Екстрактът от свинска плацента повишава клетъчните нива на NAD в човешки епидермални кератиноцити

Най-добрите билки против стареене - билкова цистанче

Никотинамид аденин динуклеотид(NAD) е класически кофактор за много редокс реакции и присъства във всички живи клетки в окислени (NAD плюс) и редуцирани (NADH) форми. NAD plus е известен също като основен ко-субстрат за ензими, консумиращи NAD plus, като сиртуин (SIRT) и поли ADP-рибоза полимераза (PARP). Тъй като тези ензими играят централна роля в различни биологични процеси, включително възстановяване на ДНК, митохондриален метаболизъм и устойчивост на стрес, небалансираната хомеостаза на NAD засяга техните основни процеси1. Нивата на NAD в тъканите/органите намаляват с възрастта, което води до дисбалансирана хомеостаза на NAD2-6. Следователно сега има консенсус, че поддържането на нивата на NAD води до превенция и лечение на стареенето и свързаните с възрастта заболявания7. NAD се биосинтезира чрез различни пътища, включително de novo биосинтеза от триптофан, пътят на Preiss–Handler от никотинова киселина и пътят на спасяване от никотинамид (NAM)8. При бозайниците спасителният път е основният път за поддържане на клетъчните нива на NAD9. По този път NAM се превръща в никотинамид мононуклеотид (NMN) от NAM фосфорибозилтрансфераза (NAMPT) и след това се превръща в NAD от NMN аденилилтрансферази. Никотинамид рибозид (NR) се превръща в NMN от NR кинази и след това се интегрира в спасителния път. Доказано е, че междинните метаболити на NAD, като NMN и NR, повишават нивата на NAD в различни клетки и тъкани и подобряват свързаните с възрастта заболявания 10,11.

Екстрактът от плацента (PE) се използва широко в традиционната медицина за заздравяване на рани. PE е богат източник на множество биоактивни компоненти, включително аминокиселини, нуклеинови киселини, мастни киселини, минерали, витамини, хормони, биоактивни пептиди, цитокини и растежни фактори. Известно е, че има различни фармакологични действия, като противовъзпалителни, антиоксидантни, регенеративни и имуномодулиращи ефекти12. По този начин, подкожни и интрамускулни инжекции на човешки PE (HPE) са клинично използвани за лечение на няколко заболявания, включително симптоми на менопауза и хронично чернодробно заболяване13. Освен това HPE се използва клинично като средство против бръчки главно в азиатските страни поради ефектите си върху клетъчния растеж и синтеза на колаген14. Тъй като използването на HPE е ограничено до медицински приложения в някои страни като Япония, наскоро беше разработен свински PE (PPE) като алтернатива на HPE и се използва като сурова съставка в здравословни храни и козметика. Проучване in vivo, използващо модел на контактен дерматит при мишка, показа, че ЛПС за локално приложение има противовъзпалителни и антиоксидантни ефекти върху кожата15. Клиничните проучвания съобщават, че локалните ЛПС са полезни за лечение на хронични незаздравяващи рани и за предотвратяване на образуването на бръчки16,17. Освен това е проведено рандомизирано, двойно-сляпо, плацебо-контролирано клинично изпитване при здрави възрастни жени, за да се потвърдят ползите за кожата от пероралното поглъщане на ЛПС и е показано, че състоянието на кожата на групата, приемаща ЛПС, е значително подобрено18. Тези доклади подкрепят концепцията, че лечението с ЛПС може да облекчи или предотврати стареенето на кожата.

PE е конвенционално използван катосредство против стареене, и многобройни клинични проучвания са го установилисвойства против стареене. Въпреки това, механизмът, който стои в основата на анти-стареещите ефекти на PE, остава неясен. Този доклад показа, че PPE съдържа няколко прекурсори на NAD, като NMN и NR, и повишава вътреклетъчните нива на NAD в нормалните човешки епидермални кератиноцити (NHEK). Нашите открития предоставят нови прозрения за механизма, чрез който PE упражнява своите ефекти против стареене, като поддържа вътреклетъчната хомеостаза на NAD.

Резултати

PPE повишава вътреклетъчните нива на NAD. За да изследваме дали PPE променя клетъчните NAD състояния, ние култивирахме NHEKs в среда, допълнена с PPE, и количествено определихме техните вътреклетъчни нива на NAD плюс и NADH. Резултатите показват, че PPE значително увеличава количеството както на NAD плюс, така и на NADH в NHEKs в зависимост от дозата (фиг. 1A). Общото ниво на NAD (NAD плюс плюс NADH) на клетките, третирани с 1 mg/mL PPE, е приблизително 1,5 пъти по-високо от това на нетретираните клетки (Фиг. 1A). В допълнение, в експеримент с времеви курс, значително повишаване на нивата на NAD плюс, NADH и общия NAD се наблюдава след 4 часа лечение с 1 mg/mL PPE (фиг. 1B). Анализът на {{10}}(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT) потвърди, че {{20} }.5–2 mg/mL PPE няма ефект върху клетъчната метаболитна активност, докато 5 mg/mL PPE или положителната контрола (0,2 процента Triton X-100 [TX-100]) показват значителна клетъчна токсичност (Фиг. 1C). Тъй като NAD почти не се открива в самото PPE (данните не са показани), ефектът на PPE, произвеждащ NAD, изглежда не се дължи на притока на NAD, получен от PPE, в NHEKs. По този начин тези резултати предполагат, че PPE може да повиши вътреклетъчните нива на NAD. Активните съставки на ЛПС са малки молекули, а не протеини. За да определим дали PPE повишава клетъчната биосинтеза на NAD чрез NAMPT реакцията в пътя на спасяване на NAD, ние извършихме анализ за възстановяване на NAD, използвайки NAMPT инхибитора FK866 (Фиг. 2A). FK866 значително намалява общите нива на NAD 24 часа след добавянето (фиг. 2B).

Интересно е, че въпреки липсата на активност на NAMPT в рамките на NHEKs, PPE потиска индуцираното от FK{{0}} изчерпване на NAD по дозозависим начин (фиг. 2B). Много доклади показват, че PE съдържа протеини като цитокини и растежни фактори13,19,20. Следователно, ние предположихме, че някои биоактивни протеини или свински NAMPT, съдържащи се в PPE, могат да подобрят вътреклетъчната биосинтеза на NAD в NHEKs. За да потвърдим нашата хипотеза, ние разделихме ЛПС на фракции с високо и ниско молекулно тегло (HMW, LMW), използвайки центробежен филтър (гранична стойност: 3 kDa). Тъй като анализът за възстановяване на NAD с помощта на FK866 показа ефекта на PPE върху биосинтезата на NAD по-ясно, отколкото в отсъствието на FK866 (Фигури 1A и 2B), ние продължихме да идентифицираме активните съставки в PPE използвайки този анализ. Неочаквано, HMW-PPE изисква висока концентрация от 1 mg/mL за значително възстановяване на нивата на NAD, докато LMW-PPE ясно подобрява FK866-индуцираното изчерпване на NAD дори при ниска концентрация от 0,25 mg/mL (фиг. 2C и D). По този начин тези резултати предполагат, че основните активни съставки в PPE са малки молекули с по-малко от 3 kDa, а не протеини като растежни фактори и цитокини.

PPE съдържа прекурсори на NAD, като NMN и NR. Допълнително фракционирахме LMW-PPE на 12 фракции, използвайки високоефективна течна хроматография с обърната фаза (HPLC) и изследвахме коя фракция е допринесла за възстановяването на FK866-индуцираното изчерпване на NAD. Типична HPLC хроматограма на LMW-PPE е показана на Фиг. 3A. Тестът за възстановяване на NAD показа, че само фракция 3 отчетливо повишава нивата на NAD в третираните с FK866- NHEKs (фиг. 3B). Прекурсорите на NAD, като NMN и NR, повишават вътреклетъчните нива на NAD без намеса на NAMPT в различни клетъчни линии, включително NHEKs10,21. Тъй като LMW-PPE все още увеличава съдържанието на NAD в NHEKs, дори когато NAMPT е инхибиран от FK866, ние предположихме, че прекурсорите на NAD, съдържащи се в PPE, повишават вътреклетъчното производство на NAD. За да тестваме тази хипотеза, ние анализирахме фракция 3, използвайки течна хроматография-тандемна масспектрометрия (LC-MS/MS), за да открием прекурсорите на NAD. Резултатите показват, че три йонни пика в съответствие с NMN (m/z 335→123), NR (m/z 255→123) и NAM (m/z 123→80) са открити във фракция 3 ( Фиг. 3C). Количествените анализи показват, че концентрацията на NMN, NR и NAM, съдържаща се в цялото PPE, е съответно 0,22, 17,62 и 0,14 ng/mg (Таблица 1). Тези резултати предполагат, че най-малко три прекурсора на NAD, NMN, NR и NAM, присъстват в PPE и участват във вътреклетъчното повишаване на NAD.

Фигура 2. PPE подобрява изчерпването на NAD от FK866 в NHEKs. (A) Пътят на спасяване на биосинтезата на NAD. Te NHEKs бяха предварително третирани с FK866 за 30 минути и инкубирани с цели PPE (B), HMW-PPE (C) или LMW-PPE (D) при посочените концентрации за 24 часа. Общите нива на NAD бяха определени с помощта на комплекта за анализ NAD плюс /NADH. †стр<0.05 and ††p<0.01, in comparison with the indicated groups.

Локалното приложение на PPE върху реконструиран човешки епидермис повишава нивата на NAD в тъканите. Основните активни съставки в ефекта на PPE, повишаващ NAD, са малки молекули, за които може да се очаква да имат по-висока трансдермална абсорбция от по-големите протеини, като растежни фактори. Следователно, локалното приложение на PPE върху кожата изглежда подходящ вариант за повишаване на нивата на NAD в кожните тъкани. За да се изследва дали локалното приложение на PPE засяга нивата на NAD в епидермиса под роговия слой, 3-измерният реконструиран човешки епидермис (RHE) се третира с PPE от страната на роговия слой и се култивира в среда с присъствие или отсъствие на FK 866 (фиг. 4A). Локалното приложение на PPE повишава нивата на NAD съответно с 9,1 процента (незначително) или 7,3 процента (значително) в отсъствие или присъствие на FK866 (фиг. 4B). PPE няма ефект върху клетъчната метаболитна активност при тестване до 10 mg/mL, докато 1 процент TX-100 значително намалява (фиг. 4C). Тези резултати предполагат, че активните съставки в PPE могат да проникнат в субкорнеалната кожа и да повишат нивата на NAD в кожата, без да причиняват вредни ефекти.

Питай за още:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/телефон: плюс 86 15292862950