-RBD （100 ug/ml）, бяха третирани със или без AP1 или AP2（10,50,100 µM）. След това към всеки се добавят 10 ul МТТ (5 mg/ml).

ямка за 4h, средата се отстранява и се добавя DMSO. Абсорбцията, измерена при 490 nm, се нормализира към съответната контролна група.

Статистически анализ

Данните бяха изразени като средно ± SD. Значимите разлики бяха оценени чрез двустранен тест на Student. Двустранна P-стойност<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">