Поли- и олигозахарид Ulva Sp. Фракции от ензимно-подпомогната екстракция модулират метаболизма на извънклетъчния матрикс

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:Ulva sp. е известно, че е източник на биоактивни съединения като vans, но тяхната биологична активност върху човешката дермална фибробластна извънклетъчна матрица (ECM) е слабо докладвана. В тази работа регулацията на ЕСМ е изследвана за първи път както на протеомни, така и на транскриптомни нива в нормални дермални фибробласти на човешка кожа, след 48 часа инкубация с поли- и олигозахаридни фракции от Ulva sp. получен след ензимно-асистирана екстракция и деполимеризация. Повишаване на клетъчната пролиферация (до плюс 68 процента) без проявяване на цитотоксичен ефект върху фибробластите беше демонстрирано при 50 и 1000 ug/mL от двете фракции. На протеомно ниво, полизахаридните фракции при 1000 ug/mL повишават най-много синтеза на гликозаминогликани (GAGs, до плюс 57 процента), общия колаген, особено типове I (до плюс 217 процента) и Ⅲ, както и синтеза и активност на MMP-1 (матрична металопротеиназа-1, до плюс 309 процента). За разлика от това, олигозахаридните фракции нямат ефект върху синтеза на GAGs, но показват прилики за регулиране на колагени и MMP-1.пуритански витамин cНа транскриптомно ниво, намаляването на експресията на COL1A1 и COL1A2 и увеличаването на експресията на COL3A1 и MMP-1 потвърждават модулирането на метаболизма на ECM от двете фракции. Нашето изследване подчертава, че поли- и олигозахаридът Ulva sp. фракциите показват интересни биологични активности и подкрепят потенциалната им употреба в областта на обновяването на кожата за дермо-козметични приложения против стареене.

моля, щракнете тук, за да научите повече

Ключови думи:колаген; извънклетъчен матрикс; човешки дермален фибробласт; матрична металопротеиназа; морски водорасли; Ulva sp.

1. Въведение

Мащабни зелени приливи, причинени от Uloa sp. се повтарят в Бретан (Франция) поради морската еутрофикация. Засядането на зелени водорасли има дълбоки неблагоприятни екологични въздействия, включително промяна на структурата на екосистемата, намаляване на местното биоразнообразие и икономически загуби [1, 2]. С изключение на използването като поправка на почвата, храна за животни или просто разграждане чрез гниене или изгаряне от събития на засядане, много малко се знае за валоризацията на Uloa sp. в човешкото здраве [1]. Въпреки това Ulloa sp. е важен източник на съединения като улвани. Evans, водоразтворимите сулфатирани полизахариди на клетъчната стена, съставени главно от рамноза, уронови киселини и ксилоза, могат да представляват до 36 процента от сухото тегло на Ulloa [3]. Двете основни повтарящи се дизахаридни единици на ulvan са алдобиуронови киселини (улванобиуронови киселини), тип A: -D-глюкуронова киселина (1,4)-свързана с -L-рамноза 3-сулфат, и тип B: -L- идуронова киселина (1,4)-свързана с -L-рамноза 3-сулфат. Незначителните дизахариди алдози, наричани улванобиози (тип U), също могат да бъдат намерени в улван [3.4]. Екстракцията на улван по отношение на количествен добив и качество може да варира значително в зависимост от методите на екстракция и фракциониране, приложени към биомасата. Улваните обикновено се извличат във воден разтвор при високи температури (80-90 градуса), наричан процес на накисване. Въпреки това, Evans може да бъде възстановен чрез нова зелена технология, наречена ензимно-подпомогната екстракция (EAE) [5]. EAE позволява екстракцията на интересуващите ни съединения без използване на денатуриращи условия като разтворители или високи температури на екстракция и показва различни предимства, като например висока каталитична ефективност, висока специфичност, леки реакционни условия и запазване на биологичните активности на съединенията. EAE също така подобрява добива и намалява разходите и консумацията на енергия в сравнение с класическия процес на накисване [6-9]. След водна екстракция от мацерация или нов процес като ЕАЕ, улвановото обогатяване често се извършва чрез процедура на утаяване с етанол [3]. Ulvans са демонстрирали in vitro и in vivo няколко биологични активности като имуномодулация, антиоксидант, противоракови, антикоагуланти, антихиперлипидемични или антивирусни [3,5,10-14].систанчеСтруктурната характеристика на Evans (степен на сулфатиране, модел на сулфатиране, състав на монозахариди, гликозидни връзки, степен на разклоняване, както и молекулно тегло) оказва влияние върху неговата биологична активност [3]

Стареенето на кожата е сложен процес с два допълващи се процеса: вътрешен (генетичен, клетъчен метаболизъм и т.н.) и външен (излагане на UV лъчи, замърсяване, тютюнопушене и т.н.)[15-17]

Cistanche може да спре стареенето

Използването на биоактивни вещества от морски водорасли като източници на продукти с висока добавена стойност за дермо-козметичната индустрия се появи наскоро. Сред тези биоактивни съединения улваните имат висок потенциал. Наистина, потребителското търсене на натурални продукти нараства през последните години, което прави морските продукти и особено водораслите интересен източник на естествени съставки, насочени към красотата и здравето на кожата [18-22]. Кожата, целта на козметичните продукти, е изградена от три основни различни припокриващи се слоя: епидермис, дерма и хиподерма.какво е цистанчеДермата поддържа епидермиса и съдържа важни кожни клетки, известни като фибробласти. Фибробластите, основните клетки на папиларната дерма, намиращи се точно под епидермиса, по същество синтезират и организират извънклетъчния матрикс (ECM). ECM се състои от различни макромолекули, включително колагени (70 процента от сухото тегло) главно тип I и III, еластин (2-4 процента), гликопротеини (фибронектин, ламинин и т.н.), гликозаминогликани (GAG), или сулфатирани (хепаран сулфат, дерматан сулфат, кератан сулфат, хондроитин сулфат) и несулфатирани (хиалуронова киселина), протеогликани и разграждащи компоненти като ММР (матрични металопротеинази)[23,24]. Колаген тип I представлява до 80 процента от общия колаген [25] и е една от основните съставки на ECM на дермата на кожата; той участва в еластичността, гъвкавостта и напрежението на кожата. Колаген тип I е хетеротример, протеин с тройна спирала, съставен от две cl вериги и една с2 верига, съответно кодирани от COL1Al и COL1A2 гени [26]. Фибриларните колагени тип I и II представляват над 90 процента от общия колаген и са тясно свързани в кожата [27,28]. Колаген тип II е по-разпространен в младата кожа, отколкото в стареещата кожа и участва особено в заздравяването на рани [29,30]. За да се установи молекулярна мрежа за сглобяване на ЕСМ, GAGs се свързват с протеини и образуват протеогликани (напр. декорин или версикан), които взаимодействат с колаген тип I [31] В рамките на ЕСМ, ММР, които са ензими на катаболитния път на ЕСМ, са свързани, в латентна или активна форма, с техния тъканен инхибитор на металопротеинази, известни като TIMP, които регулират тяхната активност [32]. MMP-1(колагеназа-1) е основният ензим, отговорен за разграждането на колаген тип I, а TIMP-1 е негов съответен инхибитор [334]. Фибробластите са ключови регулатори на ECM хомеостазата. Балансът и свързването на синтеза между компонентите на ECM на кожата, участващи в анаболизма, като колагени тип I и II, GAG или TIMP, и в катаболизма, като MMP, позволява обновяването и продължаващото ремоделиране на този ECM [25]. При стареене на кожата , основната последица е дисбаланс на регулацията на ЕСМ с намаляване на пролиферацията на фибробластите, модулиране на нивата на компонентите на ЕСМ със значително намаляване на синтеза на колаген тип I, секрецията на GAGs и синтеза на TIMP-1 и увеличаването на MMP-1 ниво [24,35].

Засега само няколко проучвания са изследвали ефекта на Ulva sp. фракции върху метаболизма на фибробластните кожни клетки както на протеомно, така и на транскриптомно ниво[36-39]и до момента не е проведено пълно проучване на протеомно и транскриптомно ниво върху Ulua поли- и олигозахаридни фракции, получени от ЕАЕ процеса.Цистанче против стареенеВ тази перспектива това проучване изследва in vitro ефектите на поли- и олигозахаридните фракции от Ulva sp. получени от нова зелена технология EAE върху метаболизма на човешки дермални фибробласти. Техните ефекти върху пролиферацията и жизнеспособността на фибробластите, както и върху ECM анаболизма и катаболизма на протеомни и транскриптомни нива бяха изследвани, за да се подчертае техният потенциал в грижата за кожата (напр. против стареене).

2. Резултати

2.1. Поли- и олигозахаридни фракции на Ulva sp.

от EAE показват различен биохимичен състав и разпределение на молекулното тегло

Механизмите на производство на поли- и олигозахаридни фракции са описани подробно в раздела Материали и методи: "4.2 Производство и характеризиране на поли- и олигозахаридни фракции". Предишни подробни анализи на биохимични характеристики (въглехидрати, уронови киселини, сулфатни групи и протеини) и молекулярни тегловно разпределение на поли- и олигозахаридните фракции от Ulloa sp. получени от EAE [36]. Данните са комбинирани в таблица 1.

Накратко, полизахаридните фракции на суровите улвани (UE) и диализираните улвани (DS-UE) са съставени от улвани с високо молекулно тегло (сурови вани) с 23.5-37.4 процента въглехидрати,18.5-37. 0 процента уронова киселина, 29.9-49.1 процента сулфатни групи и 10.5-12.8 процента протеини. Съставът на въглехидратите е главно рамноза (50 процента) и глюкуронова киселина (11 процента). Фракцията DS-UE е значително по-богата на улвани от фракцията UE. Олигозахаридните фракции, деполимеризирани ванове от HzO2 (DEP-HD PP-UE) и деполимеризирани ванове от смола Amberlite (DEP-AD PP-UE), са съставени от ванове с ниско молекулно тегло с 24.4-30.4 процента въглехидрати ( рамноза 44.9-55.4 процента и глюкуронова киселина 7.5-11.0 процента ), 21.6-30.8 процента уронова киселина и 12.8-16.8 процента протеини.

Процесът на деполимеризация обаче доведе до частична загуба на сулфати (неоткрита в DEP-ADPP-и само 6,6 процента в DEP-HD PP-UE). Разпределението на молекулното тегло (Mw) на олигозахаридните фракции показва средно ниско Mw от 8 kDa за DEP-HD PP-UE и по-ниско за DEP-AD PP-U с 1,5 kDa.

2.2. Поли- и олигозахаридни фракции на Ulva sp. Стимулират метаболитната активност, но не влияят върху жизнеспособността на фибробластите

Метаболитната активност на нормални човешки дермални фибробласти (NHDF), 48 часа изложени на поли- и олигозахарид Ulloa фракции（50 и 100 ug/mL за 48 часа）, беше оценена чрез WST-1 (Фигура 1). В тези експерименти (n=9) ​​фракциите Ullva от EAE повишават пролиферацията на фибробласти до плюс 68 процента в сравнение с контролата.cistanche benefíciosЗначително повишаване на метаболитната активност (стр<0.001)were observed="" for="" both="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 50="" and="" 1000="" ug/ml.="" oligosaccharide="" fractions="" exhibited="" a="" higher="" and="" more="" significant="" rise="" of="" metabolic="" activity="" at="" 100="" ug/ml="" (p=""><0.001) than="" at="" 50="" ug/ml(no="" significance="" for="" dep-hd="" pp-ue="" and="" lower="" significance,=""><0.05, for="" dep-ad="">

За да се определи дали тези ефекти са свързани с липса на клетъчна токсичност, жизнеспособността на клетките, третирани с екстракт от Ulou, беше оценена чрез измерване на освобождаването на LDH (лактат дехидрогеназа), използвайки CytoTox96 градусов анализ след 48 часа инкубация (n=3) (Фигура 2). Анализът за цитотоксичност показа, че всички фракции не показват значителна цитотоксичност в сравнение с контролата.

2.3. Поли- и олигозахаридни фракции на Ulva sp. Стимулиране на извънклетъчния матричен метаболизъм във фибробластите

Ефектът на поли- и олигозахаридните Ulloa фракции върху синтеза на фибробластни сулфатирани и несулфатирани гликозаминогликани (GAG) беше оценен с оцветяване с Alcian blue след 48 часа инкубация (n=4) (Фигура 3). Значителни увеличения на синтеза се наблюдават само за UE и DS-UE при 100 ug/mL, като се имат предвид и двата сулфатирани (p<0.01,+39% and="" +51%,respectively)="" and="" non-sulfated="" gags=""><0.05,+44% and="" +57%="">

Интересно е да се отбележи, че DS-UE, най-богатата улванска фракция, подобрява синтеза на GAGs най-много. При 50 ug/mL, UE и DS-UE повишават синтеза на несулфатирани GAG, но не значително (плюс 14,2 процента и плюс 22,7 процента съответно). Олигозахаридните фракции DEP-AD PP-UE при 1000 ug/mL леко намаляват синтеза на несулфатирани GAG, но не значително (-3 процента), а DEP-HD PP-UE леко повишават, но не значително синтеза на GAG при 100 ug/ mL (плюс 4,1 процента за сулфатиран и плюс 10,9 процента за несулфатиран).

Общият синтез на колаген (Фигура 4) беше оценен чрез анализ на Red Sirius след 48-часово излагане на фибробластите на поли- и олигозахарид Ulloa фракции（n=7 при 100 ug/mL и n=6 при 50 ug/mL） .

Всички фракции демонстрират зависимо от концентрацията увеличение на синтеза на колаген. Маргинален и незначителен спад на синтеза на колаген беше отбелязан за всички фракции при 50 ug/mL в сравнение с контролата. За разлика от това, при 1000 ug/mL, всички фракции повишиха общия синтез на колаген и по значителен начин за UE (плюс 22 процента, p<><0.01),and dep-hd=""><>

Ефектът на получената от поли- и олигозахарид EAE фракция върху синтеза на колаген тип I (n=6) и синтеза на MMP-1 (n=4) беше оценен с ELISA анализи (Фигура 5).

Всички фракции подобряват синтеза на колаген тип I и синтеза на MP-1, но не винаги значително. Увеличаването на синтеза на колаген тип I зависи от концентрацията. Установено е, че полизахаридните фракции, UE и DS-UE, при 1000 ug/mL значително （p<05）increase type="" i="" collagen="" synthesis="" (+122%,="" and="" +217%="" respectively)="" and="" mmp-1="" synthesis="" (+309%="" and="" +169%="">

Ефектите на поли- и олигозахаридните Ulloa фракции при 100 ug/mL, след 48 часа експозиция на фибробластите, върху синтеза на тип I(n=5) и тип 3(n=4)колагени, върху продукцията на MMP-1(n=6) и TIMP-1(n{=5) ​​бяха оценени чрез Western blot (WB) анализ с метод на нормализиране, като се използва методът на общия протеин на лентата ( Фигура 6).

На Фигура 6a, e и WB подчертаха съответно увеличение на синтеза на зрял колаген тип I （≈130 kDa） и зрял колаген тип III （≈190 kDa） за всички фракции. Количественото определяне на протеини във Фигура 6с на колаген тип I и Фигура 6g на колаген тип III разкри NS (нестатистически значимо) увеличение на техния синтез в присъствието както на поли-, така и на олигозахариди Ulloa sp. дроби. Междувременно WB на Фигура 6b,d ни позволи да определим количествено значително （p<05）increase of="" mmp-1="" production="" （≈50kda）for="" polysaccharide="" fractions="" and="" not="" significant="" for="" oligosaccharide="" ulloa="" eae-derived="" fractions="" dep-ad="" pp.="" ue="" and="" dep-hd="" pp-ue.="" wb="" quantification="" of="" timp-1="" production="" （≈20kda）,="" available="" in="" figure="" 6f,h,="" showed="" only="" a="" significant="" increase="" in="" presence="" of="" the="" dep-hd="" pp-ue="" fraction=""><0.05), while="" other="" fractions="" had="" no="" significant="">

MMP-1 колагеназната активност се определя чрез зимографски анализ в присъствието на поли- и олигозахарид Ulloa фракции при 100 ug/mL （Фигура 7a）, определя се количествено и се сравнява с контролата (Фигура 7b), след 48 часа експозиция на фибробласти (n =4).

Резултатите показват, че както поли-, така и олигозахаридът Ulva sp. фракции повишават незначително MMP-1 активността на фибробластите.

2.4. Поли- и олигозахаридни фракции на Ulva sp. Диференциално модулиране на ECM генна експресия на фибробласти

Ефектът на фракциите, получени от поли- и олигозахарид Ulloa EAE, е изследван върху стационарните нива на иРНК на няколко компонента на извънклетъчната матрица (COL1A1, COL1A2, COL3A1, MMP-1 и TIMP-1)(n =4)(Фигура 8).

Забелязахме, че всички фракции при 1000 ug/mL намаляват значително (стр<0.01 and=""><05)col1a1 mrna="" steady-state="" levels="" (figure="" 8a).="" in="" contrast,="" we="" noted="" that="" all="" fractions="" increased="" mmp-1="" mrna="" level="" expression="" significantly="" (p="" <="" 0.05)="" for="" ue="" at="" both="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml="" only="" (figure="" 8c).="" timp-1="" mrna="" steady-state="" level="" was="" not="" significantly="" changed,="" but="" dep-hd="" pp-ue="" and="" dep-ad="" pp-ue="" reduced="" it="" not="" significantly="" at="" 50="" ug/ml="" (figure="" 8e).="" the="" col1a2="" mrna="" steady-state="" level="" (figure="" 8b)="" is="" enhanced="" (ns)="" for="" both="" ue="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml.="" however,="" it="" is="" lower="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" ds-ue="" (ns),="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue="" (only="" significant="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" the=""><0.05). polysaccharide="" fractions,="" ue="" and="" ds-ue,="" raised="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" significantly=""><0.05) at="" 1000="" ug/ml="" and="" at="" 50="" ug/ml="" for="" ue="" (ns="" for="" ds-ue)(figure="" 8d).="" oligosaccharide="" fractions,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" at="" 1000="" ug/ml="" raised="" not="" significantly="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" and="" reduced="" it="" at="" 50="" μg/ml（significant="" only="" for="" dep-ad=""><>

Таблица 2 показва комбинираните резултати за нивото на стационарно състояние на генна иРНК след излагане на фибробласти на фракции при 1000 ug/mL.

Таблица 2 показва, че UE е намаляло значително (стр<0.01)col1al and="" increased="" signifi-cantly=""><0.05) mmp-1="" and="" col3a1,="" and="" not="" significantly="" col1a2mrna="" steady-state="" levels.="" for="" ds-ue,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" similar="" mrna="" steady-state="" levels="" with="" a="" decrease="" in="" col1a1=""><0.01), in="" col1a2(only="" significant=""><0.05 for="" dep-ad="" pp-ue),="" increase="" in="" col3a1="" (only="" significant=""><0.05 for="" ds-ue),="" increase="" in="" mmp-1(ns),="" and="" no="" significant="" change="" in="" timp-1="" mrna="" expression="" were="">

Тази статия Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs