Фенилетаноидни гликозиди индуцират апоптоза в Eca‑109 клетки чрез зависим от митохондриите път

Въведение

Ракът на хранопровода е един от най-разпространените видове рак с 11-то най-високо ниво на заболеваемост и 6-то най-високо ниво на смъртност в световен мащаб и е причинил ~439 000 смъртни случая през 2015 г. Честотата на рака на хранопровода значително варира в различните региони, с източните Азия и Източна и Южна Африка показват най-високи нива на заболеваемост, а Западна Африка показват най-ниски нива през 2012 г. В Китай изчислените случаи и смъртни случаи от рак на хранопровода са съответно 477,000 и 375,000 , през 2015 г. Въпреки че заболеваемостта от рак на хранопровода е намаляла в страните със среден и висок среден социално-демографски индекс между 2005 г. и 2015 г., смъртността остава висока поради лошата прогноза. Комбинацията от хирургична резекция с химиотерапия или лъчетерапия се използва за лечение на рак на хранопровода, но се съобщава, че между 2003 г. и 2014 г. 5-годишната преживяемост остава<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studyдемонстрира товаCistanche tubulosa фенилетаноидни гликозиди(CTPG) може да потисне растежа на клетките на меланома B16-F10 in vitro и in vivo (24). Въпреки това, лошата разтворимост във вода на използвания преди това CTPG ограничава разработването на лекарството. Поради това беше използван водоразтворим CTPG (CTPG-W) и беше изследван антитуморният ефект върху раковите клетки на хранопровода (Eca-109). Беше определено, че CTPG-W може в зависимост от дозата да инхибира жизнеспособността на Eca-109 клетки чрез индуциране на апоптоза чрез митохондриално-зависим път.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Материали и методи

животни.

Женски C57BL/6 мишки (6-8 седмици, ~25 g) бяха закупени от Центъра за изследване на лабораторни животни в Пекин (Пекин, Китай) и настанени в контролирана температура (25˚C), светлинен цикъл (12/ 12) Център за животни на университета Синдзян (Урумчи, Китай). Всички животни получиха вода и храна без патогени.

Клетъчна линия и култура.

Клетъчната линия на човешки карцином на хранопровода (Eca-109) беше запазена от Ключовата лаборатория за биологични ресурси и генно инженерство в Синдзян (Колеж по наука за живота и технологии, Университет Синдзян, Урумчи, Китай) и култивирана в RPMI{{1} } среда (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), допълнена с 10% топлинно инактивиран фетален говежди серум (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Китай), 1% L -глутамин (100 mM), 100 U/ml пеницилин и 100 µg/ml стрептомицин при 37˚C във влажна атмосфера, съдържаща 5% CO2.

Високоефективна течна хроматография (HPLC).

CTPG-W (кат. № SGJG20170410) е закупен от Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Основните съединения на CTPG бяха квалифицирани и количествено определени чрез HPLC съгласно нашето предишно проучване (24). Накратко, HPLC се провежда на колона ZORBAX SB‑C18 (250x4,6 mm; 5 µm) при 30˚C и се елуира с 0,2% разтвор на мравчена киселина и градиент на метанол, започващ от 23%, като 1 ml се добавя на всяка минута за 45 минути до достигане на 31%. Общо 10 ul проба се инжектира и се открива при 330 nm. Стандартът на ехинакозид е закупен от Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Шанхай, Китай), а стандартът на актеозид е закупен от Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Дармщат, Германия). Стандартите бяха използвани за анализ на компонентите на CTPG-W.

МТТ анализ.

Клетъчната пролиферация се измерва с МТТ анализ. Eca{{0}} клетки бяха инокулирани в 96-плаки с гнезда при плътност 5x103 клетки в 100 µl RPMI{{5 }} среда/ямка и се култивира при 37˚C за 24 часа, след което се третира с различни концентрации (0, 200, 400, 600 и 800 µg/ml) на CTPG-W или 0,4% диметилсулфоксид (DMSO) за 24, 48 и 72 часа. DMSO се използва като контролен разтворител (800 ug/ml CTPG-W, съдържащ 0.4% DMSO). Като положителна контрола се използва цисплатин (20 ug/ml). Впоследствие супернатантата се изхвърля след центрофугиране при 225 xg за 5 минути при стайна температура и към всяка ямка се добавят 100 µl МТТ разтвор (0,5 mg/ml в RPMI-1640 среда без FBS) и се инкубират при 37˚C за 3 ч. Образуваните формазанови кристали се разтварят в 200 ul DMSO. Стойностите на оптичната плътност (OD) бяха измерени при дължина на вълната 490 nm от 96-четец за микроплаки (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, СА, САЩ). Относителната клетъчна жизнеспособност се изчислява по формулата: Клетъчна жизнеспособност (%)=(ODтретирани/ODнетретирани)x100%. Морфологията на клетките Eca-109 се наблюдава с обърнат флуоресцентен микроскоп (увеличение, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Токио, Япония).

За пролиферацията на спленоцити, C57BL/6 мишки бяха евтаназирани чрез цервикална дислокация и далаците бяха изолирани. Едноклетъчната суспензия се прави и спленоцитите се посяват в 96-плаки с ямки с плътност 1x105 клетки/ямка в 100 µl RPMI-1640 среда и след това се третират с различни концентрации (0, 200, 400, 600 и 800 µg/ml) от CTPG-W за 24, 48 и 72 часа при 37˚C с 5% CO2. Пролиферацията на спленоцити се измерва чрез МТТ анализ, съгласно гореспоменатия протокол. Стимулиращ индекс=ОПЗлекуван/ОПЗ нелекуван.

Измерване на апоптозата и клетъчния цикъл. Eca{{0}} клетки се култивират в 60 mm панички при плътност 2,5x105 клетки/блюдо за 24 часа и се третират с различни концентрации ({{31} }, 200, 400, 600 и 800 µg/ml) от CTPG-W или 0,4% DMSO за 24 часа при 37˚C с 5% CO2. Клетките бяха събрани и оцветени с комплект за откриване на апоптоза на анексин V-флуоресцеин изотиоцианат (FITC)/пропидиев йодид (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай), съгласно протоколите на производителя. Пробите бяха събрани чрез поточна цитометрия (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) и анализирани от FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). За да се анализира ефектът на CTPG-W върху клетъчния цикъл, 2,5x105 Eca-109 клетки се посяват в 60 mm чаши за култури и се третират с CTPG-W (0, 100, 200 и 400 µg/ml) или 0,4 % DMSO за 24 часа при 37˚C с 5% CO2. Всички клетки бяха събрани и промити два пъти с ледено студен PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), след това фиксирани в 70% ледено студен етанол при 4°C за 30 минути. След двукратно промиване с ледено студен PBS, клетките се ресуспендират в 300 ul PI/RNase оцветяващ буфер (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) за 10 минути при стайна температура. Разпределението на клетъчния цикъл се анализира със софтуера ModFit LT 3.0 чрез поточна цитометрия (BD FACSCalibur).

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSAПротив умораЗащитете черния дроб PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Анализ на потенциала на митохондриалната мембрана (Δψm) и реактивните кислородни видове (ROS).За да се анализира Δψm, клетките Eca{{0}} бяха третирани с CTPG-W (0, 400, 600 и 800 µg/ml) или 0,4% DMSO за 24 часа при 37˚C с 5% CO2 и оцветени с комплекта за анализ на потенциала на митохондриалната мембрана с JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Шанхай, Китай), съгласно протокола на производителя, за 20 минути при 37˚ В. След двукратно промиване с JC-1 промиващ буфер (Beyotime Institute of Biotechnology), пробите бяха ресуспендирани с 300 µl JC-1 промивен буфер и анализирани чрез поточна цитометрия (BD FACSCalibur). Флуоресценцията на багрилото JC-1 в клетки Eca-109 също се наблюдава с обърнат флуоресцентен микроскоп (увеличение, x200; Nikon Eclipse Ti-E). За анализ на ROS, клетките Eca-109 бяха третирани с CTPG-W (0, 400, 600 и 800 µg/ml) за 2, 4, 6, 12 и 24 часа и оцветени с анализ на реактивни кислородни видове комплект (Beyotime Institute of Biotechnology), съгласно протокола на производителя, за 20 минути при 37˚C. След промиване три пъти с ледено студен PBS, пробите бяха събрани чрез поточна цитометрия (BD FACSCalibur) и анализирани със софтуер FlowJo 7.6.

Фигура 1. Квалифициран контрол на CTPG-W. Компонентите на CTPG-W бяха качествено и количествено анализирани чрез високоефективна течна хроматография и сравнени със стандартите на ехинакозид и актеозид. CTPG-W, водоразтворими фенилетаноидни гликозиди наC. tubulosa.

2,2-дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH) радикална активност. Активността на CTPG-W за улавяне на свободни радикали се определя с DPPH тест за свободни радикали съгласно публикувания протокол с малка модификация, тъй като метанолът се замества с етанол за разтваряне на DPPH (25, 26). За измервания в стационарно състояние 150 µl DPPH (100 mmol/l) в етанол се смесват с различни концентрации на CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 и 600 ug/ml) в 50 ul PBS и се инкубират на тъмно в продължение на 30 минути при стайна температура. Абсорбцията при 517 nm се открива в присъствието и отсъствието на CTPG-W. Като положителна контрола се използват общо 50 µl витамин С. Активността на отстраняване на DPPH радикали се изчислява по формулата: Почистване (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, където Ablank е абсорбцията на контролата (без DPPH), Asample е абсорбцията на пробата и A0 е абсорбцията на PBS с DPPH.

Western blot анализ. Клетките Eca{{0}} бяха третирани с CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) или 0,4% DMSO за 24 часа при 37˚C с 5% CO2. Следва промиване два пъти с PBS, клетки 

Фигура 2. Ефектът на CTPG-W върху растежа на Eca-109 клетки и спленоцити. (A) Eca-109 клетки бяха третирани с различни концентрации на CTPG-W за 24, 48 и 72 часа и след това клетъчната жизнеспособност беше открита с МТТ анализ. (B) Морфологичните промени на клетките Eca-109 при третиране с CTPG-W на 24-ия час. (C) Спленоцитите на C57BL/6 мишки бяха третирани с различни концентрации на CTPG-W за 24, 48 и 72 часа и след това пролиферацията беше анализирана с МТТ анализ.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

бяха лизирани в лизисен буфер за радиоимунопреципитационен анализ (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Пекин, Китай) за 20 минути върху лед. След центрофугиране при 10,000 xg за 10 минути при 4˚C, супернатантите бяха събрани и концентрациите на протеин бяха открити с комплект бицинхонинова киселина (Thermo Fisher Scientific, Inc.) съгласно протоколите на производителя. Анализът Western blot беше проведен съгласно нашето предишно описание (24). Антителата срещу каспаза-7 (кат. № D120077), каспаза-8 (кат. № D155240), каспаза-9 (кат. № D220078), В-клетъчен лимфом{ {13}} (Bcl-2)-свързан X (Bax) (кат. № D220073) и Bcl-2 (кат. № D260117) и анти-миши IgG-пероксидаза от хрян (HRP ) (кат. № D111050) и анти-заешки IgG-HRP (кат. № D110058) са закупени от BBI Life Sciences (Шанхай, Китай). Антителата срещу каспаза-3 (кат. № E-AB-10050) и активната каспаза-3 (кат. № E-AB-22115) са закупени от Elabscience ( Ухан, Китай). Други антитела срещу каспаза-7 (кат. № 9492), поли (ADP-рибоза) полимераза (PARP) (кат. № 9542), цитохром с (кат. № AC909), c-Jun NH{ {37}}терминална киназа (JNK) (кат. № 9252S) и -актин (кат. № 58169) са получени от Cell Signaling Technology, Inc. (Данвърс, Масачузетс, САЩ). Всички първични и вторични антитела бяха разредени в съотношение 1:1,000. Първичните антитела се инкубират при 4°C за една нощ, а вторичните антитела се инкубират при 37°C за 1 час.

Фигура 3. Апоптоза на Eca-109 клетки, индуцирана от CTPG-W. Клетките се третират с различни концентрации на CTPG-W в продължение на 24 часа. (A) Апоптотичните и некротичните Eca-109 клетки бяха анализирани чрез поточна цитометрия. Горният панел изобразява отделните точкови графики, а долният панел изобразява обобщените данни. * П<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

Целевите протеини бяха открити с помощта на усъвършенстван комплект за хемилуминесцентен анализ (Beyotime Institute of Biotechnology), съгласно протокола на производителя.

Статистически анализ. Статистическата значимост беше изчислена чрез еднопосочен анализ на дисперсията с post hoc теста на Tukey и резултатите бяха анализирани с помощта на софтуер GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) сред лекуваните и контролните групи. Всички данни бяха представени като средно ± стандартно отклонение. П<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

ЕКСТРАКТ ОТ CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА БЪБРЕЧНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Резултати

CTPG-W потиска растежа на Eca-109 клетки.

Компонентите на CTPG-W бяха квалифицирани и количествено определени чрез HPLC (фиг. 1), които бяха сравнени със стандартите на ехинакозид и актеозид. Според пиковите времена на задържане и пиковите площи, CTPG-W съдържа 39,16% ехинакозид и 2,44% актеозид. Първо, ефектът на CTPG-W върху жизнеспособността на клетките Eca-109 се определя с МТТ анализ. CTPG-W се разтваря в DMSO при 200 mg/ml и се разрежда с RPMI-1640 среда, съдържаща 10% топлинно инактивиран FBS до посочените концентрации. Eca-109 клетки бяха третирани с CTPG-W и клетъчната жизнеспособност беше анализирана с МТТ анализ в посочените времеви точки. Лечението с CTPG-W значително намалява жизнеспособността на клетките Eca-109 по начин, зависим от дозата и времето (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Фигура 4. Ефектът на CTPG-W върху разпределението на клетъчния цикъл в Eca-109 клетки. Различни концентрации на CTPG-W бяха използвани за третиране на Eca-109 клетки в продължение на 24 часа и разпределението на клетъчния цикъл беше анализирано чрез поточна цитометрия. * П<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

CTPG-W индуцира апоптоза в Eca-109 клетки. За да се изследва дали CTPG-W потиска растежа на Eca-109 клетки чрез индуциране на апоптоза или некроза, клетките бяха третирани с различни концентрации на CTPG-W. След 24 часа апоптозата и некрозата на клетките Eca-109 бяха открити с оцветяване с Анексин V/PI. Както е изобразено на Фиг. ЗА, Анексин V- /PI+ клетките бяха затворени като некротични клетки, а Анексин V+ /PI+ и Анексин V+ /PI- клетки бяха затворени като апоптотични клетки. CTPG-W индуцира основно апоптозата на Eca-109 клетки по дозозависим начин, въпреки че некротичните Eca-109 клетки също се увеличават значително при лечение с 600 и 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W индуцира спиране на клетъчния цикъл в S фаза в Eca-109 клетки. Нарушаването на цикъла на раковите клетки ще потисне клетъчния растеж и ще насърчи апоптозата (27). Разпределението на клетъчния цикъл в Eca-109 клетки се открива с PI оцветяване след третиране с CTPG-W в продължение на 24 часа. Беше наблюдавано, че клетките във фазата S се увеличават, а клетките във фазите G0/G1 показват общо значително намаление при лечение с CTPG-W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W намалява Δψm и индуцира освобождаването на цитохром c. Апоптозата може да бъде индуцирана от митохондриално зависим път (28, 29). Про- и антиапоптозните членове на семейството на протеини BCL-2 играят важна роля в регулирането на целостта на митохондриалната мембрана (30,31). След третиране с CTPG-W в продължение на 24 часа, Δψm се оценява с помощта на JC-1 оцветяване. JC‑1 агрегат (червена флуоресценция, открита в FL-2) ще се разпадне в мономер (зелена флуоресценция, открита в FL-1), когато Δψm намалява (32). Както е изобразено на Фиг. 5A, честотите на FL-1+ FL-2-/+ клетки се увеличават значително в зависимост от дозата, което показва, че Δψm на Eca-109 клетки намалява. Флуоресцентните промени в клетките Eca-109 също се наблюдават с обърнат флуоресцентен микроскоп (фиг. 5B). С нарастващите концентрации на CTPG-W, червената флуоресценция намалява и зелената флуоресценция се увеличава, което е в съответствие с данните от поточната цитометрия. Наблюдава се също, че нивото на цитохром с в цитозола е значително повишено (фиг. 5C), което е резултат от намаляване на Δψm. Това подсилва заключението, направено от увеличения брой FL-1+ FL-2-/+ клетки, че Δψm намалява в резултат на лечението с CTPG-W. Съобщава се, че JNK може да регулира активирането на семейството протеини BCL-2, причинявайки освобождаването на цитохром c (33-35). Установено е също, че нивото на JNK е значително повишено след лечение с CTPG-W (фиг. 5C). Резултатите показват, че CTPG-W може да индуцира апоптозата на Eca-109 клетки чрез зависим от митохондриите път.

Фигура 5. Намаляването на Δψm и повишаване на регулацията на цитохром c и JNK. Eca-109 клетки бяха третирани с различни концентрации на CTPG-W в продължение на 24 часа. (A) Δψm беше открит чрез JC-1 оцветяване и пробите бяха анализирани чрез поточна цитометрия. Отделните точкови диаграми изобразяват промените във флуоресценцията на JC-1. Честотите на клетките FL-1+ FL-2-/+ са изобразени в долния панел. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Фигура 6. Нивата на ROS в Eca-109 клетки при лечение с CTPG-W и антиоксидантната активност на CTPG-W. (A) Eca-109 клетки бяха третирани с различни концентрации на CTPG-W и нивата на ROS бяха анализирани чрез поточна цитометрия в посочени времеви точки. * П<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Ефектът на CTPG-W върху вътреклетъчното генериране на ROS.ROS може да намали Δψm, за да индуцира апоптоза (36). За да се изследва дали CTPG-W може да увеличи производството на ROS, клетките Eca-109 бяха третирани с различни концентрации на CTPG-W. Клетките се събират в посочените времеви точки и се оцветяват с DCFH-DA. Производството на вътреклетъчни ROS в Eca-109 клетки се определя чрез поточна цитометрия. Както е показано на Фиг. 6A, 800 µg/ml CTPG-W значително увеличава производството на ROS от 2-6 h и намалява от 12-24 h. Освен това, 400 µg/ml CTPG‑W значително увеличи производството на ROS от 12-24 h. Освен това, 200 µg/ml CTPG-W не променя значително производството на ROS. Динамичните промени в производството на ROS могат да бъдат свързани с апоптоза на Eca-109 клетки. Установено е също, че CTPG-W има активност за отстраняване на свободни радикали (фиг. 6B), което може да бъде свързано с намаленото производство на ROS в Eca-109 клетки, третирани с 800 µg/ml CTPG-W след 12 часа.

Фигура 7. Нивата на разцепените каспази и разцепените PARP след лечение с CTPG-W. Протеините бяха изолирани от Eca-109 клетки, третирани с CTPG-W в продължение на 24 часа и нивата на разцепени каспази и разцепени PARP бяха открити с Western blot анализ. DMSO, диметилсулфоксид; CTPG-W, водоразтворими фенилетаноидни гликозиди наC. tubulosa; PARP, поли (ADP-рибоза) полимераза.

CTPG‑W регулира активността на каспаза-3, каспаза-7, каспаза-9 и PARP. Освобождаването на цитохром c поради намаляване на Δψm може да активира каспазните протеази, за да индуцира апоптоза (29, 30, 37). След третиране с CTPG-W в продължение на 24 часа, активирането на каспаза -3, 7, 8, 9 и PARP беше открито чрез Western blot анализ. В сравнение с контролата, нивата на разцепената каспаза-9, разцепената каспаза-7, разцепената каспаза-3 и разцепената-PARP, но не и нивата на разцепената каспаза{{20 }}, бяха регулирани нагоре чрез лечение с CTPG по дозозависим начин (фиг. 7). Тези резултати показват, че CTPG-W намалява Δψm и насърчава освобождаването на цитохром с, за да активира каспази, които индуцират апоптозата на Eca-109 клетки.

Дискусия

Традиционният CHM може да индуцира апоптоза на ракови клетки на хранопровода чрез различни пътища, включително външния рецептор на смъртта и вътрешните пътища на митохондриален и ендоплазмен ретикулум (29). Предишното ни проучване показа, че CTPG, като основен компонент на C. tubulosa, инхибира растежа на меланомни B16-F10 клетки чрез индуциране на апоптоза чрез митохондриално-зависим път (24). В настоящото проучване е изследван антитуморният ефект на CTPG-W върху Eca-109 клетки и е установено, че CTPG-W потиска растежа на Eca-109 клетки, индуцира апоптоза и спиране на клетъчния цикъл, намалено Δψm, повишено освобождаване на цитохром с и активирани каспази. CTPG и CTPG-W могат да индуцират апоптоза и спиране на клетъчния цикъл в раковите клетки. Точните механизми обаче са различни поради различните компоненти на CTPG (26,64% ехинакозид, 10,19% актеозид и 1,71% изоактеозид) и CTPG-W (39,16% ехинакозид и 2,44% актеозид). CTPG арестува B16-F10 клетки във фазите G0/G1, но CTPG-W арестува Eca-109 клетки във S фаза (24). Производството на ROS се увеличава дозозависимо от CTPG, но показва промяна в зависимост от времето чрез висока доза CTPG-W, която се увеличава значително в началото на лечението с CTPG-W (2-6 h) и намалява значително след 12 часа в сравнение с контролата. Възможна причина е, че основният компонент на CTPG-W е ехинакозид. Няколко проучвания съобщават, че ехинакозидът може да инхибира производството на ROS и индуцираната от ROS апоптоза, за да упражни своите невропротективни и против стареене ефекти (38-40). По подобен начин, в настоящото изследване е наблюдавана активността на улавяне на свободните радикали. Поради това се спекулира, че някои компоненти, включително вербаскозид, изо-вербаскозид и салидрозид във висока доза CTPG-W могат незабавно да индуцират генериране на ROS, за да причинят апоптоза на Eca-109 клетки (41,42), и след това ROS беше почистен от echiнакозид. Друга възможна причина за разликите в производството на ROS от CTPG и CTPG-W е, че в това проучване и предишното проучване са използвани различни клетъчни линии (24). Dong et al (43) съобщават, че ехинакозидът може да индуцира апоптозата на човешки SW480 колоректални ракови клетки чрез генериране на окислително увреждане на ДНК без повишени нива на ROS.

Лечението с CTPG-W намалява Δψm и причинява освобождаването на цитохром c, което насърчава разцепването на каспаза -9 (28). Последователно, нивата на разцепена каспаза-9 бяха регулирани нагоре чрез лечение с CTPG-W. Впоследствие активната каспаза-9 може да активира каспаза-3, за да индуцира апоптоза (44). Нивата на разцепената каспаза-3 също бяха регулирани нагоре чрез лечение с CTPG-W. Каспаза -8 обаче не се активира от CTPG-W, което показва, че външният път на рецептора на смъртта не е включен в апоптозата, индуцирана от CTPG-W. Тези наблюдения показват, че CTPG-W индуцира апоптоза на Eca-109 клетки чрез активиране на митохондриално-зависим път.

PARP играе важна роля в геномната стабилност и може да бъде разцепен от активните каспази, особено каспаза -3 и -7 (45). Беше установено, че лечението с CTPG-W активира каспаза-3 и -7, които могат да разцепят PARP, за да инхибират възстановяването на ДНК и да причинят апоптоза.

CTPG-W също така в зависимост от дозата и времето потиска растежа на човешки хепатоцелуларен карцином BEL-7404 клетки (непубликувани данни). Въпреки че CTPG-W инхибира растежа на Eca-109 и BEL-7404 клетки, той насърчава пролиферацията на спленоцити, което може да се дължи на съдържанието на полизахариди (~50%) в CTPG-W (46 ). По подобен начин няколко проучвания съобщават, че полизахаридите могат да стимулират пролиферацията на спленоцити (46-49). В модела на мишка беше установено, че CTPG-W значително повишава индекса на далака в сравнение с контролната група, но не повлиява телесното тегло и индексите на другите органи, включително сърце, черен дроб, бъбреци и бял дроб (непубликувани данни), което показва, че CTPG-W няма цитотоксичен ефект върху нормалните клетки.

Взети заедно, данните показват, че CTPG-W инхибира растежа на Eca-109 клетки чрез индуциране на апоптоза чрез митохондриално зависим път

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%