Съдържание на фенолни съединения и генетично разнообразие на популационно ниво в естествения ареал на разпространение на мечото грозде (Arctostaphylos Uva-ursi, Ericaceae) на Иберийския полуостров

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Резюме:Мечото грозде (Arctostaphylos uva-ursi) е лечебно растение, традиционно използвано за лечение на инфекции на пикочните пътища поради високото съдържание наарбутин(хидрохинон-D-глюкозид), който сега се използва главно като естествен избелващ кожата агент в козметиката. Мечото грозде също е предложено като естественоантиоксидантдобавка, дължаща се на високото съдържание на фенолни съединения в листата. Изследвахме вариациите на фенолните съединения в 42 диви популации на мечо грозде, с цел да изясним дали присъщите биологични, климатични и/или географски фактори влияят върху съдържанието на фенол в естественото му разпространение на Иберийския полуостров. Листата от мечо грозде са събрани през есента за период от три години (2014–2016 г.) в популации в градиент на географска ширина и надморска височина. Метанолните екстракти показват широк диапазон от вариации в общото съдържание на феноли и различни фенолни профили по отношение наарбутин(нивата на тази основна съставка варират от 87 до 232 mg/g dr wt), но също и съдържанието на катехин и мирицетин, което е повлияно от географски и климатични фактори. Умерени нива на вариация на размера на генома - оценен чрез поточна цитометрия - и на два пластидни ДНК региона също бяха открити сред популациите. Генетичната и цитогенетичната диференциация на популациите е слаба, но значително свързана с фитохимичното разнообразие. Елитни генотипове на мечо грозде с по-високиантиоксидантвпоследствие бяха идентифицирани капацитет.

Ключови думи: арбутин; генетична и фитохимична променливост; размер на генома; хаплотипове; естествениантиоксиданти

Cistanche са естествени антиоксиданти

1. Въведение

Синтезът на специализирани за растенията метаболити варира във времето (т.е. онтогенеза, фенология и индуцирани защити) и пространството, тъй като играе решаваща роля в адаптирането на растенията към условията на околната среда, като същевременно генетичните вариации отчитат хеморазнообразието [1]. Сред тези съединения фенолът има разнообразен набор от моно- и полимерни структури, които изпълняват широк спектър от физиологични роли [2]. Биосинтезата на специализирани метаболити е силно повлияна от фактори на околната среда, като температура, валежи или слънчева радиация, които от своя страна често са подложени на градиенти по ширина, дължина или надморска височина. По-специално, натрупването на фенолни съединения е общ отговор на повишени нива на UV-B (280–315 nm) радиация. Съобщава се за специфични вариации на съединенията в растения, растящи в средиземноморския регион през лятото и на голяма надморска височина, където има по-висока честота на UV-B, а канелените киселини и флавоноидите показват най-високи нива на UV абсорбция [3].

Арбутин(хидрохинон-D-глюкозид) е просто фенолно съединение с ограничено присъствие в листата на някои видове, принадлежащи към родове като Arbutus, Arctostaphylos, Pyrus или Vaccinium. Основният естествен източник на арбутин, мечото грозде (Arctostaphylos uva-ursi ( L.) Spreng.) се използва от векове за лечение на инфекции на пикочните пътища и други бъбречни заболявания [4], а билкови формулировки се приготвят и до днес [5]. През последните години спектърът от приложения наарбутинсе разшири, най-вече като естествено средство за избелване на кожата в козметичната индустрия [6] и в клиничните терапии поради своитеантиоксидант, антибиотични, противовъзпалителни и антитуморни свойства [7]. Следователно, нараства интересът към намирането на допълнителни природни източници наарбутин, както и биотехнологични процеси, които могат да заменят химическия синтез [8,9]. В този контекст in vitro производството на арбутин с помощта на клетъчни култури Datura inoxia достигна пилотен мащаб [10].

В допълнение къмарбутин, други фенолни съединения допринасят за активните свойства на A. uva-ursi, като флавоноиди и танини [11,12], от които катехинът и корилагинът са най-подходящите в листата, съответно [13]. В хранително-вкусовата промишленост естествените съединения като растителни феноли се заменят с синтетичниантиоксидантконсерванти [14]. A. uva-ursi се използва като добавка, особено в месни продукти [15–19], но също и в активни опаковки [20]. И накрая, наскоро беше предложен потенциалът на A. uva-ursi като източник на дъбилни агенти за кожената промишленост [21].

Монографията „Лист от мечо грозде“ на Европейската агенция по лекарствата [5] предлага минимум 7 процента отарбутинсъдържание в изсушени листа като изискване за билкови препарати. Проучванията, проведени през последните десетилетия, описват съдържанието на арбутин в листата на мечо грозде, вариращо от 0 процента до 18 процента, което се обяснява с аналитични процедури, естествена променливост, условия на растеж и дата на прибиране на реколтата [4]. Съдържанието на арбутин обикновено се определя чрез високоефективна течна хроматография [4,12,22–24], а предишни проучвания откриват по-високиарбутинсъдържание в растенията от мечо грозде, събрани през есента, отколкото в тези, събрани през пролетта [4]. Описани са различни хемотипове на мечо грозде, свързани с географското разпространение и вътрешновидовата диференциация в подвидовете на A. uva-ursi. Най-впечатляващата отчетена фитохимична вариация е липсата на арбутин в A. uva-ursi subsp. stipitata Packer и Denford, но също така са посочени разлики в съдържанието на метил-арбутин, елагова киселина или мирицетин. Кверцетинът също присъства в листата на мечото грозде, в които както агликоните, така и техните 3-O-гликозиди са по-често срещаните флавоноиди [4]. Въпреки това повечето от тези изследвания са извършени преди няколко десетилетия и днес вътрешновидовата вариация при мечото грозде се счита за непрекъсната. Описаните 14 подвида, включително един от Испания (A. uva-ursi subsp. crassifolius (Braun-Blanq.) Rivas Mart. ex Torre, Alcaraz и MB Crespo), понастоящем са неприети имена и са синоними на A. uva-ursi [ 25]. Поради това са необходими нови изследвания, за да подобрим знанията си за съединенията, които действително присъстват в суровината, събрана от различни места за промишлени цели, тъй като е описано, че химичният профил на листата на A. uva-ursi включва разнообразен набор от феноли, танини, и флавоноиди в по-нови проучвания, проведени за изследване на различията на междувидово ниво [23,26,27].

Генетичното (включително цитогенетично) разнообразие на популационно ниво насърчава адаптирането към различни условия на околната среда [28]. Наскоро бяха прегледани ефектите от полиплоидизацията върху производството на специализирани метаболити в лечебни и ароматни растения [29]. В този контекст размерът на генома е широко използван параметър в оценките на променливостта на растенията, тъй като често се открива вътрешноспецифичната вариация ([30] и препратките там), корелирана с много други биологични черти и играе важна роля в еволюционните процеси [31–35]. ]. Въпреки това, проучванията, насочени към връзката между количеството на ядрената ДНК (т.е. размера на генома) и фитохимичното разнообразие, са много оскъдни [36,37]. Връзката между фитохимичното и генетичното разнообразие е оценена с помощта на ядрени, но особено пластидни ДНК маркери [38], особено при медицински [39] и култивирани [40] растителни видове.

Мечото грозде е широко разпространено в цялата околовръстна зона, но повечето от събраните диви популации в Европа се намират в източните страни, Австрия, Швейцария, Италия и Испания. Arctostaphylos uva-ursi расте в източната средна част на Испания, в планините, в надморска височина, варираща от 550 до 2350 m над морското равнище (н.в.). По-често се среща на север, тъй като популациите, разположени на по-ниски географски ширини, са по-редки и обикновено имат по-малко индивиди. Съществуващите проучвания относно вариабилността на съдържанието на арбутин в Испания се отнасят до стойности, вариращи от 8 процента в североизточните популации [41] и 19 процента в испанския растителен материал, оценени в проучване, проведено в Германия [42]. Нашето проучване има за цел да изясни фактори, включително размера на генома и генетичното разнообразие, обясняващи фитохимичните вариации в естественото разпространение на мечото грозде в Испания. Нашите резултати могат да допринесат за избора на растителен материал за фармацевтичната, козметичната и хранително-вкусовата промишленост.

храна за избелване на кожата: CISATNCHE

2. Резултати и дискусия

2.1. Анализ на химическото разнообразие

Листа от мечо грозде, взети от общо 249 растения, растящи в 42 испански местоположения, и през тригодишен период, 2014–2016 г. (Фигура 1, Таблица S1), показват различни проценти сухо тегло (dr wt), вариращи от 46,7 (LO) до 55,1 процента (CP), със средно 50,1 ± 2,7 процента (данните не са показани). Метанолови екстракти, приготвени от проби, събрани през 2014 г. и 2015 г., бяха използвани за определяне на съдържанието на общи феноли и арбутин. Наблюдавахме широк диапазон от непрекъснати вариации и за двата параметъра със значителни разлики (p <0,001) сред="" растенията.="" екстрактите="" от="" листа="" на="" 80="" растения,="" взети="" на="" проби="" през="" есента="" на="" 2014="" г.="" (фигура="" 2а),="" показват="" общо="" фенолно="" съдържание,="" вариращо="" от="" 103,3="" ±="" 4,8="" mg="" gae/g="" dr="" wt="" (проба="" li-4)="" до="" 206,4="" ±="" 6,5="" mg="" gae/g="" dr="" wt="" (sr="" -2),="">арбутинсъдържанието варира от 92.0 ± 3.0 mg/g dr wt (AN-6) до 194,2 ± 5,6 mg/g sur wt (SE-8). Анализът на екстракти, приготвени от листа, събрани в 2015 от 94 растения (Фигура 2b), също показва широка фитохимична вариация, от 110,5 ± 3,6 mg GAE/g dr wt(PI-4) до 200,9 ± 9,8 mg GAE/g dr wt (LO-4) в общо фенолно съдържание, докато съдържанието на арбутин варира между 87,1 ± 0,4 mg/g dr wt (ET-2) и 211,5 ± 5,9 mg/g dr wt (LI -2). Освен това, независимо от годината на събиране, значителни разлики в общите феноли иарбутинсъдържанието е открито сред растенията от мечо грозде, растящи на едно и също място за повечето от популациите (данните не са показани). Нивата на арбутин са значително корелирани с общото съдържание на феноли в екстрактите от листа от мечо грозде, тъй като изчислихме значителни коефициенти на Пиърсън за {{0}} .332 (p=0.003) за 2014 г. и 0.289 за данните за 2015 г. (p=0.005). Съдържанието на арбутин в 48-те растения, взети в проби през двете години, не се различава значително (p=0.380).

Въпреки променливостта, открита в рамките на популациите, и независимо от годината на прибиране на реколтата, анализът на дисперсията показа, че съдържанието на арбутин в екстрактите от листа на мечо грозде също зависи (p < {{0}}.00="" 1)="" на="" местоположението="" на="" популацията="" (фигура="" 3a,b),="" както="" се="" случва="" за="" общото="" съдържание="" на="" феноли="" в="" листата="" на="" мечо="" грозде,="" анализирани="" в="" 2015="" (p="">< 0.001,="" фигура="" 3b).="" за="" разлика="" от="" това,="" не="" се="" наблюдават="" значителни="" разлики="" в="" съдържанието="" на="" общите="" феноли="" (p="0.080)" сред="" 10-те="" популации,="" взети="" на="" проби="" през="" 2014="" г.,="" които="" са="" разположени="" в="" сравнително="" малка="" област,="" но="" са="" разпределени="" в="" широк="" диапазон="" от="" надморска="" височина,="" от="" 424="" (ba="" население)="" до="" 1410="" m="" надморска="" височина="" (pa="" население).="" тази="" промяна="" в="" надморската="" височина="" се="" свързва="" с="" разликите="" в="" климатичните="" условия="" (таблица="" s1),="" тъй="" като="" местата="" на="" по-висока="" надморска="" височина="" се="" характеризират="" с="" по-ниски="" средни="" температури="" (коефициент="" на="" корелация="" на="" пиърсън,="" r="−0,666," p=""><0,001) и="" по-високи="" годишни="" валежи="" (="" r="0.485," p=""><0.001), което="" на="" свой="" ред="" доведе="" до="" по-ниски="" глобални="" нива="" на="" радиация="" (r="−0.390," p=""><0.001). освен="" това,="" от="" този="" набор="" от="" данни="" оценихме="" ниска,="" но="" значима="" положителна="" корелация="" между="" годишните="" валежи="" и="" общото="" съдържание="" на="" феноли="" в="" растенията="" от="" мечо="" грозде="" (коефициент="" на="" спирман="" rho="0.256," p="0.022)," докато="" от="" набора="" от="" данни="" за="" 2015="" г.="" когато="" взехме="" проби="" от="" популации="" в="" по-голяма="" област,="" открихме="" значителна="" положителна="" корелация="" между="" годишните="" валежи="" и="" съдържанието="" на="" арбутин="" (rho="0.246," p="0.017)." тази="" значителна="" корелация="" показва,="" че="" растенията="" от="" мечо="" грозде,="" растящи="" в="" северни="" райони="" и="" на="" относително="" по-висока="" надморска="" височина,="" показват="" често="">арбутинсъдържание (rho=0.217, p=0.035 и rho=0.269, p=0.009, съответно). Както бе споменато, тези по-високи съдържания на арбутин корелират значително с по-високите общи съдържания на феноли в листата на мечото грозде, които са сходни (средно 154,4 ± 19,6 mg GAE/g dr wt) с тези, открити във водни екстракти от други растителни видове, използвани катоантиоксидантдобавки в хранително-вкусовата промишленост [43], като розмарин (185.0 mg GAE/g dr wt), чай (149,3 mg GAE/g dr wt) или гуава (154,4 mg GAE/g dr wt). Тези резултати са в съгласие с предишни препратки и са потвърдени в проучване, проведено от Wrona et al. [20] с помощта на някои от пробите от листа на испанско мечо грозде, събрани през 2015 г., за които по-високиантиоксиданткапацитетът беше свързан с по-високарбутинсъдържание. Елитни генотипове на мечо грозде също могат да бъдат идентифицирани за тази цел, като индивиди 1, 4, 7 и 8 от LO популацията, които са натрупали средно 183,3 ± 16,4 mg GAE/g dr wt през двете години на изследване.

За да изясним допълнително климатичните и географски фактори, влияещи върху моделите на фенолни вариации, ние извършихме по-изчерпателна колекция от проби през есента на 2016: 140 растения от мечо грозде, растящи на 29 места, и определихме количествено пет фенолни съединения (Фигура S1a), които бяха идентифицирани чрез съвместно елуиране със стандарти в градиент ацетонитрил/вода (Фигура S1b). Анализът показа широки диапазони на непрекъснати вариации за съдържанието на арбутин, кафеена киселина, катехин, мирицетин и кверцетин глюкозид, със значителни разлики между растенията, които обикновено се наблюдават в популациите (данните не са показани). За основните фенолни съставки открихме, че съдържанието на арбутин варира от 91,1 ± 5.0 (LB{{10}}) до 232,4 ± 2,8 mg/g dr wt (PT{{15 }}), докато съдържанието на катехин варира от 4,1 ± 0.1 (AF{{20}}) до 45,5 ± 1,4 mg/g телесно тегло (LB-5). Що се отнася до двата други определени флавоноида, мирицетинът не е открит в някои растения от няколко популации, докато достига 21,2 ± 1,2 mg/g dr wt в PO{{30}}, а кверцетин глюкозидът варира от 3,8 ± 0,1 (CO -3) до 22,8 ± 0,8 mg/g dr wt (BT-3). По-ниско съдържание на кафеена киселина е определено в екстракти от листа на мечо грозде, което варира от 1,8 ± 0,0 (IZ-1) до 7,1 ± 0,3 mg Растения /g dr wt (SI-4).

Въпреки вариациите, наблюдавани сред индивидите, значителни разлики между популациите също бяха оценени за тези пет съединения (тестове на Kruskal–Wallis, p < {{0}}.001="" и="" p="0)." 009="" съдържание="" на="" кафеена="" киселина).="" по-високо="" съдържание="" на="" арбутин="" е="" определено="" средно="" в="" растения="" от="" естествени="" популации="" ab,="" gu,="" ln="" и="" lo="" (фигура="" 4а),="" които="" се="" различават="" значително="" (след="" корекция="" на="" bonferronic)="" от="" ниските="" съдържания,="" открити="" в="" растения="" от="" популацията="" lb="" (186,7="" ±="" 22,3,="" 193,9="" ±="" 12,1,="" 169,5="" ±="" 10,0="" и="" 169,2="" ±="" 5,2="" mg/g="" dr="" wt="" отпред="" до="" 111,8="" ±="" 16,0="" mg/g="" dr="" wt,="" съответно).="">арбутинсъдържанието на растения, от които са взети проби и през 2015, не се различава значително между годините (p=0.821). Популацията LB показва на свой ред по-високо средно ниво на катехин (Фигура 4b), което значително се различава от ниското средно съдържание на този флавоноид, открито в популациите AF и LC (32,8 ± 9,8 отпред до 5,7 ± 1,9 и 5,3 ± {{2{{62} }}}.5 mg/g dr wt, съответно). Средното съдържание на мирицетин и кверцетин глюкозид е показано на Фигура 4в, със значителни разлики между популациите AB, CG, LB и PO, с по-високо съдържание на мирицетин (15,1 ± 4.0, 14,6 ± 5,7, 10 0,7 ± 2,8 и 17,2 ± 3,9 mg/g dr wt, съответно), в сравнение с ниските нива, натрупани в средните растения от популациите CO и OD (1,2 ± 1,5 и 2,4 ± 3,6 mg/g dr wt, съответно) , и също означава съдържание на кверцетин глюкозид, определено в популациите AA, BT, CP, IZ и LB (15.2 ± 3.7, 15.9 ± 4.6, 11.8 ± 2.3, 15.7 ± 3.4 и 13.1 ± 4.6 mg/g dr wt, съответно) значително се различават от този в популацията CO (4.0 ± 0,1 mg/g dr wt). Обратно, средното съдържание на кафеена киселина се колебае от 2,1 ± 0,2 mg/g dr wt в популациите AB, CE, PT и SA до 3,5 ± 1,2 mg/g dr wt в популацията AF или 3,4 ± 2,2 mg/g dr wt в население SI; следователно не са наблюдавани значителни разлики поради вътрепопулационна вариация (средно съдържание 2,7 ± 0,8 mg/g dr wt). Тези резултати допълват вариацията на фенолните метаболити, наблюдавана от Wrona et al. [20], за осем от местоположенията на мечо грозде, взети проби през 2015 г., които са анализирани с помощта на технологията UPLC®-ESI-Q-TOF с MSE.

За разлика от резултатите, получени при анализа, извършен с проби от мечо грозде от 2014 и 2015 г.арбутинсъдържанието, определено в 2{{10}}16 проби, показва ниска, но значителна положителна корелация с радиацията (rho=0.256, p=0.002) и максималните средни температури (rho{ {5}}.183, p=0.030) и следователно са обратно пропорционални на годишните стойности на валежите (rho=−0.265, p=0.002). Тези разлики също бяха свързани с вариация във височината (rho=−0.192, p=0.023), но тази отрицателна корелация беше обяснена със споменатата нискаарбутинсъдържание на растения от популацията LB, които се намират на 1720m. Подобен модел на вариация се наблюдава за съдържанието на мирицетин, тъй като по-високите нива на това съединение са значително свързани с растенията от мечо грозде, растящи на места с по-високи нива на радиация (rho=0.226, p=0.{{1{{ 12}}}}07). Обратният модел на този на арбутина се наблюдава при катехина, тъй като е изчислена положителна корелация между този флавоноид и годишните валежи (rho=0.398,p < 0.0{{23="" }}1)="" и="" съответно="" бяха="" открити="" отрицателни="" корелации="" с="" радиация="" и="" с="" максимална="" средна="" температура="" (rho="−0.307," p=""><0.001 и="" rho="−0.470," p=""><0.001, съответно).="" тази="" промяна="" в="" климатичните="" фактори="" обяснява,="" че="" надморската="" височина="" и="" географската="" ширина="" влияят="" на="" съдържанието="" на="" катехин="" в="" листата="" на="" мечото="" грозде="" (rho="0.410" и="" 0.490,="" съответно,="" p="">< 0.001).="" анализ="" на="" основните="" компоненти,="" извършен="" с="" фитохимични,="" климатични="" и="" географски="" данни,="" съответстващи="" на="" 29="" места,="" взети="" проби="" през="" 2016="" г.,="" в="" които="" първите="" два="" компонента="" обясняват="" 60="" процента="" от="" наблюдаваната="" вариация,="" потвърждава="" тези="" резултати="" (фигура="" 5).="" не="" открихме="" никаква="" значима="" корелация="" между="" съдържанието="" на="" кофеинова="" киселина="" или="" кверцетин="" глюкозид="" в="" растенията="" мечо="" грозде="" и="" климатични="" или="" географски="" фактори,="" въпреки="" че="" оценихме="" леки,="" но="" значими="" корелации="" между="" съдържанието="" на="" мирицетин="" и="" кверцетин="" глюкозид="" (rho="0.184," p="" {{31}="" }.030)="" и="" между="" съдържанието="" на="" мирицетин="" и="" кафеена="" киселина="" (rho="−0.176," p="0.037)" от="" растенията="" мечо="">

Наблюдаваните контрастни климатични модели на вариации варбутинСъдържанието на растения от мечо грозде предполага, че въпреки че биосинтезата на този метаболит вероятно се увеличава при условия на по-висока радиация и температура, вероятно недостигът на вода е ограничаващ фактор за A. uva-ursi в средиземноморските и южните региони. Дел Вале и др. [44] съобщават за географски модел на натрупване на флавоноиди от Silene littorea (Caryophyllaceae) в Испания, където е определено по-високо съдържание на флавоноиди в южните популации, тъй като географската ширина корелира отрицателно с UV-B радиацията и температурата и положително с валежите. Глобалната радиация показва ясен широчинен градиент с по-високо разпространение в южната и източната част на Иберийския полуостров и също така има значителен орографски ефект, тъй като устойчивостта на облаците модулира разпространението на тази радиация на по-високи височини. Карта на UV радиация на Испания [45] посочена висока корелация (r > 0.9) между данните за UV-B и глобалната радиация. Според тази справка, популациите от мечо грозде, които показват по-висока средна стойностарбутинсъдържанието в нашето изследване се намира предимно в зони с нива на UV-B радиация от 2403–2451 J/m2.

Нашите резултати за вариациите на катехин в мечото грозде показват географски модел (Фигура 5) и са в съгласие с проучвания, проведени в други растителни видове от северните страни на Европа. По-високо съдържание на специализирани метаболити, като флавоноиди и антоцианини, се съобщава в растения, растящи на по-високи географски ширини, вероятно поради по-дълги периоди на дневна светлина и по-ниски нощни температури [46]. По този начин съдържанието на разтворими феноли в иглите на Juniperus communis се увеличава с географската ширина и надморска височина във финландските популации [47], а също така 10–19 процента по-високи фенолни съдържания са открити на по-висока географска ширина в плодовете на три Ribes spp. сортове, анализирани в две финландски местоположения [48]. Тези автори свързват по-ниското съдържание на феноли с по-високи нива на радиация и температура. Съдържанието на флавоноиди в плодовете на два вида Vaccinium (също от семейство Ericaceae) показва географски градиент, с по-високи количества на флавоноиди в северните ширини [49, 50].

Във връзка с вариациите на надморската височина, по-високи нива на флавоноиди са определени в популациите на други видове Ericaceae, Calluna vulgaris, растящи на по-висока надморска височина [51]. Височинните градиенти също повлияват специализирания метаболизъм на испанските популации на Arnica montana [52] и Quercus robur [53]. Последната работа се позовава на значителна положителна връзка между концентрацията на общите феноли в листата и повишаването, тъй като градиентът зависи само от флавоноидите, което предполага, че тези съединения доведоха до връзката за общите феноли. Тези резултати са в съгласие с нашите оценки за модела на съдържание на катехини. И накрая, градиентът на валежите беше свързан със значителни разлики в състава на полифенолите в африкански лечебен храст (Myrothamnus flabellifolia), за който метаболомните разлики бяха в съответствие с генетичната структура на популациите [54].

CISTANCHE МОЖЕ ПРОТИВ СТАРЕЕНЕ

2.2. Анализ на данни за размера на генома и последователността

Стойностите на размера на генома 2C на растенията от мечо грозде варират от 2,50 до 3,15 pg (Таблица 1). Бяха открити леки разлики в количеството на ядрената ДНК сред популациите (Kruskal–Wallis χ2=87.639, df=36,p=3.39 × 10−6). Тестът на Dunn с корекция на Bonferroni разкрива статистически значими разлики между: AL и SI популации (Z=−3,972, p=0.024), LE и SI (Z=−4,196, p {{ 21}}.009) и SE и SI (Z=−4.236, p=0.008). Популацията на Pontils (PO) е типичното находище на A. uva-ursi var.crassifolius, което впоследствие е комбинирано като A. uva-ursi subsp. crassifolius и понастоящем не се разглежда таксономично (виж въведението), има междинна стойност (2,88 pg), в рамките на диапазона на стойностите, получени в други популации на вида. Това е първото обширно популационно изследване на количеството ядрена ДНК във вида и целия род, тъй като единствената налична информация към днешна дата идва от една балканска популация на същия таксон [55]. Отчетената там стойност на 2C, 2,49 pg, е поставена точно на долната граница на обхвата на вариация на изследвания тук набор от данни. Не е открита връзка между стойностите на размера на генома и надморската височина на населението. Количеството ДНК на индивидите показва слаба положителна значима корелация сарбутинсъдържание, когато са сравнени данни от 158 растения мечо грозде (rho=0.187, p=0.018), докато не е открита друга значима корелация между размера на генома и други променливи. Този резултат е в съгласие с отчетените увеличения в производството на специализирани метаболити, които обикновено се наблюдават в лечебни и ароматни растения след полиплоидизация [29].

Новопроизведени последователности за rpl{0}}trnL и psbE-petN междугенни спейсери бяха подредени в две матрици (съответно съдържащи 566 и 874 bp), които бяха свързани в една матрица от 1440 bp. бяха открити нива на вариация в тези пластидни региони (шест нуклеотидни замествания и четири индела). Открити са десет различни хаплотипа с общо хаплотипово разнообразие (Hd) от 0.468 (Таблица 1). Повечето популации (21) съдържат само един хаплотип, докато пет от тях показват известно разнообразие сред индивидите. Най-разпространеният хаплотип 1 показва най-висока честота (71,4 процента), следван от хаплотип 2 (15,2 процента), докато останалите показват много по-ниски честоти (0,04–0,01 процента). Географското разпределение на хаплотипове е показано на Фигура 6. Хаплотип 1 е открит в 32 популации - той е фиксиран в 18 от тях - разпределени във всички региони, взети в извадката, с изключение на най-южните населени места. Хаплотип 2 беше открит в десет популации и беше изключителният хаплотип в двете най-южни популации (HU и LV), както и в PR. Хаплотип 4 е частен от три популации от Пиренеите, докато хаплотип 8 се появява в две популации от източната част на Иберийския полуостров. По отношение на еволюционните връзки, показани в мрежата на пестеливостта (Фигура 6), повечето от хаплотиповете са свързани с една или две стъпки на мутация. Хаплотип 1 заема централна позиция, като към него са свързани седем хаплотипа.

Тест на Mantel между pDNA генетични и химически двойни матрици на разстояния показа слаба, но значима корелация (r=0.301; p=0.048) между генетичната диференциация и концентрацията на петте химически компонента, измерени за Набор от данни за 2016 г. Тестът на Mantel не разкри никаква значима корелация между генетичното и географското разстояние между 25-те популации, взети в извадка през 2016 г. (r=0.103, p=0.207) или между химическите и географските разстояния по двойки между тях 25 популации (r=0.191, p=0.050). Фитохимичната променливост, докладвана тук за дивите популации на мечо грозде в Испания, следователно се допълва от умерени нива на вариация на хаплотипа на pDNA, което е генетичната диференциация север-юг, открита в популациите на мечо грозде, сравнима с филогеографските модели, открити в други растения (напр. [56–58]. Цялата тази хомогенност се очаква при растения с нисък репродуктивен капацитет [59], като A. uva-ursi, който показва слаби нива на покълване и високи нива на смъртност на млади разсад [4].Въпреки това, скромната генетична диференциация, показана от pDNA, корелира с биохимичните разстояния по двойки, оценени от профила на пет фенолни Фигура 6. Географско разпределение на pDNA хаплотипове върху иберийски популации на Arctostaphylos uva-ursi. правоъгълник, статистическата пестелива мрежа, показваща еволюционните връзки на te Представени са n пластидни хаплотипове, намерени в популацията на A. uva-ursi. Всяка ивица по протежение на линиите, свързващи хаплотиповете, показва една мутационна стъпка в pDNA регионите, секвенирани в това изследване. Тест на Mantel между pDNA генетични и химични двойни матрици на разстояние показва слаба, но значителна корелация (r=0.301; p {{28 }}.048) сред генетичната диференциация и концентрацията на петте химически компонента, измерени за набора от данни за 2016 г. Тестът на Mantel не разкрива никаква значима корелация между генетичното и географското разстояние между 25-те популации, взети в извадката през 2016 г. (r=0.103, p=0.207) или между химическите и географските разстояния по двойки между тези 25 популации ( r=0.191, p=0.050). Фитохимичната вариабилност, докладвана тук за дивите популации на мечо грозде в Испания, следователно е допълнена от умерени нива на pDNA хаплотипова вариация, като генетичната диференциация север-юг, открита в популациите на мечо грозде, е сравнима с филогеографските модели, открити в други растения (напр. [56–58]. Цялата тази хомогенност се очаква при растения с нисък репродуктивен капацитет [59], като A. uva-ursi, който показва слаби нива на покълване и високи нива на смъртност на млади разсад [4].Въпреки това, скромната генетична диференциация, показана от pDNA, корелира с биохимичните разстояния по двойки, оценени от профилите на пет фенолни съединения.Този модел на генетична и фитохимична вариация (която, както беше споменато, не е свързана с географски разстояния), както и слабата, но значителна корелация между размера на генома и съдържанието на арбутин, може да означава, че естествената геномна вариабилност влияе върху добива на фенолни съединения в A. uva-ursi Въпреки това, хипервариабилните молекулни m arkers в по-обширна популационна извадка са необходими, за да се потвърдят тези филогеографски модели и връзката между генетичната и биохимичната променливост.

CISTANCHE ИМА АНТИОКСИДАЦИОННИ ЕФЕКТИ

3. Материали и методи

3.1. Растителен материал

За фитохимичен анализ бяха взети проби от общо 249 растения мечо грозде, растящи в 42 популации през есента на 2014 г., 2015 г. и 2016 г., които са представителни за естественото разпространение на този растителен вид на Иберийския полуостров (Фигура 1 и Таблица S1). Първо, през есента на 2014 г. събрахме крайни издънки от 80 растения в десет испански популации (AG, AN, BA, LI, LO, PE, PÁ, SR, SC и SE), разположени в относително малка площ (приблизително 80 × 50 km) в Северна Испания, но в широк диапазон от надморска височина (424–1410 m надморска височина). Второ, през есента на 2015 г. събрахме 48 растения от шест от тези популации (AG, LI, LO, PA, SE и SR) и 46 растения мечо грозде от шест популации, разположени на по-ниски географски ширини (AL, CH, ET, HU, LV и PI). За всяка популация взехме проби от осем растения, разделени на поне 5 m, с изключение на HU, където открихме само шест индивида. Трето, през есента на 2016 г. бяха взети проби от общо 140 растения в 29 различни места (1-6 индивида от всяко), включително 26 нови испански находища (IZ, CE, BT, MO, AA, GU, SI, AF, SA, PT, AB, CG, OD, PS, LB, CO, LE, MA, CP, PO, MZ, AV, LC, AY, LN и ZU). Нашето вземане на проби обхваща диапазон на надморска височина от 534 до 1750 m. Като цяло 42-те популации представляват широк спектър от климатични условия (Таблица S1): максималната средна температура показва 2-кратна вариация (13–26 ◦C) и годишните валежи варират от 399 (ZU) до 1589 mm (PT). Глобалната радиация варира от 4,2 до 5,1 kWh/m2d. Шест до десет крайни издънки (15–20 cm дълги) бяха събрани за всяко растение, за да се получат 6–15 g здрави листа, които впоследствие бяха изрязани и изсушени при 60 ◦C до постоянно тегло (3–4 дни). След определяне на сухото тегло, листата се хомогенизират ръчно в хаван и се съхраняват при 4 ◦C до анализиране. Този растителен материал е използван за определяне на общите феноли и HPLC.

Листни материали за поточни цитометрични оценки са получени от пресни листа на 178 индивида, принадлежащи към общо 37 популации (Таблица 1). Бяха получени проби от 33 от популациите, споменати по-горе, и от четири нови популации (BE, JO и PR в Испания и EN в Андора), където листата бяха събрани през пролетта на 2017 г. и следователно не бяха включени във фитохимичния анализ (Фигура 1 и Таблица S1). От един до шест индивида на популация бяха измерени в два екземпляра. Листните материали за екстракция на ДНК бяха изсушени в силикагел и съхранени при стайна температура. Анализите на разнообразието на ДНК бяха извършени в общо 105 растения от 35 места (Таблица 1).

Растителни ваучери на 46 изследвани популации мечо грозде са депозирани в хербариума BC, на Instituto Botànic de Barcelona, ​​в хербариума BCN, на Centre de Documentació de Biodiversitat Vegetal, Universitat de Barcelona или в хербариума JACA, на Instituto Pirenaico de Ecología ( CSIC).

3.2. Приготвяне на екстракти от листа и определяне на общите феноли

Три копия на екстракти от листа на мечо грозде бяха приготвени чрез използване на 50 mg изсушена проба и 10 mL 80 процента метанол. Епруветките се инкубират в продължение на 3 0 минути в ултразвукова баня и след това екстрактите се филтруват (0,45 mm) и се съхраняват при 4 ◦C до анализиране. Общото фенолно съдържание беше определено в екстрактите, приготвени от проби, събрани през 2014 г. и 2015 г. Следвахме метод на Folin–Ciocalteu [60,61] с леки модификации: до 0,1 mL екстракт, 0,4 mL метанол (80 процента), 0,5 mL Folin– Добавят се реагент Ciocalteu и 8 mL ултрачиста вода. След 5 минути в ултразвукова баня се добавя 1 mL Na2CO3 20 процента (w/v). Пробите бяха оставени на тъмно за 30 минути преди измерване на абсорбцията при 760 nm с помощта на UV-видим спектрофотометър (CARY 50 BIO, Varian, AgilentTechnologies). Резултатите са изразени в еквиваленти на галова киселина (GAE); тоест mg галова киселина/g dr wt, като се използва стандартна крива на галова киселина (40–340 µg/g).

3.3. Определяне на арбутин и други фенолни метаболити

Фенолното съдържание на метанолни екстракти от листа на мечо грозде се определя количествено чрез RP-HPLC с помощта на HPLC-UV/Vis система (LaChrom Merck Hitachi L-7400) с Kinetex 5 µm-EVO C18(250 mm × 4,6 mm ) колона и абсорбция, определена при 280 nm. Екстрактите от проби, събрани през 2014 г. и 2015 г., бяха разредени 1:10 (v/v) и инжектирани с подвижна фаза от метанол и ацетонитрил. Градиентната програма се състоеше от 0–5 минути, 25 процента метанол; 5–6 минути, 100 процента; 6–10 минути, 100 процента; и 10–20 минути, отново 25 процента метанол. Скоростта на потока беше 1 mL/min и инжекционният обем беше 20 µL. При тези условия времето на задържане наарбутинбеше 2,6 минути, което ни позволява да определим концентрацията на това съединение с помощта на калибровъчна крива, установена с 6 разреждания на стандарт, от 40 до 340 µg/g, с корелационен коефициент от r=0. 9997. Екстрактите от проби, събрани през 2016 г., бяха анализирани с помощта на подвижна фаза от метанол и вода със следната градиентна програма: 0–5 минути, 10 процента метанол; 5–6 минути, 20 процента; 6–10 минути, 20 процента; 10–11 минути, 30 процента; 11–15 минути, 30 процента; 15–16 минути, 40 процента; 16–20 минути, 40 процента; 20–21 минути, 50 процента; 21–25 минути, 50 процента; 25–26 минути, 60 процента; 26–30 минути, 60 процента; 30–31 минути, 10 процента; и 31-36 минути, отново 10 процента метанол. В тези условия определихмеарбутин идруги 4 фенолни съединения: кафеена киселина, катехин, мирицетин и кверцетин-3-О-глюкопиранозид, като се използват съответните калибрационни криви, установени с 5 разреждания на стандарти (25–500 µg/mL) , което показва коефициенти на корелация от {{10}}.9992 за катехин (време на задържане 12.0 минути), 0.9924 за кафеена киселина (време на задържане 13.4 минути), 0.9981 за кверцетин{{16} }О-глюкозид (време на задържане 23,4 минути) и 0,9997 за мирицетин (време на задържане 25,1 минути).

Метанолът и ацетонитрилът са с клас HPLC и са закупени от Panreac (Барселона, Испания). Стандарти (чистота по-голяма или равна на 98 процента) отарбутин, кафеена киселина и галова киселина, както и реагентът на Folin-Ciocalteu бяха закупени от Sigma-Aldrich (Барселона, Испания). Стандартите за катехин и кверцетин-3-О-глюкопиранозид са закупени от Extrasynthese (Genay Cedex, Франция), докато мирицетинът е закупен от Alfa Aesar (Карлсруе, Германия).

Резултатите от химичните определяния бяха анализирани с помощта на софтуер SPSS v. 25 и R 3.5.2. След тестване на данните за нормалност и хомоскедастичност, ние извършихме анализ на дисперсията на различни набори от данни и тестове за разделяне на средни стойности (Tukey и Tamhane) или непараметрични тестове като тест за множествено сравнение на Kruskal–Wallis и Dunn с корекция на Bonferroni. Ние също оценихме коефициентите на корелация (Pearson или Spearman в зависимост дали данните следват нормално разпределение) между променливите, включително размера на генома.

CISTANCHE ИМА АНТИОКСИДАЦИОННИ ЕФЕКТИ

3.4. Оценки на размера на генома и секвениране на ДНК

Размерът на генома на растенията от мечо грозде е оценен чрез поточна цитометрия в Centers Sientíficsi Tecnològics, Universitat de Barcelona (CCiTUB), следвайки процедурите, обяснени в Pellicer et al. [62]. Petunia hybrida Vilm. 'PxPc6' (2C=2.85 pg) се използва като вътрешен стандарт. Семената на стандарта бяха предоставени от Plateforme de cytométrie d'Imagerie-Gif, CNRS—I2BC (Gif-sur-Yvette, Франция). Съдържанието на ядрена ДНК (2C) беше изчислено чрез умножаване на известното съдържание на ДНК на стандарта по частното между пикови позиции (режим) на целевите видове и стандарта в хистограмата на интензитетите на флуоресценция, като се приема линейна корелация между флуоресцентните сигнали от оцветените ядра на неизвестния образец, известния вътрешен стандарт и количеството ДНК [63].

Приблизително 20 mg изсушена със силициев диоксид листна тъкан беше използвана за екстракция на ДНК, като се използва протокол CTAB [64] с незначителни модификации. Качеството на общата ДНК беше проверено със спектрофотометър NanoDrop 1000 (ThermoScientific, Wilmington, DE, USA). Пластидните междугенни региони rpl32-trnLand psbE-petN, както и ядреният рибозомен ДНК регион ITS, бяха амплифицирани и секвенирани за три индивида на популация. Последователностите на ITS не показват вариабилност в рамките на 105 анализирани индивида, с изключение на няколко позиции, показващи интрагеномни нуклеотидни полиморфизми. Следователно тази ядрена рибозомна ДНК област беше изключена от по-нататъшен анализ. Други пластидни ДНК региони (т.е. ndhF; ndhF-rpl32; psbA-trnH; psbD-trnT; rps16; и trnL-trnF) също бяха тествани, но те бяха изхвърлени поради ниска вариабилност или проблеми със секвенирането. Процедурата на амплификация се извършва, както е описано във Vitales et al. [65]. Директното секвениране на амплифицираните ДНК сегменти беше извършено с Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 3.1 (PE Biosystems, Foster City, Калифорния, САЩ) в Unitatde Genòmica, CCiTUB, на ABI PRISM 3700 ДНК анализатор (PE Biosystems). Последователностите rpl32-trnL и psbE-petN бяха събрани с BioEdit версия 7.1.3.0 [66], подравнени с ClustalW MultipleAlignment v1.4 [67] и коригирани ръчно. Номерата за достъп до GenBank са предоставени в таблица S2.

3.5. Размер на генома и генетичен анализ

Извършен е непараметричен тест на Kruskal-Wallis, за да се провери за статистически значими разлики в стойностите на 2C между популациите. Тестовете за множествено сравнение на Dunn също бяха проведени, за да се определи кои популации показват значителни разлики между тях. Корекцията на Bonferroni беше приложена, за да се минимизира грешката от тип I (фалшиво положително).

Параметрите на генетичното разнообразие (полиморфни сайтове, информативни сайтове за пестеливост, броят на хаплотиповете и общото хаплотипово разнообразие) бяха оценени с помощта на DnaSP v6 [68]. Пластидните хаплотипове бяха определени в комбиниран набор от данни, който включваше както rpl32-trnL, така и psbE-petN регионите. Инделите бяха кодифицирани с FastGap v.1.2 [69] и третирани като събития с единична мутация. Еволюционните връзки между хаплотиповете бяха изведени въз основа на мрежа за пестеливост, конструирана с помощта на TCS [70], както е приложено в PopArt [71]. Максималният брой разлики, произтичащи от единични замествания между хаплотипове, беше изчислен с 95 процента доверителни граници.

За да се анализира връзката между генетични и химични данни, беше извършен тест на Mantel. Първо, ние оценихме фенотипното разстояние между 25 популации, използвайки данни от растения мечо грозде, събрани през 2016 г., които бяха измерени за пет фенолни компонента (т.е.арбутин, катехин, кафеена киселина, кверцетин и мирицетин). Използвахме R Commander, за да стандартизираме тези данни [72] и впоследствие да изчислим химическото разстояние, получено от стандартизираната матрица с функцията "Dist" върху R въз основа на евклидови разстояния. Второ, матрицата на генетичното разстояние по двойки на популацията на Nei беше изчислена между 25-те популации, използвайки DnaSP v6. И накрая, ние изчислихме географските разстояния по двойки сред тези популации, като използвахме пакета "geodist" в R. Корелациите по двойки между матриците на разстоянията бяха изчислени с помощта на тест Mantel с 10 000 пермутации с функцията mantel, налична в пакета R "vegan" [ 73].

4. Изводи

Всички анализирани растения мечо грозде показахаарбутинсъдържание над 7 процента; следователно този растителен материал е подходящ за билкови препарати. Нашият анализ разкри по-високо съдържание на арбутин от това (до 9 процента), посочено от Parejo et al. [40], които анализираха четири популации, разположени в североизточните Пиренеи на 1580–2030 m и откриха ниски разлики в съдържанието на арбутин сред популациите. Освен това повечето от стойностите, определени тук, са в обхвата на растителния материал, избран за култивиране в Полша [74] и в съответствие с високитеарбутинсъдържание на проби от листа от испанско мечо грозде, докладвани от Sonnenschein и Tegtmeier [42] при избора на растения за култивиране в Германия. Елитните генотипове на A. uva-ursi могат да се размножават вегетативно, но повечето от получените клонове се провалят по време на установяването на полето, което ограничава експлоатацията на тези ресурси. Ние също така описахме съществуващата вариация в съдържанието на три флавоноида (катехин, мирицетин и кверцетинглюкозид), както и на кафеената киселина, сред популациите на испанското мечо грозде и как климатичните фактори (основно глобална радиация и валежи), които корелират с географската ширина и надморската височина градиенти, засягат тази вариация. В същото време, въпреки ниските нива на променливост на размера на хаплотипа и генома, определени в иберийски A. uva-ursi, генетичната и цитогенетична диференциация на популациите е слабо, но значително свързана с фитохимичното разнообразие. Като цяло, тези резултати подчертават, че ефектът както на генетичните, така и на абиотичните фактори трябва да се вземе предвид, за да се обясни вътрешноспецифичната фитохимична променливост, открита в растения от диви популации.

CISTANCHE ЕФЕКТИ

Препратки

1. Moore, BD; Андрю, RL; Külheim, C.; Foley, WJ Обяснявайки вътревидовото разнообразие в растителните вторични метаболити в екологичен контекст. Нов фитол. 2014, 201, 733–750. [CrossRef] [PubMed]

2. Чейние, В.; Comte, G.; Davies, KM; Lattanzio, V. Растителни феноли: последните постижения в тяхната биосинтеза, генетика и екофизиология. Физиология на растенията. Biochem. 2013, 72, 1–20. [CrossRef]

3. Бернал, М.; Llorens, L.; Julkunen-Tiitto, R.; Badosa, J.; Verdaguer, D. Височинни и сезонни промени на фенолните съединения в листата и кожичките на Buxus sempervirens. Физиология на растенията. Biochem. 2013, 70, 471–482 [CrossRef] [PubMed]

4. Upton, R. (Ed.) Uva-ursi Leaf. Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. Стандарт за анализ, качествен контрол и терапия; Американска билкова фармакопея: Scotts Valley, Калифорния, САЩ, 2008 г.; 30p.

5. Европейска агенция по лекарствата. Доклад за оценка на Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. Фолиум. EMA/HMPC/750266/2016; Европейска агенция по лекарствата: Амстердам, Холандия, 2018.6. Kanlayavattanakul, М.; Lourith, N. Растения и природни продукти за лечение на кожна хиперпигментация - Преглед. Planta Med. 2018, 84, 988–1006. [CrossRef]

7. Мигас, П.; Krauze-Baranowska, M. Значението на арбутин и неговите производни в терапията и козметиката. Phytochem. Лет. 2015, 13, 35–40. [CrossRef]

8. Seo, DH; Юнг, JH; Лий, JE; Jeon, EJ; Ким, У.; Park, CS Биотехнологично производство на арбутин (- и -арбутин), агенти за изсветляване на кожата и техните производни. Приложение Microbiol. Биотехнология. 2012, 95, 1417–1425 [CrossRef]

9. Жу, X.; Tian, ​​Y.; Джан, В.; Джан, Т.; Guang, C.; Mu, W. Скорошен напредък в биологичното производство на -арбутин. Приложение Microbiol. Биотехнология. 2018, 102, 8145–8152. [CrossRef] [PubMed]

10. Дейви, М. Вторичен метаболизъм в растителни клетъчни култури. В Encyclopedia of Applied Plant Sciences, 2-ро издание; Thomas, B., Murphy, DJ, Murray, BG, Eds.; Elsevier: Лондон, Великобритания, 2017 г.; Том 2, стр. 462–467. [CrossRef]

11. Куркин, В.А.; Рязанова, Т.К.; Даева, ED; Kadentsev, VI Съставки на Arctostaphylos uva-ursi листа. Хим. Нац. Compd. 2018, 54, 278–280. [CrossRef]

12. Панда, А.; Петручи, Р.; Marrosu, G.; Мултари, Г.; Romana-Gallo, F. HPLC-PDAESI-TOF/MS метаболитно профилиране на Arctostaphylos pungens и Arctostaphylos uva-ursi: Сравнително изследване на фенолни съединения от метаболитен екстракт от листа. Фитохимия 2015, 115, 79–88. [CrossRef]

13. Оленников, Д.Н.; Chekhirova, GV 60-Galloylpicein и други фенолни съединения от Arctostaphylos uva-ursi.Chem. Нац. Compd. 2013, 49, 1–7. [CrossRef]

14. Брюър, MS Естествени антиоксиданти: източници, съединения, механизми на действие и потенциални приложения. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2011, 10, 221–247. [CrossRef]

15. Амарович, Р.; Pegg, RB; Rahimi-Moghaddam, P.; Баре, Б.; Weil, JA Капацитет за отстраняване на свободни радикали и антиоксидантна активност на избрани растителни видове от канадските прерии. Food Chem. 2004, 84, 551–562 [CrossRef]

16. Карпентър, Р.; О'Грейди, Минесота; O'Callaghan, YC; О'Брайън, NM; Kerry, JP Оценка на антиоксидантния потенциал на екстракти от гроздови семена и мечо грозде в сурово и варено свинско месо. Месо Sci. 2007, 76, 604–610. [CrossRef][PubMed]

17. Мекиниц, И.Г.; Скроза, Д.; Любенков, И.; Каталин, В.; Šimat, V. Антиоксидант и антимикробен потенциал на фенолни метаболити от традиционно използвани средиземноморски билки и подправки. Храни 2019, 8, 579. [CrossRef]

18. Мохд Азман, NA; Галего, MG; Сеговия, Ф.; Абдула, С.; Shaarani, SM; Almajano, MP Проучване на свойствата на екстракт от листа от мечо грозде като естествен антиоксидант в моделни храни. Антиоксиданти 2016, 5, 11 [CrossRef] [PubMed]

19. Пег, РБ; Amarowicz, R.; Naczk, M. Антиоксидантна активност на полифеноли от екстракт от листа от мечо грозде (Arctostaphylos uva-ursi L. Sprengel) в месни системи. Във фенолни съединения в храни и естествени здравословни продукти; Shahidi, F., Ho, CT, Eds.; Американско химическо дружество: Вашингтон, САЩ, 2005 г.; стр. 67–82 [CrossRef]

20. Врона, М.; Blasco, S.; Becerril, R.; Nerín, C.; Продажби, Е.; Asensio, E. Антиоксидантни и антимикробни маркери от UPLC®–ESI-Q-TOF-MSE на нова многослойна активна опаковка, базирана на Arctostaphylos uva-ursi. Talanta 2019, 196, 498–509. [CrossRef]

21. Майер, М.; Olbermann, AL; Ренър, М.; Weidner, E. Скрининг на европейски лечебни билки за тяхното съдържание на танин - Нови потенциални дъбилни агенти за кожарската промишленост. Инд. култура произв. 2017, 99, 19–26. [CrossRef]

22. Борос, Б.; Якабова, С.; Мадарас, Т.; Молнар, Р.; Галамбос, Б.; Kilár, F.; Fellinger, A.; Farkas, A. Валидиран HPLC метод за едновременно количествено определяне на бергенин, арбутин и галова киселина в листа от различни видове Bergenia. Chromatographia 2014, 77, 1129–1135. [CrossRef]

23. Miaw-Ling, C.; Chur-Min, C. Едновременно HPLC определяне на хидрофилен избелващ агент в козметичен продукт. J. Pharm. Biomed. анален 2003, 33, 617–626. [CrossRef]

24. Парехо, И.; Виладомат, Ф.; Bastida, J.; Codina, C. Единична стъпка на екстракция в количествения анализ на арбутининово мечо грозде (Arctostaphylos uva-ursi) листа чрез високоефективна течна хроматография. Phytochem. Anal.2001, 12, 336–339. [CrossRef]

25. МОЩНОСТ. Растения на света онлайн. Налично онлайн: http://www.plantsoftheworldonline.org/ (достъп на 29 април 2020 г.).

26. Салем, А.; Харис, CS; Асим, М.; Cuerrier, A.; Martineau, L.; Хадад, PS; Arnason, JTRP-HPLC-DAD-APCI/MSD метод за характеризиране на медицински Ericaceae, използвани от първите нации Eeyou IstcheeCree. Phytochem. анален 2010, 21, 328–339. [CrossRef] [PubMed]

27. Stefanescu, BE; Сабо, К.; Мокан, А.; Crisan, G. Фенолни съединения от листа от пет вида Ericaceae и свързаната с тях бионаличност и ползи за здравето. Молекули 2019, 24, 2046. [CrossRef] [PubMed]

28. Онда, Й.; Mochida, K. Изследване на генетичното разнообразие в растенията с помощта на високопроизводителни техники за секвениране. Curr. Геном. 2016, 17, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

29. Iannicelli, J.; Guariniello, J.; Tossib, VE; Regalado, JJ; Di Ciaccioa, L.; van Barene, CM; Pitta Álvarez, SI; Escandón, AS „Полиплоиден ефект“ при отглеждането на ароматни и медицински видове. Sci. Хортик. 2020,260, 108854. [CrossRef]

30. Leitch, IJ; Leitch, AR Разнообразие на размера на генома и еволюция в сухоземните растения. Разнообразие на генома в растенията, том 2, Физическа структура, поведение и еволюция на геномите на растенията; Leitch, IJ, Greilhuber, J., Doležel, J., Wendel, JF, Eds.; Springer: Виена, Австрия, 2013; стр. 307–322. [CrossRef]

31. Бенет, доктор по медицина; Leitch, IJ Количества на ядрена ДНК в покритосеменни растения - напредък, проблеми и перспективи. Ann. Бот. 2005, 95, 45–90. [CrossRef]

32. Грегъри, TR (Ed.) Еволюцията на генома; Elsevier: Сан Диего, Калифорния, САЩ, 2005 г.

33. Hoang, PN; Шуберт, В.; Майстер, А.; Fuchs, J.; Shubert, I. Вариации в размера на генома, обема на клетките и ядрата, броя на хромозомите и локусите на rDNA сред водопадите. Sci. Rep. 2019, 9, 3234. [CrossRef]

34. Найт, Калифорния; Молинари, Н.; Петров, Д. А. Хипотезата за ограничаване на големия геном: еволюция, екология и фенотип. Ан. Бот. 2005, 95, 177–190. [CrossRef]

35. Pellicer, J.; Идалго, О.; Додсуърт, С.; Leitch, IJ Разнообразие на размера на генома и неговото въздействие върху еволюцията на сухоземните растения. Genes 2018, 9, 88. [CrossRef]

36. Царев, И.; Rušˇci´c, М.; Skoˇcibuši´c, М.; Maravi´c, A.; Силяк-Яковлев, С.; Politico, O. Фитохимична и цитогенетична характеристика на Centaurea solstitialis (Asteraceae) от Хърватия. Chem. Биологолази. 2017, 14, e1600213 [CrossRef]

37. Коул, IB; Cao, J.; Алън, RA; Saxena, PK; Murch, SJ Сравнения на Scutellaria baicalensis, Scutellarialateriflora и Scutellaria racemosa: Размер на генома, антиоксидантен потенциал и фитохимия. Planta Med. 2008, 74, 474–481. [CrossRef]

38. Карвальо, YGS; Виторино, LC; де Соуза, UJB; Bessa, LA Последни тенденции в изследванията на генетичното разнообразие на растенията: Последици за опазването. Разнообразие 2019, 11, 62. [CrossRef]

39. Уей, С.; Янг, В.; Уанг, X.; Hou, Y. Високо генетично разнообразие в застрашено лечебно растение, Saussureainvolucrata (Saussurea, Asteraceae), в западните планини Тяншан, Китай. Консерв. Женет. 2017, 18, 1435–1447. [CrossRef]

40. Chang, YJ; Cao, YF; Zhang, JM; Tian, ​​LM; Донг, XG; Джан, Й.; Qi, D.; Zhang, XS Изследване на разнообразието на хлоропластната ДНК на култивирани и диви круши (Pyrus L.) в Северен Китай. Дърво Генет. Геноми 2017, 13, 44 [CrossRef]

41. Парехо, И.; Виладомат, Ф.; Bastida, J.; Codina, C. Вариация на съдържанието на арбутин в различни диви популации на Arctostaphylos uva-ursi в Каталония, Испания. J. Билки Подправки Med. Растения 2002, 9, 329–333. [CrossRef]

42. Sonnenschein, M.; Tegtmeier, M. Експерименти върху опитомяването на мечо грозде (Arctostaphylos uva-ursi (L.)Spreng.). J. Med. Растения за подправки 2012, 17, 124–128.

43. Чен, HY; Lin, YC; Hsieh, CL Оценка на антиоксидантната активност на воден екстракт от някои избрани хранителни билки. Food Chem. 2008, 104, 1418–1424. [CrossRef]

44. Del Valle, JC; Buide, ML; Казимиро-Соригер, И.; Whittall, JB; Narbona, E. Относно натрупването на флавоноиди в различни растителни части: Вариационни модели сред индивиди и популации в бреговия лагер (Silene littorea). Преден. Plant Sci. 2015, 6, 939. [CrossRef]

45. Мартинес-Каденас, К.; Лопес, С.; Рибас, Г.; Flores, C.; Гарсия, О.; Севиля, А.; Smith-Zubiaga, I.; Ibarrola-Villaba, M.; Пино-Янес, М.М.; Gardeazabal, J.; et al. Едновременна пречистваща селекция на предшественика на алела MC1R и положителна селекция на рисковия от меланом алел v60l в южните европейци. Mol. Biol. Еволюция 2013, 30, 2654–2665. [CrossRef]

46. ​​Джакаола, Л.; Hohtola, A. Ефект на географската ширина върху биосинтеза на флавоноиди в растенията. Околна среда на растителна клетка. 2010, 33, 1239–1247. [CrossRef]47. Марц, Ф.; Пелтола, Р.; Фонтана, С.; Дювал, RE; Julkunen-Tiitto, R.; Stark, S. Ефект на географската ширина и надморска височина върху терпеноидния и разтворимия фенолен състав на игли от хвойна (Juniperus communis) и оценка на тяхната антибактериална активност в бореалната зона. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 9575–9584. [CrossRef]

48. Янг, Б.; Zheng, J.; Laaksonen, O.; Тахвонен, Р.; Kallio, H. Ефекти от географската ширина и метеорологичните условия върху фенолните съединения в сортове касис (Ribes spp.). J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 3517–3532. [CrossRef][PubMed]

49. Lätti, AK; Яакола, Л.; Riihinen, KR; Kainulainen, PS Вариация на антоцианин и флавонол в горски плодове (Vaccinium uliginosum L.) във Финландия. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 427–433. [CrossRef] [PubMed]

50. Лати, Аляска; Riihinen, KR; Kainulainen, PS Анализ на вариациите на антоцианините в дивите популации на черна боровинка (Vaccinium myrtillus L.) във Финландия. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 190–196. [CrossRef]

51. Моншайн, М.; Иглесиас, Дж.; Кунерт, О.; Bucar, F. Фитохимия на хедър (Calluna vulgaris (L.) Hull) и нейната надморска промяна. Phytochem. Rev. 2010, 9, 205–215. [CrossRef]

52. Пери, NB; Бърджис, EJ; Родригес Гуитиан, MA; Ромеро Франко, Р.; Лопес Москера, Е.; Смолфийлд, BM; Джойс, NI; Littlejohn, RP Сесквитерпенови лактони в Arnica montana: Helenalin и dihydrohelenalinchemotypes в Испания. Planta Med. 2009, 75, 660–666. [CrossRef] [PubMed]

53. Абдала-Робъртс, Л.; Assmann, S.; Berny-Mier, Y.; Теран, JC; Covelo, F.; Глаузер, Г.; Морейра, X. Биотични и абиотични фактори, свързани с вариациите на надморската височина в чертите на растенията и тревопасните в доминиращия вид дъб. Am. J. Bot. 2016, 103, 2070–2078. [CrossRef] [PubMed]

54. Бентли, Дж.; Moore, JP; Farrant, JM Метаболомика като допълнение към филогенетиката за оценка на вътрешновидовите граници в толерантния към изсушаване медицински храст Myrothamnus flabellifolia (Myrothamnaceae). Фитохимия 2019, 159, 127–136. [CrossRef] [PubMed]

55. Силяк-Яковлев, С.; Пустахия, Ф.; Šoli´c, EM; Boguni´c, F.; Муратович, Е.; Башиц, Н.; Catrice, O.; Brown, CST Към база данни за размера на генома и броя на хромозомите на балканската флора: C-стойности в 343 таксона с нови стойности за 252. Adv. Sci. Лет. 2010, 3, 190–213. [CrossRef]

56. Гаридо, JL; Алкантара, JM; Rey, PJ; Медрано, М.; Guitián, J.; Кастеланос, MC; Bastida, JM; Jaime, R.; Herrera, CM Географска генетична структура на иберийските колумбини (gen. Aquilegia). Plant Syst. Еволюция 2017, 303, 1145–1160. [CrossRef

57. Listl, D.; Poschlod, P.; Reisch, C. Филогеография на здрава скала, оцеляла в европейски сухи пасища. PLoS ONE 2017, 12, e0179961. [CrossRef]

58. Олалде, М.; Херан, А.; Espinel, S.; Goicoechea, P. Филогеография на белите дъбове на Иберийския полуостров. Екол. Управл. 2002, 156, 89–102. [CrossRef]

59. Barrett, SCH Влияние на клоналността върху сексуалното размножаване на растенията. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 2015, 112,8859–8866. [CrossRef] [PubMed]

60. Skowyra, M.; Фалгера, В.; Gallego, G.; Peiro, S.; Almajano, MP Ефектът на екстрактите от Perilla frutescens върху окислителната стабилност на моделни хранителни емулсии. Антиоксиданти 2014, 3, 38–54. [CrossRef] [PubMed]

61. Pascoal, A.; Quirantes-Piné, R.; Фернандо, Алабама; Алексопулу, Е.; Segura-Carretero, A. Фенолен състав и антиоксидантна активност на листата на кенаф. Инд. култура произв. 2015, 78, 116–123. [CrossRef]

62. Pellicer, J.; Garnatje, T.; Molero, J.; Пустахия, Ф.; Силяк-Яковлев, С.; Vallès, J. Произход и еволюция на южноамериканските видове Artemisia (Asteraceae); доказателства от молекулярна филогенеза, рибозомна ДНК и данни за геномезиране. Aust. J. Bot. 2010, 58, 605–616. [CrossRef]

63. Doležel, J. Поточен цитометричен анализ на съдържанието на ядрена ДНК във висши растения. Phytochem. анален 1991, 2,143–154. [CrossRef]

64. Дойл, Дж. Doyle, JL Бърза процедура за изолиране на ДНК за малки количества прясна листна тъкан. Phytochem. Bull.Bot. Soc. Am. 1987, 19, 11–15.

65. Виталес, Д.; Feliner, GN; Vallès, J.; Garnatje, T.; Фират, М.; Álvarez, I. Ново описание на средиземноморския род Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae) въз основа на пластидни и ядрени ДНК маркери. Phytotaxa 2018, 349, 1–17. [CrossRef]

66. Hall, TA BioEdit: Удобен за потребителя редактор за подравняване на биологични последователности и програма за анализ за Windows95/98/NT. Nucleic Acids Symp. сер. 1999, 41, 95–98.

67. Томпсън, JD; Хигинс, DG; Gibson, TJ CLUSTAL W: Подобряване на чувствителността на прогресивното подравняване на множество последователности чрез претегляне на последователности, специфични за позицията наказания за пропуски и избор на матрица за тегло. Нуклеинови киселини Res. 1994, 22, 4673–4680. [CrossRef]

68. Розас, Дж.; Ферер-Мата, А.; Sánchez-DelBarrio, JC; Guirao-Rico, S.; Либрадо, П.; Ramos-Onsins, SE; Sánchez-Gracia, A. DnaSP 6: Анализ на полиморфизма на ДНК последователността на големи набори от данни. Mol. Biol. Evol.2017, 34, 3299–3302. [CrossRef] [PubMed]

69. Borchsenius, F. FastGap, версия 1.2; Катедра по бионауки, Орхуски университет: Орхус, Дания, 2009 г.; Налично онлайн: http://www.aubot.dk/FastGap_home.htm (достъп на 1 юли 2019 г.).

70. Климент, М.; Посада, DCKA; Crandall, KA TCS: Компютърна програма за оценка на генните генеалогии. Mol. Ecol. 2000, 9, 1657–1659. [CrossRef] [PubMed]

71. Лий, JW; Bryant, D. Popart: Пълнофункционален софтуер за изграждане на хаплотипна мрежа. Методи Ecol. Evol.2015, 6, 1110–1116. [CrossRef]

72. Fox, J. Първи стъпки с командния R: Графичен потребителски интерфейс с основна статистика към RJ Stat. Softw.2005, 14, 1–42. [CrossRef]

73. Оксанен, Й.; Blanchet, FG; Kindt, R.; Legendre, P.; О'Хара, РБ; Симпсън, GL; Солимос, П.; Стивънс, М.; Вагнер, Х. Веган: Екологичен пакет на общността. R пакет версия 1.17-4. 2010. Налично онлайн: http://CRAN.R-project.org/package=vegan (достъп на 19 септември 2010 г.).74. Malinowska, H. Избраните видове мечо грозде (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.) от естествени популации в Полша. Acta Soc. Бот. пол. 1995, 64, 91–96. [CrossRef]