Пиноцембрин облекчава постинфарктната сърдечна недостатъчност чрез активиране на Nrf2/HO-1 сигнален път, част 1

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме

Заден план:Оксидативният стрес е важен фактор, участващ в развитието на сърдечната недостатъчност. Настоящото проучване е проведено, за да се изследва дали pinocembrin е в състояние да подобри слединфарктната сърдечна недостатъчност (PIHF) и основните механизми.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Методи:Плъхове бяха подложени на лигиране на лява предна низходяща артерия, за да се предизвика миокарден инфаркт и впоследствие отгледани в продължение на 6 седмици, за да се получи хронична сърдечна недостатъчност. След това пиноцембрин се прилага през ден в продължение на 2 седмици. Ефектите бяха оценени чрез ехокардиография, Western blot, оцветяване на Masson, биохимични изследвания, имунохистохимия и флуоресценция. In vitro, ние също култивирахме H9c2 кардиомиоцити и сърдечни миофибробласти, за да свидетелстваме допълнително за механизмите.

Резултати:Установихме, че предизвиканите от PIHF влошавания на сърдечните функции са значително подобрени чрез прилагане на пиноцембрин. В допълнение, лечението с пиноцембрин също отслабва отлагането на колаген и увеличава рецептора на васкуларен ендотелен растежен фактор 2 в граничната зона на инфаркта заедно с отслабена апоптоза, което е свързано с подобряване на оксидативния стрес, доказано чрез намаляване на реактивните кислородни видове (ROS) в сърдечната тъкан и малондиалдехид (MDA) в серума и повишаване на супероксид дисмутаза (SOD). Това беше придружено от регулиране нагоре на пътя на ядрения фактор еритроид 2-свързан фактор 2 (Nrf2)/хем оксигеназа-1(HO-1). In vitro експерименти открихме, че специфичният инхибитор на Nrf2 значително обръща ефектите, произтичащи от пиноцембрин, включително антиоксидант, антиапоптоза, антифиброза и неоваскуларизация, което допълнително показва, че подобряването на PIHF от пиноцембрин е в Nrf2/HO-1 зависим от пътя начин.

Cistanche може да подобри имунитета

Заключение:Pinocembrin подобрява сърдечните функции и ремоделирането в резултат на PIHF чрез почистване на ROS и активиране на пътя на Nrf2/HO-1, което допълнително намалява отлагането на колагенови влакна и апоптозата и улеснява ангиогенезата.

Ключови думи:Пиноцембрин, сърдечна недостатъчност, оксидативен стрес, Nrf2/HO-1

Въведение

Сърдечната недостатъчност (HF), характеризираща се с набор от терминални клинични синдроми в резултат на структурни и/или функционални увреждания на сърцето, остава глобално бреме за здравето, като миокардният инфаркт (MI) е водеща причина (Ziaeian and Fonarow 2016; Galli and Lombardi 2016; Rengo et al.2013). Въпреки големия напредък, постигнат в терапиите и качеството на грижите при HF, има приблизително разпространение от 37,7 милиона души всяка година по целия свят, заедно с 50 процента смъртност 5 години след диагностицирането на HF (Go et al .2014). Настоящата дилема може да се отдаде отчасти на това, че пост-инфарктната HF (PIHF) се състои от голямо разнообразие от патофизиологични механизми, към които настоящите терапевтични методи не могат да се отнасят напълно.

Натрупващите се проучвания показват, че оксидативният стрес (OS) участва предимно в патологичната прогресия на PIHF (Dubois-Deruy et al. 2020; Ma et al. 2019; Bubb et al. 2017; Habtemariam 2019). OS, представен главно от прекомерното натрупване на свободни радикали/реактивни кислородни видове (ROS), съдържащи хидроксилен радикал, супероксид, азотен оксид и др. (Dubois-Deruy et al. 2020; Habtemariam 2019), е доказано, че може да предизвика окислителна модификация или увреждане на липидите , протеини и ДНК, с нарушения на органелите, възпаление, апоптоза в миоцитите и настъпваща интерстициална фиброза (Dubois-Deruy et al. 2020; Bubb et al. 2017; Hermida et al. 2018). По силата на многобройните вредни ефекти на ROS, антиоксидантите са взети под внимание в терапиите с PIHF, чиито механизми се състоят от директно извличане на ROS и/или стимулиране на антиоксидантна защита, съдържаща глутатион, супероксид дисмутаза (SOD), каталаза и др.( Habtemar-iam 2019). Въпреки това, беше жалко, че прилагането на някои антиоксиданти, нито витамин Е (Lee et al. 2005), нито ресвератрол (Made et al. 2015; Olesen et al. 2014), не успя да отговори на удовлетворението при лечението на сърдечно-съдови заболявания, доказано от неуспех в подобряването на сърдечните функции. Поради това са необходими по-ефективни антиоксиданти при PIHF терапията.

Пиноцембрин (Pino) ​​(химическата структура е показана на фиг.1A) е естествено флавоноидно съединение, което може да се извлече от мед, прополис и няколко други растения (Lan et al.2015; Rasul et al.2013) в допълнение към изкуствен синтез (Costa and Leitao 2011), упражняващ противовъзпалителни, антибактериални, анти- и противоракови ефекти (Rasul et al.2013; Ye et al.2019), заедно с подчертания антиоксидантен ефект (Kim et al.2020; Sangweni et al. .2020). Както беше показано по-рано, фенолната структура на Pino, отговорна за директното елиминиране на ROS, както и фенолните и нефенолните структури, които засилват антиоксидантната защита (Habtemariam 2019), отчитат антиоксидантния ефект на Pino, чрез който Pino е изследван и приложен в широк разнообразие от заболявания, като невродегенеративни заболявания, атеросклероза, индуцирана от доксорубицин кардиомиоцитна токсичност (Sangweni et al. 2020; Sang et al. 2012; Liu et al. 2014). Въпреки това, като се има предвид, че няколко антиоксиданта за миокарден инфаркт и HF са невалидни или недостатъчни за превръщане в клинична употреба, дали антиоксидантният ефект на Pino може да бъде изпълнен при терапията на PIHF остава слабо разбран. По този начин това изследване беше проведено, за да се проучи дали прилагането на Pino може да окаже благотворно въздействие върху PIHE, което обещава да бъде ново, или ако не доминиращо, то поне спомагателно лечение.

Методи и материали

Животински модел и протокол от експеримента

56 мъжки плъха Sprague-Dawley, закупени от центъра за експерименти с животни на китайския университет Three Gorges,

са отгледани в администрацията за животни в болница №3 в Ухан. Всички експерименти бяха официално разрешени и извършени в ключовата кардиологична лаборатория на Хубей, в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни, публикувано от Националните здравни институти на САЩ (NIH публикация №.82-23, преработена през 1996 г.).

Плъховете първоначално получават лигиране на лява предна низходяща коронарна артерия (LAD) или фиктивна операция. Накратко, плъховете бяха анестезирани с 3 процента пентобарбитал (2 mL/kg; Sigma-Aldridge, Сейнт Луис, САЩ, интраперитонеално), последвано от трахеална интубация и респираторна подкрепа (дихателен обем: 5-10 mL, скорост: 70 пъти/минута). Извършена е последваща експозиция на сърцето и LAD е лигиран с 7-0 монофиламентни найлонови конци. Появата на бледност на apexcordis или елевация на ST-сегмента в I отвеждане на електрокардиограмата показва индукция на МИ. Фиктивната операция претърпя идентични процедури с изключение на LAD лигирането. Пеницилин (200,000 IU) се инжектира интрамускулно веднъж дневно в продължение на една седмица след операцията.

Afterward, the rats were carefully raised for 6 weeks to produce PIHF. Rats were then randomly split into 4 groups:(i) sham+saline (sham group);(i)sham+Pino group;(ii)LAD ligation+saline(HF group);(iv)LAD ligation+Pino(HF+Pino group). Pinocembrin(5 mg/kg, purity>98 процента; Sigma-Aldridge) или същият обем физиологичен разтвор се инжектира интравенозно през опашната вена през ден в продължение на 2 седмици. Дозировката се отнася до предишно проучване (Lan et al.2017). Протоколът е илюстриран на фиг.1В.

Контролните положителни контролни плъхове съдържат 3 групи: фалшив плюс физиологичен разтвор (фалшива група); LAD лигиране плюс физиологичен разтвор (HF група); LAD лигиране плюс еналаприл (HF плюс ACEI група). Плъховете са подложени на съответните операции, с изключение на това, че плъховете от HF плюс ACEI групата са хранени орално с 20 mg/kg еналаприл.

Ехокардиографски измервания

Сърдечните функции бяха оценени чрез трансторакална ехокардиография, използваща ултразвукова система за изображения (Vevo 2100, Visual Sonics Inc., Торонто, Канада), както беше съобщено по-рано в нашата група (Fo et al.2020). Вътрешният размер на лявата камера в краен диастоличен стадий (LVIDd) и краен систоличен стадий (LVIDs), крайният систолен и краен диастоличен обем на лявата камера (LVESV и LVEDV) бяха записани чрез двуизмерни ехокардиограми в М-режим за най-малко 3 последователни цикли за всеки плъх. Впоследствие бяха изчислени левокамерната фракция на изтласкване (LVEF) и фракционното скъсяване (FS), които отразяват систолната функция.

приготвяне на пробата

След прилагане на Pino и ехокардиографски тестове, плъховете бяха анестезирани отново. Повече от 2 ml венозна кръв се улавят от опашната вена във вакуумни епруветки за събиране на кръв, съдържащи етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA), с последователно центрофугиране при скорост 3000 r/min за 15 минути и при температура 4 градуса C, последвано от изолиране на серумен супернатант и консервиране при -80 "C. След това сърцата бяха бързо събрани. Част от граничната зона на инфаркта на всяко сърце беше отрязана и замразена в течен азот за Western blot анализ, като другата сърдечна тъкан беше фиксирана в 4 процент параформалдехид за повече от 24 часа.

Оцветяването на Masson

Извършихме оцветяване на Masson, за да открием отлагането на колаген в граничната зона на инфаркта. Фиксирани с параформалдехид вентрикули бяха вградени в парафин и след това нарязани на 5- μm секции. Впоследствие срезовете бяха оцветени с трихром на Masson, където колагенът беше оцветен в синьо, миокардът в розово и ядрото в черно. Пропорцията на отлагане на колаген се изчислява от софтуера Image J (NIH, Bethesda, MD) при × 200 увеличение.

Имунохистохимичен анализ

Беше извършен имунохистохимичен анализ, за ​​да се оцени плътността на рецептора на васкуларен ендотелен растежен фактор 2 (VEGFR2), чиято регулация насърчава ангиогенезата, която е благотворна и важна за отслабването на ремоделирането (Rengo et al. 2013). Вентрикуларните срезове се произвеждат като тези, проведени при оцветяване по Masson, последвано от депарафинизиране и рехидратиране. След това срезовете получиха топлинно медиирано антигенно извличане и бяха третирани с 3 процента Н, О, за блокиране на ендогенна пероксидаза, с инкубиране на 1 ug/mL VEGFR2 антитяло (Abcam, ab9530) за 12 часа при 4 градуса изпълнено. След това срезовете се инкубират с белязано с пероксидаза от хрян (HRP) вторично антитяло (1:200, услуга, G1213) в продължение на 50 минути при 37 градуса. В допълнение, 3,3'-диаминобензидин се използва за развитие на положително оцветяване, което е показано в жълтокафяво. Накрая, средната оптична плътност на VEGFR2 беше анализирана и изчислена от софтуера Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, САЩ).

Терминално-дезоксинуклеотидил трансфераза-медиирано маркиране в крайния край (TUNEL) анализ

Впоследствие апоптозата беше открита чрез теста TUNEL. Преди това произведени парафинови маси, които вграждат вентрикуларна тъкан, бяха нарязани на други резени за TUNEL анализ, последвано от TUNEL оцветяване съгласно инструкциите на производителя на търговския комплект за анализ (Roche, Швейцария; 11684817910). Накратко, вентрикуларните срезове бяха изложени на TUNEL реагент, където TdT и dUTP бяха смесени в съотношение 1:9, за 1 час при стайна температура, след инкубиране на протеиназа К и разкъсване на клетъчната мембрана. Накрая, флуоресцентните изображения се наблюдават при дължина на вълната от 530 nm, която се задейства от дължина на вълната на излъчване от 450 nm (×400 увеличение). Скоростта на апоптоза на вентрикуларните тъкани във всяка група беше анализирана и изчислена от Image Software.

Western blot

Ние прилагаме Western blot, за да изясним основните механизми, чрез които Pino подобрява PIHF. Процедурите за извличане и приготвяне на протеинова проба наподобяват тези, докладвани по-рано в нашето проучване (Chen et al.2020a). Мембраните бяха изследвани с антитела срещу еритроидния фактор 2-свързан фактор 2 (Nrf2), хем оксигеназа{{ 4}}(HO-1;1:2000, Abcam, ab189491),p53(1:1000,технология за клетъчно сигнализиране,2524S), BCL-2 (1:1000, технология за клетъчно сигнализиране,2870P) ,bax (1:1000, Abcam, ab32503), разцепена каспаза-3(1:1000, клетъчна сигнална технология, 9664 T), колаген I (1:1000, афинитет, AF7001), глицералдехид-3- фосфат дехидрогеназа (GAPDH, Service, GB12002), с последваща визуализация чрез HRP-белязани вторични антитела (Service, G1213 и G1214) и реагенти за откриване на хемилуминесценция. Блот изображенията накрая бяха анализирани и количествено определени от софтуера Image J.

Култивиране на H9c2 кардиомиоцити и изхвърляне in vitro Кардиомиоцити H9c2, получени от вентрикуларно сърце на плъх, които бяха закупени от American Type Culture Collection (CRL-1446), бяха култивирани за допълнителна проверка на ефектите, упражнявани от Pino in vitro. H9c2 кардиомиоцити се култивират в модифицирана среда на Eagle на Dulbecco (DMEM)/F12 среда, която съдържа 10 процента фетален говежди серум (Sijiqing, Hangzhou, Китай) при температура от 37 градуса и атмосфера от 95 процента въздух и 5 процента CO. Клетките бяха посяти в 6-плаки с ямки след нарастване до 90 процента, в допълнение, серумна среда, съдържаща 25 uM изопреналин (ISO), впоследствие беше заменена с нормална среда в 3 ямки, за да се инкубират клетките в продължение на 48 часа, за да се имитира HF състояние, тъй като HF също се характеризира със свръхактивиране на симпатиковия тонус и стимулиране на -адренергичния рецептор генерира ROS (Velusamy et al. 2020). След това клетките бяха разделени на 6 групи: (i) контролна група; (ii) контролна среда, добавена с 25 μM Pino за 4 часа (контрола плюс Pino група); （i） контролна среда, съвместно инкубирана с 25 μM Pino и 5 μM ML385 за 4 часа (Nrf2 инхибитор; MCE, Ню Джърси, САЩ) (контрола плюс Pino плюс ML385 група); (iv) ISO група; v. ISO среда с 4-h инкубиране с 25 μM Pino (ISO плюс Pino група); vi. ISO плюс 25 μM Pino плюс 5 μM ML385 група. Концентрацията и инкубационното време на лекарствата се отнасят до предишни проучвания или инструкциите (Jin et al.2015; Oliveira et al.2017).

Тест за култура и пролиферация на сърдечни миофибробласти на новородени плъхове

Сърдечните миофибробласти (CMFs) на новородени плъхове се култивират, за да се изследват ефектите на Pino върху секрецията на колаген. CMF бяха разделени чрез използване на неонатални плъхове на възраст 3 дни, позовавайки се на демонстрирани по-рано методи (Cui et al. 2021). Изолираните и смлени сърца се усвояват с 0.125 процента трипсин, последван от коктейл, съдържащ 0.25 процента трипсин и 0,08 процента колагеназа няколко пъти, с центрофугиране и трансплантация в петриево блюдо, впоследствие извършено за събиране на клетки от супернатанта. След това средата беше заменена със серумна среда, подобна на тази, използвана за H9c2 кардиомиоцитна култура след адхезия от 90 минути. CMF получиха идентично изхвърляне като тези на H9c2 кардиомиоцити. Ние също въведохме анализ на комплект за броене на клетки-8(CCK-8) (Dojindo, Япония), за да открием пролиферацията на CMFs при достигане на плътност от 1,5 × 10 градуса във всяка ямка, като използвахме четец на микроплаки при дължина на вълната 450 nm, където по-висока стойност показва повишена пролиферативна активност.

ROS откриване

Способността на Pino да изчиства ROS беше измерена чрез флуоресцентна сонда дихидроетидий (DHE; Beyotime, Шанхай, Китай). DHL, който се разтваря в DMSO, се разрежда до 5 μM за замразени срезове или се добавя към серумната среда, за да се разреди до същата концентрация в съответствие с инструкциите. Фиксираните с параформалдехид сърца бяха замразени, последвани от нарязване на секции до 4- μm. Срезовете или H9c2 кардиомиоцитите се инкубират съвместно с DHE разтвор за 30 минути при температура от 37 градуса, изобразени след това с обърнат флуоресцентен микроскоп (IX70; Olympus, Токио, Япония). Накратко, ядрото, което беше пълно с ДНК и РНК, беше боядисано в отчетливо червено поради афинитета между нуклеиновата киселина и DHE. В допълнение, по-силният интензитет на флуоресценция показва повече натрупване на ROS.

Биохимични изследвания

Бяха проведени биохимични изследвания, за да се изследват промените в серумния BNP, SOD и малондиалдехид (MDA) в серума и клетъчния супернатант, което показва HF фенотип и съответно оксидантната защита. Концентрацията се измерва чрез използване на съответните комплекти за биохимичен анализ съгласно инструкциите на производителя (Jiancheng, Nanjing, Китай).

Тази статия е извлечена от Chen et al. Mol Med (2021) 27:100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7