Фитохимичен скрининг и естрогенна активност на общите гликозиди на Cistanche Deserticola

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Резюме

През десетилетията са полагани непрекъснати усилия за подобряване на качеството на човешкия живот. Постменопаузалният синдром е сериозна загриженост за благосъстоянието на здравето на жените. Понастоящем хормоналната терапия е основното средство за лечение на това състояние. Въпреки това, тази терапия може да доведе до злоупотреба с естроген, водеща до нежелани реакции и странични ефекти. В резултат на това хормоналната терапия е неуспешна за облекчаване на постменопаузалния синдром.Cistanche deserticolaе класическа тонизираща билка в традиционната китайска медицина. Проявява значителна естрогенна активност. Основните активни съединения на тази билка са гликозидите. В предишен експеримент бяха идентифицирани три важни фактора, допринасящи за общия добив на гликозид, добив на актеозид и естрогенна активност, а именно концентрация на елуента, рН и обем на елуента. В този експеримент беше определен оптимален процес на пречистване, като се използва централна композитна повърхностна методология за получаване на гликозиди от тази билка. Установено е, че концентрация на елуент (етанол) от 85 процента и обем от 25 BV при рН 11 са оптимални. Двадесет и едно активни съединения бяха идентифицирани чрез високоефективна течна хроматография/квадруполен времепролетен масспектрометричен анализ. Това проучване предоставя ценна информация за по-нататъшни задълбочени изследвания, оценяващи естрогенната активност на общите гликозиди наCistanche deserticola.

Ключови думи: централен композитен дизайн; Общи гликозиди на Cistanche deserticola; LC/Q-TOF-MS; технология за пречистване; тест за растеж на матката.

Въведение

Cistanche deserticolaе ядивна, класическа тонизираща билка. За първи път се споменава в билковата класика на Шен Нонг и е включена в най-висок клас. Това е топла и сладка билка. Има многобройни лечебни свойства, като подхранване на черния дроб и бъбреците, укрепване на мускулите и костите и подобряване на имунната регулация, заедно с действия против стареене и противотуморни действия [1-4]. Някои естествени съединения са изолирани и идентифицирани от екстрактите на тази билка, основните от които са фенилетаноидни гликозиди, лигнаноиди, иридоиди, полизахариди и алкалоиди [5-8].

Лекарствата, получени от лечебни растения, съдържат различни активни съединения, които са отговорни основно за тяхното терапевтично действие. Ефикасността на едно и също лекарство, получено от различни растителни източници, може да варира поради разликите във вида и количеството на присъстващите в него активни съединения. Поради това е важно да се идентифицират и количествено определят всички активни съединения, присъстващи в лекарствата, получени от лечебни растения. Същото се отнася и за C. deserticola. Методологията на повърхността на реакция е експериментален метод за изследване на взаимодействието между различни фактори едновременно [9-10]. Може да се използва за оптимизиране на параметрите на екстракция за фитофармацевтични продукти и количествена оценка на активните съединения в лекарства. Централният композитен дизайн (CCD) е един от експерименталните дизайни, полезни в методологията на отговорната повърхност. В сравнение с ортогоналните и унифицирани дизайни, CCD има по-висока точност и по-добра предвидимост [11].

Постменопаузалният синдром може значително да намали качеството на живот на жените. Обикновено естрогенът се използва за лечение на това състояние. Въпреки това, дългосрочната употреба на естроген може да доведе до злоупотреба, като по този начин причинява различни нежелани реакции и странични ефекти. Ето защо е наложително да се избере алтернативна терапия, за предпочитане билково лекарство, съдържащо естроген като активна съставка за лечение на постменопаузален синдром [12-13].

В предварителен експеримент структурите на различни природни съединения, получени от C. deserticola, бяха идентифицирани с помощта на масспектрометрия (MS) [14]. Беше потвърдено, че гликозидите са основните активни съединения със значителна естрогенна активност [14-15]. За да се разработи безопасна и ефективна естрогенна активна съставка в ново лекарство, е необходимо задълбочено изследване на TGCD след пречистване. В това изследване CCD е използван за първи път за оптимизиране на пречистването на общите гликозиди на C. deserticola (TGCD). Впоследствие тестът за растеж на матката беше използван за оценка на естрогенната активност на същия гликозид. Високоефективна течна хроматография/квадруполна времепролетна масспектрометрия (HPLC/Q-TOF-MS) се използва за качествен анализ на съединенията на TGCD след пречистване. Този процес беше приложен, за да се демонстрира изрично присъствието на различни активни съединения с естрогенна активност в TGCD. Това може едновременно да осигури основата за клиничната му употреба при постменопаузален синдром, заместващ естрогена.

Експериментална процедура

инструменти

Agilent 1290 HPLC система (Agilent Technologies, Пало Алто, Калифорния, САЩ), Agilent 6530 серия квадруполна времепролетна LC/MS (Q-TOF) система (Agilent Technologies, Пало Алто, Калифорния, САЩ) и химическа HPLC{ {5}}D работните станции бяха използвани като хроматографски инструменти за обработка на данни. За цялото изследване е използвана свръхчиста вода Milli-Q. Електронна аналитична везна AR1140 (Ohaus International Ltd.); 680 четец на микроплаки (Bio-Rad Corporation); и 64R високоскоростна центрофуга (Beckman Coulter Allegra) бяха използвани за подготовка на пробата.

Лекарства и химикали

C. deserticola е закупен от пазара на наркотици и идентифициран от проф. Джан Делян (Харбински университет по търговия, Китай). Стандартен диетилстилбестрол (99 процента чистота, партида номер 60518) е закупен от д-р Ehrenstorfer (Германия). Други стандартни актеозид (111530-200505) и ехинакозид (111670-200503) са получени от Националния институт за контрол на фармацевтични и биологични продукти, Пекин, Китай. Чистотата на всеки стандарт беше > 98 процента. Ацетонитрил (ACN), метанол и мравчена киселина (клас MS) бяха закупени от Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL, USA). Свръхчистата вода е получена от Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd. (Ханджоу, Китай). Всички налични в търговската мрежа реагенти са с аналитичен клас.

Приготвяне на общи гликозиди от разтвор за пречистване на C. deserticola

След потапяне в 75 процента етанол за 12 часа, суровият прах от C. deserticola (100 g) се екстрахира с 800 mL 75 процента (v/v) етанол при 80 градуса за 150 минути под обратен хладник. След това се филтрира през двуетажен филтър и впоследствие се екстрахира с 800 mL 75 процента етанол два пъти за допълнителни 150 минути. След това филтратите се комбинират и се концентрират във вакуум при 45 градуса. Екстрактът се получава чрез отстраняване на разтворителя. Определено количество дестилирана вода се добавя към екстракта, за да се получи концентрация от 0,5 g/mL, която се използва за скрининг на процеса на пречистване.

За адсорбция с помощта на AB-8 макропореста смола, рН на разтвора на тестовата проба се коригира до 11. Първо се използва 2 BV дестилирана вода за отмиване на примесите. След това, елуентът при концентрация от 25 BV 85 процента етанол се елуира и събира. Накрая, събраният пречистен елуент се смесва. Определено количество дестилирана вода се добавя към екстракта, за да се получи концентрация от 1,5 g/mL, която се използва за интрагастрално приложение. За положителна контрола се приготвя разтвор на диетилстилбестрол (20 ug/mL) с диетилстилбестрол на прах.

Съгласно съотношението на пречистване ({{0}}.6), определено количество от екстракта (еквивалентен на 1 g C. deserticola) се прехвърля в 10 mL мерителна колба, разтворен в 50 процента (v/v) разтвор на метанол в ултразвукова баня за 5 минути и разреден до 10 mL. Лекарственият разтвор се получава след филтруване на супернатанта през 0,45 μm филтърна мембрана. Актеозид и ехинакозид (1 mg всеки) се смесват и се разтварят напълно в 10 mL 50 процента (v/v) разтвор на метанол. Накрая, стандартният разтвор се филтрира през 0, 45 μm Millipore филтър преди анализа.

LC-MS условия

Хроматографското разделяне се извършва в HPLC система (Agilent 129{{10}}), оборудвана с кватернерна система за доставяне на разтворител, вакуумен дегазатор и фотодиоден детектор. MS/MS анализът беше извършен в апарат Agilent-1290 HPLC/6530 Q-TOF-MS система, оборудвана с източник на йонизация с електроспрей в режим на положителни и отрицателни йони. Колона Waters Symmetry shield RP C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) (Waters Corporation, Milford, MA, USA) беше използвана за разделяне. Подвижната фаза съдържа 0,2 процента воден разтвор на мравчена киселина (v/v) (A) и ACN (B) и се изпомпва при скорост на потока от 0,5 mL/min. Инжекционният обем на всяка проба беше 10 μL. Програмата за градиентно елуиране беше следната: 5-23 процента B за 0-35 минути, 23-25 ​​процента B за 35-65 минути и 25-5 процента B за 65-70 минути. Температурата на колоната се поддържа при 30 градуса. Хроматограмите се наблюдават и записват при 330 nm. Налягането на атомизиращия газ беше настроено на 30 Psi, а капилярното напрежение беше 3,5 kV. Дебитът на сух газ е 8 L/min при температура 30 градуса. Температурата на обвивния газ беше зададена на 400 градуса при скорост на потока от 12 L/min. Енергията на сблъсъка беше зададена на 10–20 eV за нискоенергийни сканирания и 30–50 eV за високоенергийни сканирания. Данните за масспектъра бяха записани в диапазона на сканиране от 50–1000 Da в режими на сканиране с положителни и отрицателни йони. В това проучване беше извършено бързо и ефикасно сравнение между TGCD и стандартите при същото LC-MS условие.

Тест за растеж на матката

Това беше извършено в строго съответствие с препоръките на Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни на Националните здравни институти. Всички експериментални процедури бяха прегледани и одобрени от Комитета по етика на животните към Харбинския търговски университет, Китай.

Незрели женски мишки Кунминг (около 21 дни от раждането, отбити) с тегло 12 ± 2 g, бяха закупени от Центъра за лабораторни животни на базата на националната биологична индустрия на Чанчун (Чанчун, Китай). Мишките бяха настанени в стая с регулирана температура (22 ± 2 градуса) с храна и вода ad libitum. Експериментите с животни бяха започнати след пет дни аклиматизация. Мишките гладуват една нощ с вода ad libitum преди интрагастрално приложение на тестовия разтвор.

Мишките бяха разделени на случаен принцип в 22 групи, с 10 животни във всяка група. На тях са прилагани експериментални лекарства от същия обем два пъти на ден (сутрин и вечер) в продължение на четири дни, както следва:

Група 1: Интрагастрални общи гликозиди на разтвор за пречистване на C. deserticola (20 mL/kg), (обем на разтвора/тегло на мишка),

Група II: Интрагастрална дестилирана вода (отрицателна контролна група) и

Група III: Интрагастрален диетилстилбестрол (20 ug/mL) (положителна контролна група).

На петия ден всички мишки бяха умъртвени. Матките бяха незабавно отстранени и претеглени и коефициентите на матката бяха изчислени.

Статистически анализ

Двустранен t-тест на двойка извадка беше използван за идентифициране на статистически значими разлики в различните параметри в различните експериментални групи. Анализът беше извършен с помощта на статистически софтуер SPSS (SPSS за Windows v21.0, SPSS Inc., САЩ). Разликите се считат за статистически значими при ниво на достоверност от 95 процента (p <>

Резултати и дискусия

Линейност и корелация на добивите на актеозид и общи гликозиди

Уравнението на линейната регресия на добива на актеозид е y {{0}}x – 14,75 (където x е концентрацията на актеозид, а y е съответната му площ на пика) с коефициент на корелация r=1 в диапазона на концентрация 0.12−{{10}}.72 mg/mL. Това показва линейна крива на калибриране. Уравнението на линейната регресия на общия добив на гликозиди беше y=26.074x плюс 0,0866 (където x е концентрацията на общите гликозиди, а y е съответната площ на пика) с коефициент на корелация r { {12}}.9982 в диапазона на концентрация 0,013−0,065 mg/mL. Това също показва линейна крива на калибриране.

Методологично изследване

Прецизността, възпроизводимостта, стабилността и възстановяването на пробите бяха изследвани в методологичното изследване. В експеримента за прецизност относителното стандартно отклонение (RSD) на актеозида и общите гликозиди е съответно 1,43 процента и 0.05 процента. В експеримента за възпроизводимост, RSD на актеозид и общите гликозиди е 0.10 процента и съответно 1,44 процента. В 24-часовия експеримент за стабилност, RSD на актеозид и общите гликозиди е съответно 0,14 процента и 0,90 процента. В експеримента за възстановяване възстановяването на актеозид е 100,50 процента с RSD от 2,08 процента, докато възстановяването на общите гликозиди е 99,12 процента с RSD от 1,65 процента. Всички стойности на RSD бяха под 3 процента. Тези резултати демонстрират добра прецизност и възпроизводимост. В допълнение, пробата е стабилна за 24 часа. Резултатите от възстановяването също са в допустимите граници (95-105 процента). Следователно този метод може да се използва за определяне на добива на актеозид и общия гликозид след пречистване.

Еднофакторно изследване на TGCD

Пречистването на TGCD с помощта на макропореста смола може да бъде повлияно от много фактори, като тип на смолата, фактори на статична адсорбция (време на адсорбция, концентрация на изтичане и pH на разтвора на пробата) и условия на елуиране (скорост на потока, обем и концентрация). Използвайки адсорбционния капацитет и скоростите на десорбция и елуиране на TGCD като индекси, експерименталното състояние се определя въз основа на резултатите от еднофакторни експерименти. Използвайки макропореста адсорбционна смола тип AB-8, бяха определени следните оптимални условия: 0.5 mg/mL разтвор на пробата, рН 10, време на статична адсорбция 8 часа, 2 BV дестилирана вода за промиване на примеси, 20 BV 80 процента етанол като елуент и скорост на потока от 0,5 BV/min. Конкретните резултати са показани на фигури 1-7.

CCD за оптимизиране на технологията за пречистване на TGCD

Въз основа на резултатите от еднофакторното изследване, три фактора, които значително влияят върху метода на пречистване, бяха избрани като индекси, а именно рН на разтвора на пробата (x1), концентрация на елуента (x2) и обем на елуента (x3). Според принципа на CCD всеки фактор има пет нива. Максималните и минималните нива на тези различни фактори бяха определени според резултатите от предварителния експеримент. Нивата на факторите са показани в таблица 1, а експерименталните резултати са показани в таблица 2.

Общите добиви на гликозиди и актеозиди бяха определени за оптимизиране на метода за пречистване за TGCD. Първо, общите добиви на гликозиди и актеозиди бяха зададени на числените критерии за желателност (d) между {{0}}-1. След това се изчислява общата желателност (OD) [OD=(d1, d2, d3,...,dn)1/n, където n е числото на индекса]. SPSS21.{{10}} софтуер и дизайн-експертен софтуер бяха използвани за множествена линейна регресия и биномно напасване на независими променливи и OD, с p < 0.05="" беше="" взето="" под="" внимание="" статистически="" значим="" стандарт="" на="" уравнението.="" уравнението="" с="" по-голяма="" r-стойност="" (коефициент="" на="" множествена="" корелация)="" беше="" избрано="" като="" най-подходящ="" модел.="" многовариантното="" линейно="" уравнение="" е="" представено="" като="" y="–" 1.02="" –="" 0.131x1="" плюс="" 0.034x2="" плюс="" 0,012x3="" (r="" {{="" 25}}.55,="" p="0.004)." биномното="" уравнение="" е="" y="–" 21.92173="" –="" 0.74079x1="" плюс="" 0.62914x2="" плюс="" 0.041161x3="" плюс="" 0.014972x1x2="" плюс="" 2.06050*10-4x1x3="" плюс="" 1.05698="" ×="" 10-3x2x3="" -="" 0.029589x="" {56}}.78730="" ×="" 10-3x22="" -="" 2.89446="" ×="" 10-3x32="" (r="0.91," p="0.012)." от="" горните="" уравнения="" може="" да="" се="" види,="" че="" корелационният="" коефициент="" на="" уравнението="" на="" многомерната="" линейна="" регресия="" е="" по-нисък.="" корелацията="" между="" независимите="" и="" зависимите="" променливи="" е="" много="" ниска="" и="" се="" счита="" за="" неблагоприятно="" да="" се="" използва="" в="" линейния="">

Но коефициентът на корелация на биномното уравнение беше висок и това доведе до добро напасване. Следователно беше избран биномиалният модел. Въз основа на цялостен анализ на фигурата на повърхността и картата на контура, комбинирани с експерименталните данни (стойност на OD близо до {{0}}.6), беше получен оптималният диапазон на метода за пречистване. От Фигура 8 може да се види, че максималната OD стойност се генерира, когато pH на разтвора на пробата (A) е в диапазона 9-10, а концентрацията на елуента (B) е в диапазона 79-85 процента . Фигура 9 показва, че максималната OD стойност е получена, когато стойността на pH на разтвора на пробата (A) е в диапазона 9-10, а обемът на елуента (C) е в диапазона 20-25 BV. Фигура 10 показва, че максималната OD стойност е получена, когато концентрацията на елуента (B) е в диапазона от 80-85 процента, а обемът на елуента (C) е в диапазона от 20-25 BV. От цялостен анализ на тези данни, рН на разтвора на пробата, концентрацията на елуента и обема на елуента бяха определени съответно в диапазона 9-10, 80-85 процента и 20-25 BV. Въз основа на многовариантното биномиално уравнение за променливи производни резултати и оптимална схема, беше установено, че най-добрият метод за пречистване на TGCD е при концентрация на елуента (етанол) от 85 процента и обем от 25 BV при pH 11. Съответната стойност на OD е 0,8332 и общият добив на гликозиди е 73,0339 процента. Визуалното впечатление от фигурите 8-10 идентифицира най-добрия метод като този, при който са взети предвид взаимодействията между двата фактора, въпреки че най-добрият метод, изведен от формулата, признава този, в който са включени взаимодействия между трите фактора. Двата резултата се различават и се счита, че оптималният метод за пречистване е с концентрация на елуента (етанол) от 85 процента и обем от 25 BV при рН 11.

Измерване на растежа на матката

Коефициентът на матката на всяка група е показан в Таблица 3. В сравнение с отрицателната контролна група, резултатите на другите групи са значително различни. Установено е, че TGCD, получен от 20 различни метода за пречистване, всички оказват естрогенно действие.

Потвърждаващ експеримент

Изчерпателните резултати от CCD и теста за растеж на матката показаха, че се счита, че оптималният метод за пречистване е с концентрация на елуента (етанол) от 85 процента и обем от 25 BV при pH 11. По време на

процес на валидиране, средният добив на общите гликозиди е 70,9150 процента. Средното отклонение между прогнозираните и действителните стойности е 2,1180 процента. Следователно може да се предположи, че предсказуемостта и експерименталната достоверност на този модел са добри.

Идентифициране на TGCD след пречистване

Въз основа на времето на задържане и данните от MS бяха спекулирани 21 естествени съставки, включително кампнеозид 1, 2'-ацетилактеозид, цистанозид А, цистанозид В, сирингалид А, 3'- - L-рамнопиранозид, тубулозид А, тубулозид В, салидрозид, цистанозид G, тенипозидна киселина, декафеоилактеозид, 8-епилоганова киселина, ехинакозид, цистанозид F, цистантубулозид В1, изоактеозид, актеозид, цис-актеозид, канканозид Е, османтузид В и цистанозид С. Времето на задържане, MS и MS/ MS информация, формула и спекулирани съединения са показани в таблица 4.

Q-TOF-MS е особено подходящ за структурна идентификация на сложни молекулни компоненти на лекарства и храни, тъй като може да предостави възможни елементарни състави чрез точната молекулна маса и структурните характеристики на фрагментните йони. За установяване на систематична структурна характеристика, Q-TOF-MS, MS данни, търсене на база данни и публикувана референтна литература също бяха използвани за идентификация. Молекулната формула на всеки целеви компонент беше изведена от основния йон и беше съпоставена с известните съединения. Тази формула може да бъде допълнително определена от нейните свързани фрагментни йони. Например, пик 5 показва преобладаващ депротониран йон при m/z 654 (C30H38O16), който е идентичен с елементарния състав на кампнеозид 1. Загубата на кафеоил се образува от фрагментен йон при m/z 493 и загубата на rha частта се образува от фрагментен йон при m/z 347.

Заключение

С помощта на LC-Q-TOF-MS технология е разработен и напълно валидиран прост и стабилен метод за качествен анализ на TGCD. Данните за валидиране за скрининг и идентифициране на природни съединения от TGCD бяха задоволителни. Двадесет и едно биоактивни съединения от TGCD бяха спекулирани, както следва: салидрозид, цистанозид G, генипозидова киселина, декафеоилактеозид, кампнеозид 1, 8-епилоганова киселина, 2'-ацетилактеозид, цистанозид А, цистанозид В, сирингалид А3′{{9 }}L-рамнопиранозид, ехинакозид, цистанозид F, цистантубулозид В1, изоактеозид, актеозид, тубулозид А, цис-актеозид, канканозид Е, османтузид В, цистанозид С и тубулозид В. Структурната характеристика на тези съединения може да осигури експериментална основа за техния качествен контрол и по-нататъшно клинично приложение поради тяхната естрогенна активност. Това може да предложи нова и подобрена терапевтична възможност за лечение на постменопаузален синдром, като по този начин се избягват страничните ефекти и нежеланите реакции на естрогенната терапия.

Съкращения

TGCDCistanche deserticolaобщи гликозиди LC/Q-TOF-MS течна хроматография/квадруполна времепролетна мас спектрометрия

RSM методология на отговорната повърхност

CCD централен композитен дизайн

MS масспектрометрия HPLC/Q-TOF-MS Високоефективна течна хроматография/квадруполна времепролетна масспектрометрия

ACN ацетонитрил

BV обем на леглото

OD обща желателност

LC-MS течна хроматография-масспектрометрия

Q-TOF-MS квадруполна времепролетна масспектрометрия

TCM традиционни китайски лекарства

RSD относително стандартно отклонение

Благодарности

Този проект беше подкрепен от Националната природонаучна фондация на Китай (№ 81073015), Природонаучната фондация на провинция Хейлундзян (ZD2017014), план за обучение на млади иновативни таланти на колежа в провинция Хейлундзян (UNPYSCT- 2017209). Авторите декларират, че няма конфликт на интереси по отношение на публикуването на тази статия.

Конфликт на интереси

Авторите заявяват, че няма конфликт на интереси.

Препратки

[1] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Фенилетаноидни гликозиди с противовъзпалителни действия от стъблата на Cistanche deserticola, култивирани в пустинята Тарим, Fitoterapia, 2013, 89, {{4} }.

[2] Guo Y., Cao L., Zhao Q., Zhang L., Chen J., Liu B., Zhao B., Предварителни характеристики, антиоксидантната и хепатопротективната активност на полизахарида от Cistanche deserticola, International Journal of Biological Macromolecules , 2016, 293, 678-685.

[3] Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y., Tu PF, Противовъзпалителни иридоиди от стъблата на Cistanche deserticola, култивирани в пустинята Тарим, Китайски журнал за естествени лекарства, 2016, 14, 61-65.

[4] Peng F., Chen J., Wang X., Xu C., Liu T., Xu R., Промени в нивата на фенилетаноидни гликозиди, антиоксидантна активност и други качествени характеристики в резени на Cistanche deserticola чрез обработка с пара, химически и Pharmaceutical Bulletin (Токио), 2016, 64, 1024-1030.

[5] Wang T., Zhang X., Xie W., Cistanche deserticola YC Ma, „Пустинен женшен“: рецензия, The American Journal of Chinese Medicine, 2012, 40, 1123-1141.

[6] Song Y., Song Q., Li J., Zhang N., Zhao Y., Liu X., Jiang Y., Tu P., Интегрирана стратегия за количествено разграничаване на лайка междуCistanche deserticolaи C. tubulosa с помощта на високоефективна течна хроматография-хибридна тройна квадруполна линейна йонна мас спектрометрия, Journal of Chromatography A, 2016, 1429, 238-247.

[7] Li Y., Peng Y., Wang M., Zhou G., Zhang Y., Li X., Бърз скрининг и идентифициране на разликите между метаболитите наCistanche deserticolaи C. tubulosa воден екстракт при плъхове чрез UPLC-Q-TOF-MS комбиниран анализ на разпознаване на образи, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2016, 131, 364-372.

[8] Li WL, Sun XM, Song H., Ding JX, Bai J., Chen Q., HPLC/Q-TOF-MS-базирана идентификация на абсорбирани съставки и техните метаболити в серум и урина на плъх след перорално приложение на Cistanche екстракт от deserticola, Journal of Food Science, 2015, 80, H2079-2087.

[9] Almasi A., Dargahi A., Mohamadi M., Biglari H., Amirian F., Raei M., Отстраняване на пеницилин G чрез комбинация от сонолиза и фотокаталитичен (соно-фотокаталитичен) процес от воден разтвор: оптимизация на процеса използване на RSM (методология на повърхността на реакцията), Electron Physician, 2016, 8,

[10] 2878-2887. Hou W., Zhang W., Chen G., Luo Y., Оптимизиране на условията за екстракция за максимална фенолна, флавоноидна и антиоксидантна активност от листа с данни от Melaleuca bract, използвайки методологията на повърхността на реакцията, PloS One, 2016, 11,

[11] e0162139. Pooralhossini J., Ghaedi M., Zanjanchi MA, Asfaram A., Изборът на ултразвукова екстракция, съчетана със спектрофотометрия за бързо определяне на галова киселина във водни проби: централен композитен дизайн за оптимизиране на променливи на процеса, Ultrasonics Sonochemistry, 2017, 34 , 692- 699.

[12] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Структурна характеристика и идентификация на фенилетаноидни гликозиди отCistanches deserticola YC Maот UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Фитохимичен анализ, 2012, 23, 668-676.

[13] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Количествен анализ на Cistanches Herba с помощта на високоефективна течна хроматография, съчетана с откриване на диодна матрица и високо- разделителна масова спектрометрия, комбинирана с хемометрични методи. Journal of Separation Science, 2013, 36, 1945-1952.

[14] Li WL, Chen Q., Yang B., Gao S., Zhang JJ, Скрининг на фито-естрогенни ефективни екстракти и доза отCistanche deserticola, Китайски билкови лекарства, 2013, 5, 292-296.

[15] Li YP, Huang FR, Dong J., Xiao C., Xian RY, Ma ZG, Zhao J., Rapid Identification of Cistanche via Fluorescence Spectrum Imaging Technology Combined with Principal Components Analysis and Fisher Distinction, Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi, 2015, 35, 689-694.